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¿Puede la GFP desnaturalizada mostrar fluorescencia?

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GFP (proteína verde fluorescente) puede mostrar fluorescencia verde. Y su fluorescencia se debe al cromóforo tripéptido que se indica a continuación. Me preguntaba, ¿podemos observar la fluorescencia si la desnaturalizamos hirviéndola a 95 grados centígrados? ¿Podemos observar la banda de fluorescencia en SDS-PAGE?

Supongo que puede mostrar algo de fluorescencia, ya que no se debe a ningún cofactor, etc.


Según PDB (banco de datos de proteínas, un depósito de estructuras de proteínas), el cromóforo debe protegerse de la interacción con las moléculas de agua para que emitan fluorescencia.

El cromóforo se encuentra justo en el medio de la [proteína], totalmente protegido del entorno circundante. Este blindaje es esencial para la fluorescencia. Las moléculas de agua que se empujan normalmente robarían al cromóforo de su energía una vez que absorba un fotón. Pero dentro de la proteína, está protegida, liberando la energía como un fotón de luz ligeramente menos energético.

Esto significa que la desnaturalización de la proteína dará como resultado la extinción de la fluorescencia.1, por lo que es poco probable que vea una señal significativa en un gel desnaturalizante. De hecho, como ha señalado WYSIWYG, la fluorescencia se ha utilizado como marcador de renaturalización de GFP1.

Referencia:

1: R.Y. Tsien (1998) La proteína verde fluorescente. Revisión anual de bioquímica 67, 509-544.


Biología sintética: desarrollo de un nuevo tipo de proteína fluorescente

Las proteínas son las biomoléculas funcionales más importantes de la naturaleza con numerosas aplicaciones en la investigación de las ciencias de la vida, la biotecnología y la medicina. Entonces, ¿cómo se pueden modificar de la manera más efectiva para lograr ciertas propiedades deseadas? En el pasado, las modificaciones solían llevarse a cabo químicamente o mediante ingeniería genética.

El equipo del profesor Arne Skerra de la Cátedra TUM de Química Biológica ha desarrollado ahora una solución combinada más elegante: al extender el código genético universal, los científicos pueden coaccionar a las células bacterianas para que produzcan proteínas personalizadas con grupos funcionales sintéticos. Para poner su idea a prueba, se propusieron romper una nuez particularmente dura: los científicos querían incorporar un aminoácido no natural en un sitio específico en una proteína natural ampliamente utilizada.

En la investigación biológica, esta proteína se conoce comúnmente como "GFP" (= proteína verde fluorescente). Emite un brillo verde brillante y proviene originalmente de una medusa que usa la proteína para hacerse visible en la oscuridad de las profundidades marinas. El equipo eligió un pigmento cumarina lavanda pálido, que actúa como cadena lateral de un aminoácido no natural, como grupo sintético. Los científicos "alimentaron" este aminoácido artificial a un cultivo de laboratorio de la bacteria Escherichia coli, los microorganismos caballos de batalla de la ingeniería genética, cuyos hermanos naturales también se encuentran en el intestino humano. Dado que el equipo había transferido los planos genéticos modificados para la GFP a las bacterias, incluida la maquinaria de biosíntesis necesaria, incorporó el aminoácido cumarina en un sitio muy específico en la proteína fluorescente.

Este lugar en la GFP se eligió cuidadosamente, explica el profesor Skerra: "Colocamos el aminoácido sintético a una distancia muy cercana del centro de fluorescencia de la proteína natural". Los científicos emplearon el principio de la llamada transferencia de energía de resonancia de Foerster, o FRET para abreviar. En condiciones favorables, este proceso de transferencia de energía física, que lleva el nombre del químico físico alemán Theodor Foerster, permite que la energía se transmita de un pigmento estimulado a otro sin radiación.

Fue precisamente este efecto FRET que los científicos implementaron de manera muy elegante en la nueva proteína fluorescente. Definieron la distancia entre el pigmento químico importado y el pigmento biológico azul verdoso (cian, para ser más precisos) de la proteína de medusa de tal manera que la interacción entre los dos tintes dio como resultado un tipo completamente nuevo de biomolécula quimérica fluorescente. Debido a la extrema proximidad de los dos grupos luminiscentes, la lavanda pálida del aminoácido sintético ya no puede detectarse en su lugar, domina el típico color azul verdoso de la proteína fluorescente. "Lo que es especial aquí, y diferente de la GFP natural, es que, gracias al aminoácido incorporado sintéticamente, la fluorescencia se puede excitar con una lámpara de luz negra disponible comercialmente en lugar de un costoso aparato LASER dedicado", explica Sebastian Kuhn. , quien realizó estos innovadores experimentos como parte de su tesis doctoral.

Según Skerra, el principio de diseño de la nueva biomolécula, que se caracteriza por una diferencia de longitud de onda particularmente grande y difícil de lograr entre la excitación y la luz emitida, debería abrir numerosas aplicaciones interesantes: "Ahora hemos demostrado que la tecnología funciona. Nuestro La estrategia permitirá la preparación de proteínas fluorescentes personalizadas en varios colores para múltiples propósitos futuros ". Este proyecto de investigación fue financiado por la Fundación de Investigación Alemana (DFG) como parte del Clúster de Excelencia "Centro de Múnich para la Ciencia Integrada de las Proteínas" (CIPS-M).


La enciclopedia del proyecto Embryo

La proteína verde fluorescente (GFP) es una proteína de las medusas. Aequorea Victoria que exhibe fluorescencia verde cuando se expone a la luz. La proteína tiene 238 aminoácidos, tres de ellos (números 65 a 67) forman una estructura que emite luz fluorescente verde visible. En las medusas, GFP interactúa con otra proteína, llamada aequorin, que emite luz azul cuando se agrega con calcio. Los biólogos usan GFP para estudiar células en embriones y fetos durante los procesos de desarrollo.

Los biólogos utilizan GFP como proteína marcadora. La GFP puede unirse y marcar otra proteína con fluorescencia, lo que permite a los científicos ver la presencia de la proteína en particular en una estructura orgánica. GFP se refiere al gen que produce la proteína verde fluorescente. Usando tecnología de ADN recombinante, los científicos combinan GFP gen a otro gen que produce una proteína que quieren estudiar, y luego insertan el complejo en una célula. Si la célula produce la fluorescencia verde, los científicos infieren que la célula también expresa el gen diana. Además, los científicos usan GFP para etiquetar orgánulos, células y tejidos específicos. Como el GFP gen es heredable, los descendientes de entidades marcadas también exhiben fluorescencia verde.

Edmund N. Harvey, profesor de la Universidad de Princeton en Princeton, Nueva Jersey, inició los estudios sobre bioluminiscencia en Estados Unidos. En 1921, Harvey describió los tejidos amarillos en el paraguas de las medusas como luminosos en condiciones particulares, como por la noche o cuando la medusa es estimulada con electricidad. En 1955, Demorest Davenport de la Universidad de California en Santa Bárbara en Santa Bárbara, California, y Joseph Nicol del Laboratorio Marino de Plymouth en Plymouth, Inglaterra, utilizaron métodos histológicos y de grabación fotoeléctrica para confirmar las descripciones de Harvey, e identificaron los materiales fluorescentes verdes en el canal marginal del paraguas.

En el mismo año, Osamu Shimomura se convirtió en asistente de investigación en la Universidad de Nagoya en Nagoya, Japón, y cristalizó la luciferina, un compuesto emisor de luz que se encuentra en la luciérnaga marina. Vargula hilgendorfii. Shimomura publicó sus resultados en 1957. Uno de los estudiantes de Harvey, Frank H. Johnson, estudió bioluminiscencia en la Universidad de Princeton. Johnson siguió el trabajo de Shimomura y lo invitó a trabajar en los EE. UU., Y en 1960 Shimomura recibió una beca de viaje Fulbright y comenzó a trabajar con Johnson. Poco después de que Shimomura llegara a los EE. UU., Johnson introdujo la bioluminiscencia de Aequorea Victoria a Shimomura. En los Estados Unidos, las medusas viven solo en la costa oeste, por lo que Shimomura viajó a los Laboratorios Friday Harbor de la Universidad de Washington en la isla San Juan, Washington, durante el verano de 1961. Después de capturar alrededor de 10,000 medusas, Shimomura tomó los extractos del medusa y la conservó en hielo seco para traerla de regreso a Princeton en septiembre de 1961.

En Princeton, Shimomura y sus colegas comenzaron a purificar la sustancia bioluminiscente y descubrieron que era una proteína, a la que llamaron aequorin. Cuando purificaron la aequorina, también descubrieron rastros de otra proteína, que mostraba fluorescencia verde. El equipo de Shimomura publicó los hallazgos en "Exracción, purificación y propiedades de la aequorina" en 1962. El artículo trataba sobre la aequorina, pero también describía una proteína verde, que exhibía fluorescencia verde bajo la luz del sol. John W. Hasting y James G. Morin, quienes más tarde investigaron la aequorina, denominaron a la proteína como proteína verde fluorescente en 1971.

Shimomura se centró en la aequorina, purificó la proteína, la cristalizó y esclareció su estructura subyacente. También estudió las propiedades de GFP y publicó su último artículo sobre GFP en 1979. En 1981, después de dejar la Universidad de Princeton para el Laboratorio de Biología Marina en Woods Hole, Massachusetts, Shimomura ya no investigó sobre GFP. De 1979 a 1992, muchos investigadores estudiaron varios aspectos de la GFP, incluido el uso de la resonancia magnética nuclear para estudiar los aminoácidos de la proteína, el uso de rayos X para estudiar su cristal y la evolución de la GFP.

A principios de la década de 1990, el biólogo molecular Douglas Prasher, del Laboratorio de Biología Marina, usó GFP para diseñar sondas, una tecnología que involucra fragmentos de ADN para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos. Prasher aisló el ADN complementario (ADNc) de GFP gen, y publicó la secuencia del gen en 1992. Después de la publicación de la secuencia de cDNA en 1992, la financiación de Prasher de la Sociedad Estadounidense del Cáncer en Atlanta, Georgia, expiró. Cuando solicitó fondos del Instituto Nacional de Salud de EE. UU. En Bethesda, Maryland, el revisor argumentó que la investigación de Prasher carecía de contribuciones a la sociedad. Como Prasher no pudo obtener fondos para seguir respaldando su investigación, dejó el Laboratorio de Biología Marina para trabajar para el Departamento de Agricultura de EE. UU. En Massachusetts.

Después de la publicación de Prasher en 1992, muchos científicos intentaron transferir y expresar la GFP gen en organismos distintos de las medusas utilizando tecnología de ADN recombinante, y Martin Chalfie fue el primero en lograrlo. Chalfie, profesor de la Universidad de Columbia en Nueva York, Nueva York, estudió el desarrollo del nematodo Caenorhabditis elegans. Chalfie escuchó sobre la proteína GFP en una conferencia y especuló que la GFP podría facilitar su estudio de la expresión génica en C. elegans. El equipo de Chalfie obtuvo el ADNc del gen GFP de Prasher e insertó solo la secuencia de codificación de GFP gen primero en la bacteria Escherichia coli, y luego en C. elegans. Chalfie y su equipo descubrieron que GFP gen producido GFP sin enzimas o sustratos añadidos en ambos organismos. En 1994, Chalfie publicó sus resultados en "Proteína fluorescente verde como marcador de expresión genética". La detección de GFP solo necesitó luz ultravioleta. A partir de entonces, muchos biólogos introdujeron GFP en sus experimentos para estudiar la expresión génica. Satoshi Inouye y Frederick Tsuji de la Universidad de Princeton también expresaron GFP en E. coli en 1994.

Muchos científicos intentaron mutar el GFP gen para hacer que la proteína resultante reaccione a longitudes de onda más amplias y emane diferentes colores. Otros científicos estudiaron diferentes proteínas fluorescentes (FP). Roger Tsien, profesor de la Universidad de California en San Diego, en San Diego, California, rediseñó el gen GFP para producir la proteína en diferentes estructuras. Su equipo también rediseñó otros FP. Debido a los esfuerzos de Tsien y otros bioingenieros, GFP no solo pudo exhibir una fluorescencia más brillante, sino también responder a una gama más amplia de longitudes de onda, así como emitir casi todos los colores, excepto el rojo. Los hallazgos de Tsien permitieron a los científicos etiquetar GFP de múltiples colores a diferentes proteínas, células u orgánulos de interés, y los científicos pudieron estudiar la interacción de esas partículas. Red FP estuvo disponible en 1999, cuando el equipo de Sergey Lukyanov en el Instituto Shemyakin-Ovchinnikov de Química Bioorgánica en Moscú, Rusia, encontró que algunos corales contenían la proteína roja fluorescente, llamada DsRed. Otros laboratorios desarrollaron sensores fluorescentes para calcio, proteasa y otras moléculas biológicas. Desde entonces, los científicos han informado de más de 150 proteínas distintas de tipo GFP en muchas especies.

Como GFP no interfiere con los procesos biológicos cuando se usa en vivo, los biólogos lo utilizan para estudiar cómo se desarrollan los organismos. Por ejemplo, después de 1994, Chalfie y sus colegas aplicaron GFP en el estudio del desarrollo neuronal de C. elegans. En un artículo de 2002, Chalfie y sus colegas describen cómo primero etiquetaron un gen específico involucrado en la percepción táctil en células neuronales con GFP, y luego observaron la cantidad de fluorescencia emitida por esas células. Debido a que las células mutantes producían menos o más GFP que las células normales, la cantidad anormal de producción de fluorescencia indicó el desarrollo anormal de mutantes. Desde entonces, este campo de investigación se expandió a muchos otros organismos, como moscas de la fruta, ratones y peces cebra.

El 10 de diciembre de 2008, la academia de la Real Academia Sueca de Ciencias otorgó el Premio Nobel de Química a Tsien, Chalfie y Shimomura por sus descubrimientos sobre GFP.


Materiales y métodos

Condiciones de crecimiento de la construcción de deformaciones y análisis de imágenes

Todos los plásmidos y cepas utilizados en este trabajo se detallan en la Tabla 1. La clonación de GFP se realizó mediante clonación independiente de ligación (LIC) como se detalla en [4] utilizando cebadores en la Tabla 2. El mCherry Las fusiones de genes se crearon mediante PCR amplificando el extremo 3 'de los genes respectivos usando cebadores en la Tabla 2, y digiriéndolos con las enzimas de restricción apropiadas, antes de ligarlos en pNG621 cortado de manera similar. Transformación de B. subtilis se llevó a cabo según [5]. B. subtilis se indujo a las células a esporular mediante el método de resuspensión de [6] modificado por [7]. La adquisición y el análisis de imágenes se realizaron como se describe en [8].

Sobreproducción y purificación de GFP y mCherry

GFPmut3 se sobreprodujo y se purificó como se detalla en [8]. El gen que codifica mCherry se amplificó por PCR a partir de pNG621 usando pETmCherryF y pETmCherryR (Tabla 2) y se clonó en pETMCSIII usando Nde yo y Eco RI para dar lugar a pNG735 (Tabla 1). La sobreproducción, purificación y cuantificación de la proteína mCherry purificada se llevó a cabo según GFPmut3 como se detalla en [8].

Determinación de la emisión dependiente del pH de GFP y mCherry

El pH de los tampones de fosfato de potasio (20 mM KH2correos4, NaCl 200 mM, glicerol al 10%) se ajustaron usando KOH 5 M o HCl 5 M para producir doce tampones con un pH de 4,4, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 7,75, 8,0, 8,25, 8,5 y 9.1. Se agregaron GFPmut3 y mCherry purificados a una concentración final de 1 μM en cada uno de los tampones. Se transfirieron alícuotas de 100 μl de estos a una microplaca de 96 pocillos (NUNC), y luego se colocaron en un FLUOROstar Optima (BMG LabTech) donde la GFP (excitación 480/10 nm emisión 520/10 nm) y mCherry (excitación 570/10 nm emisión 620/10 nm) se leyeron las señales antes de ser procesadas en Microsoft Excel.


Métodos

Purificación de proteínas de A. sulcata var.rufescens.

Se obtuvieron muestras de tentáculos que contenían una de las proteínas de diferentes colores mediante disección bajo luz ultravioleta. Las muestras se homogeneizaron con un Sonifier (Branson) en tampón fosfato 0,1 M a pH 6,8, se incubaron a 65 ° C durante 2,5 min y se centrifugaron a 100.000 × gramo durante 1 h. Las proteínas coloreadas del sobrenadante se purificaron mediante la adición de isopropanol paso a paso. Se añadió por paso el diez por ciento del volumen de muestra original de isopropanol. Después de cada paso, las muestras se centrifugaron a 27.000 × gramo durante 5 min. La presencia de las proteínas coloreadas en el sedimento se controló visualmente bajo luz UV y luz visible. AsFP595 y asCP562 precipitaron principalmente a una concentración final del 50% y asFP499 a una concentración final de isopropanol al 70%. Los gránulos que contenían la mayoría de los pigmentos se disolvieron en una pequeña cantidad de tampón fosfato (pH 6,8), se cargaron en un gradiente de sacarosa (sacarosa al 40% / 15% en tampón fosfato 0,1 M) y se centrifugaron a 18 ° C durante 12 ha 100.000 × gramo. Se empaparon bandas fluorescentes / coloreadas y se precipitaron las proteínas como se describió anteriormente. Los sedimentos se disolvieron en tampón fosfato 0,1 M que contenía SDS al 1%, beta - mercaptoetanol 20 mM y glicerol al 10%. Las muestras se cargaron en un gel de agarosa (gel: agarosa al 0,5%, SDS al 0,5% en tampón fosfato 0,1 M, tampón de funcionamiento a pH 6,8: SDS al 0,5% en tampón fosfato 0,01 M, pH 6,8). Se cortaron bandas fluorescentes / coloreadas y se transfirieron a un gel de poliacrilamida (gel: poliacrilamida al 6%, SDS al 0,5% en tampón fosfato 0,1 M, tampón de funcionamiento pH 6,8: SDS al 0,5% en tampón fosfato 0,01 M, pH 6,8). Se cortaron de nuevo bandas fluorescentes / coloreadas y se pulverizaron en nitrógeno líquido. Las proteínas se desnaturalizaron completamente mediante la adición de Tris $ $ HCl 0,625 M, pH 6,8 suministrado con β-mercaptoetanol al 10% (14,3 mol / litro), SDS al 1% y glicerol al 10% y calentando a 99 ° C durante 5 min. Posteriormente, se realizó SDS / PAGE como se describe (25).

Filtración en gel.

Los pesos moleculares aparentes de los pigmentos proteicos se determinaron usando un sistema SMART y una columna Superdex 75 (Amersham Pharmacia) (tampón fosfato 0,05 M, NaCl 100 mM, pH 7). Los extractos crudos clarificados se diluyeron 1:50 (concentración final de proteína & lt0,5 mg / ml) en tampón fosfato 0,05 M, NaCl 100 mM, pH 7 (condiciones fisiológicas) o en clorhidrato de guanidina 6 M (condiciones desnaturalizantes). Las proteínas diana se detectaron midiendo la absorción a 480, 562 y 574 nm.

Espectroscopia.

Para el análisis se utilizaron proteínas parcialmente purificadas en soluciones acuosas. Los espectros de excitación / emisión se determinaron con un espectrómetro de fluorescencia (Spex Industries, Edison, NJ). Los espectros de absorción se midieron con un espectrofotómetro (Cary 1, Varian).

Inducción de fluorescencia.

Las proteínas parcialmente purificadas asFP595 y asCP562 se desnaturalizaron completamente y se realizó SDS / PAGE como se describe anteriormente. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (NC 45, Serva) usando una modificación del procedimiento de transferencia semiseco descrito por Khyse-Anderson (26). Los tampones utilizados para la transferencia fueron: tampón de ánodo I (Tris 0,3 M / metanol al 10%, pH 10,4) tampón de ánodo II (Tris 0,025 M / metanol al 10%, pH 10,4) y tampón de cátodo (Tris 0,025 M / metanol al 20% / 0,04 M ɛ-amino-norte-ácido caproico, pH 9,4). Las proteínas fluorescentes de la membrana de nitrocelulosa se excitaron con radiación UV de banda ancha. Las membranas de nitrocelulosa se fotografiaron utilizando un filtro de paso largo de 610 nm.

Los espectros de emisión de la fluorescencia inducida se examinaron directamente en la membrana de nitrocelulosa con un espectrómetro de fluorescencia (Spex Industries).

Construcción y cribado de la biblioteca de ADNc.

Los tentáculos se homogeneizaron en TriPure (Roche Diagnostics) y el ARN total se aisló como lo describe el fabricante. El ARN total fue digerido con DNasa I (Roche Diagnostics) durante 0,5 ha 37 ° C, y el ARNm se aisló utilizando un kit de aislamiento de ARNm (Roche Diagnostics). El ARNm purificado se digirió con Dnasa I una vez más y se extrajo con fenol. La biblioteca de cDNA se construyó usando un kit de síntesis de cDNA ZAP Express y un kit de clonación Gigapack III Gold (Stratagene) siguiendo el protocolo. La biblioteca de fagos se transformó en una biblioteca de fagémidos utilizando el protocolo de escisión en masa del proveedor. Transformado Escherichia coli (Cepa XLOLR suministrada con el kit) se sembró en agar provisto de kanamicina e isopropil β-d-tiogalactósido. Las placas de agarosa se incubaron durante la noche a 37 ° C y se colocaron a 4 ° C durante 48 h después. Las placas se inspeccionaron visualmente en una pantalla UV y bajo luz visible para seleccionar colonias fluorescentes / coloreadas para análisis adicionales.

Las proteínas se extrajeron de E. coli mediante ciclos repetidos de congelación y descongelación en tampón fosfato. La incubación de las muestras a 4 ° C durante 48 h aumenta el rendimiento de proteína disuelta. Los restos celulares se centrifugaron a 50.000 × gramo durante 1 h. El sobrenadante clarificado se usó para análisis adicionales.


Mecanismos mitocondriales para la importación y el ensamblaje de proteínas

Nils Wiedemann y Nikolaus Pfanner
Vol. 86, 2017

Abstracto

Las mitocondrias son orgánulos esenciales con numerosas funciones en el metabolismo celular y la homeostasis. La mayoría de las & gt1.000 proteínas mitocondriales diferentes se sintetizan como precursores en el citosol y se importan a las mitocondrias mediante cinco transportes. Lee mas

Figura 1: Descripción general de las cinco principales vías de importación de proteínas de las mitocondrias. Las preproteínas portadoras de presecuencia son importadas por la translocasa de la membrana mitocondrial externa (TOM) y el presequ.

Figura 2: La ruta de presecuencia hacia la membrana interna mitocondrial (MI) y la matriz. La translocasa de la membrana externa (TOM) consta de tres proteínas receptoras, la proteína formadora de canales To.

Figura 3: Papel de la translocasa del ensamblaje de oxidasa (OXA) en la clasificación de proteínas. Las proteínas sintetizadas por los ribosomas mitocondriales son exportadas a la membrana interna (MI) por el OXA que transloca los ribos.

Figura 4: Vía del portador hacia la membrana interna. Los precursores de los portadores de metabolitos hidrófobos se sintetizan sin una presecuencia escindible. Los precursores se unen al chaperón citosólico.

Figura 5: Maquinaria de ensamblaje e importación de espacio intermembrana mitocondrial (MIA). Muchas proteínas del espacio intermembrana (IMS) contienen motivos de cisteína característicos. Los precursores se mantienen en un formato reducido.

Figura 6: Biogénesis de proteínas de barril β de la membrana mitocondrial externa. Los precursores de las proteínas de barril β son inicialmente importados por la translocasina de la membrana externa (TOM), se unen a los pequeños.

Figura 7: El papel dual de la distribución mitocondrial y la morfología de la proteína 10 (Mdm10) en el ensamblaje de proteínas y los sitios de contacto de los orgánulos. Mdm10 se asocia con la maquinaria de clasificación y ensamblaje (SAM).

Figura 8: Múltiples vías de importación para proteínas integrales α-helicoidales de la membrana externa mitocondrial. Los precursores de proteínas con una secuencia de anclaje de señal N-terminal se insertan típicamente en.

Figura 9: El sitio de contacto mitocondrial y el sistema organizador de crestas (MICOS) interactúa con translocas de proteínas. MICOS consta de dos subunidades principales, Mic10 y Mic60. Mic10 forma oligómeros grandes th.


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Minimizar el daño de la fluorescencia

00: 00: 11.15 La microscopía de fluorescencia es genial, pero dos de los
00: 00: 16.01 efectos secundarios que a menudo uno tiene que manejar con fluorescencia
00: 00: 18.25 microscopía son fotoblanqueo y fototoxicidad.
00: 00: 22.07 Y estos se ilustran en esta película aquí, donde estás viendo
00: 00: 26.09 microtúbulos marcados con rodamina que se mueven a lo largo de un
00: 00: 30.18 superficie. Y con el tiempo de iluminación, puede ver que el
00: 00: 34.09 la señal de fluorescencia comienza a atenuarse, eso es fotoblanqueo,
00: 00: 37.07 y estos microtúbulos también se han fragmentado
00: 00: 40.29 en muchos pedazos pequeños, y esto es fototoxicidad.
00: 00: 44.27 Porque la iluminación en realidad está destruyendo y rompiendo
00: 00: 48.24 estos microtúbulos. Entonces, si uno intenta capturar la biología viva,
00: 00: 55.08 uno necesita recolectar las imágenes, pero está tratando de no
00: 00: 59.15 destruya la muestra que está tratando de observar. Entonces en esto
00: 01: 03.01 pequeño video de consejos, discutiré las formas en que uno podría minimizar estos
00: 01: 07.12 efectos secundarios no deseados de la microscopía de fluorescencia.
00: 01: 11.01 Entonces, fotoblanqueo, ¿qué es eso? Entonces esto ha sido discutido
00: 01: 15.02 en otras conferencias del curso, es la pérdida - pérdida irreversible,
00: 01: 19.19 de fluorescencia debido a la excitación del fluoróforo.
00: 01: 22.25 Y puedes ver esto muy bien ilustrado en este campo.
00: 01: 28.00 de moléculas individuales de GFP, cada uno de estos puntos es una sola GFP
00: 01: 32.07 y con el tiempo, puede ver que los puntos individuales de repente
00: 01: 36.03 desaparecer. Y la fluorescencia se pierde. Entonces, esta desaparición
00: 01: 41.26 de la fluorescencia de estas moléculas individuales de GFP es
00: 01: 46.21 fotoblanqueo. Y este fotoblanqueo ocurre más rápidamente
00: 01: 51.28 a exposiciones de luz más altas, y también depende mucho de
00: 01: 56.23 el fluoróforo que está usando. Algunos blanqueadores de fluoróforos
00: 02: 00.14 más rápido que otros. E incluso el entorno del fluoróforo,
00: 02: 03.27 puede depender incluso de cómo se une específicamente el fluoróforo
00: 02: 08.02 a su molécula de proteína. El otro efecto es la fototoxicidad.
00: 02: 14.18 Así que esto es realmente un daño a su espécimen.
00: 02: 18.01 Podría ser daño a sus células o moléculas lo que está intentando
00: 02: 23.00 para observar in vitro, como viste con kinesina y microtúbulos.
00: 02: 26.11 Hay dos tipos de fototoxicidad. Uno se debe a dirigir
00: 02: 30.29 absorción de luz, sin fluorescencia. Y luz ultravioleta,
00: 02: 37.15 en particular, las longitudes de onda más altas de la luz tienden a ser particularmente
00: 02: 41.02 dañino. Entonces, en muchos casos, si se pueden usar longitudes de onda más largas
00: 02: 47.05 luz, como luz verde o luz roja, que tiende a ser menos
00: 02: 52.08 absorbido y menos dañino para las células.
00: 02: 55.05 El otro tipo de fototoxicidad es indirecta y ocurre a través de
00: 02: 59.07 la excitación real del fluoróforo, que puede dar lugar a
00: 03: 04.21 la producción de especies reactivas de oxígeno. Y estos son
00: 03: 09.01 una serie de radicales altamente reactivos que pueden interactuar con
00: 03: 16.24 el fluoróforo, o también con cualquier biomacromolécula
00: 03: 21.16 y dañarlos. Y esto es obviamente algo que uno
00: 03: 25.09 quiere evitar, si uno quiere mantener contento a su espécimen
00: 03: 28.26 y saludable durante el curso de la observación. Entonces hay algunos
00: 03: 32.19 cosas que puede hacer para mitigar tanto el fotoblanqueo como
00: 03: 36.15 fotoxicidad. Si uno tiene la suerte de estar haciendo microscopía en un
00: 03: 41.16 muestra in vitro, en esos casos, puede eliminar
00: 03: 47.00 oxígeno molecular del tampón. Y hay cosas llamadas
00: 03: 52.16 sistemas captadores de oxígeno, que de hecho son una mezcla enzimática
00: 03: 57.26 que eliminará el oxígeno de la solución. Y tambien hay
00: 04: 05.18 cosas que se podrían agregar que reaccionan con las especies reactivas del oxígeno
00: 04: 10.06 y elimínelos antes de que puedan dañar la celda o
00: 04: 16.13 macromolécula. En un espécimen fijo, también hay formas de
00: 04: 21.11 montando su muestra, su muestra inmunofluorescente,
00: 04: 24.07 y agentes comerciales llamados "anti-fade" que minimizan
00: 04: 29.19 la tasa de fotoblanqueo para permitir una observación más prolongada.
00: 04: 34.25 Ahora, solo les mostraré un ejemplo de agotamiento del oxígeno molecular
00:04:38.13 this is that specimen I showed you that's being all fragmented
00:04:42.27 here, due to the reactive oxygen species. And here is the exact
00:04:48.12 same type of specimen here with these oxygen scavengers
00:04:53.04 now added to the buffer system. And you can see that
00:04:57.02 photobleaching is minimized, and the kinesin molecules
00:05:02.19 are very happily moving the microtubules, and the microtubules aren't
00:05:06.04 being fragmented. And so this just shows how powerful
00:05:10.00 removing molecular oxygen can be. So if we're working with
00:05:15.05 living cells or tissues, we can't obviously remove molecular oxygen.
00:05:18.19 So we have to think of other strategies for minimizing photobleaching
00:05:23.13 and toxicity. And the basic strategy is to minimize the light exposure
00:05:28.17 on your specimen. And naturally, there's a trade-off here.
00:05:33.11 The more photons that we illuminate the specimen with,
00:05:36.01 the more fluorescence will be produced, and we get a better
00:05:38.28 signal to noise, but if we over-illuminate, we also risk the
00:05:44.13 danger of also creating more photodamage and in that
00:05:49.28 way, actually interfering with the processes in the cell that
00:05:53.14 we're actually trying to observe. So there are several things that we
00:05:57.01 can do. First of all, shutter the light source. During times
00:06:01.11 when one's not actually collecting the image, the light
00:06:04.19 source should be turned off. And there are many ways now to
00:06:09.13 shutter a light source and control it with a computer.
00:06:12.28 Secondly, is just to minimize the light exposure.
00:06:16.24 Again, we want to collect a decent signal to noise, but
00:06:20.19 particularly, for every light sensitive processes in cells,
00:06:25.16 we want to minimize the light exposure. And that can be done
00:06:29.09 in a few ways. One is through the illumination intensity itself.
00:06:35.01 And also the exposure time that we are collecting photons
00:06:42.09 on the camera. So, between the intensity and the exposure
00:06:46.06 time, that gives you your signal. And one has to really
00:06:51.15 think about both of these parameters very carefully so one's getting
00:06:54.26 a good image, but again not over illuminating and potentially
00:06:59.04 causing photodamage. And the other thing we can control
00:07:03.02 in a time lapse movie, is the interval between exposures.
00:07:07.13 And that depends on the dynamics of your process, but
00:07:10.15 if you're working and trying to observe a very slow process
00:07:14.02 that's going on in a cell, we have the luxury then of shuttering
00:07:17.21 the light source for a longer period of time in between exposures
00:07:22.17 and that also minimizes photodamage. Another big breakthrough
00:07:27.07 is really using very sensitive cameras. And elsewhere in the course,
00:07:32.02 you can learn about these new cameras called EMCCD cameras,
00:07:35.02 and these have been a really big breakthrough in live cell imaging.
00:07:39.02 Because they're extremely sensitive, and that allows one to
00:07:43.25 use very low illumination of the specimen and still collect
00:07:49.05 very good images and create less photodamage.
00:07:53.02 And the other potential strategy is also to minimize out of focus
00:07:59.24 light exposure. If one's trying to collect a particular plane of
00:08:03.26 illumination and image that plane, but one's bathing the specimen
00:08:07.06 above and below that plane with light, you're potentially just
00:08:11.00 creating photodamage in the cell. But that out of focus light is not
00:08:17.29 contributing to the image. So there are a couple very powerful techniques,
00:08:21.02 total internal reflection fluorescence microscopy and light sheet
00:08:28.11 microscopy, are both very good ways to minimize out of focus
00:08:32.21 light exposure. So these are a few tips and I hope you
00:08:38.25 can employ them and remember, you want to create
00:08:42.27 great images, but also keep your molecules and cells happy!
00:08:47.00 Thank you.


Resultados y discusión

Virus-Based Screening Allows the Isolation of LOV Variants with Improved Fluorescence.

To create a LOV-based FP that would be suitable for plants, the LOV2 domain (amino acids 387–496) from Arabidopsis thaliana phototropin 2 (phot2) was chosen because this protein is monomeric (17). Upon UV/blue light excitation, LOV domains undergo a reversible photocycle involving formation of a covalent adduct between the FMN chromophore and a conserved cysteine residue within the protein (18). The photoactive cysteine within LOV2 (Cys 426 of Arabidopsis phot2) was replaced with alanine to abolish adduct formation (18, 19) and generate derivative C426A (Fig. 1A).

DNA shuffling of phototropin LOV domains. (A) Schematic representation of the shuffling procedure. Arabidopsis phot1 and phot2 consist of a C-terminal serine/threonine kinase domain (KD) and two photosensory LOV domains (LOV1 and LOV2) that bind the chromophore FMN. The conserved cysteine required for LOV-domain photochemistry was replaced with alanine by site-directed mutagenesis before DNA shuffling. Two sequential rounds of DNA shuffling were carried out (R1 and R2, respectively). In R1, shuffled populations were generated by using low fidelity PCR conditions. For R2, high fidelity PCR conditions were used. In each case, the LOV2 domain of Arabidopsis phot2 (C426A) was used as a template scaffold for reassembly. Shuffled populations were subjected to TMV-based expression in tobacco and screened for improved fluorescence under UV light. (B) TMV-based expression of LOV variants in leaves of Nicotiana tabacum. Images were recorded simultaneously under UV illumination to allow direct comparison of green fluorescence. Leaves were either mock inoculated or inoculated with TMV vector expressing the progenitor C426A or the brightest variants from R1 and R2 (914 and 981, respectively) and photographed 3 days post inoculation.

Unfortunately, TMV-based expression of C426A in leaves of Nicotiana tabacum (6) produced fluorescent viral lesions that were barely detectable under UV/blue light (Fig. 1B). Thus, DNA shuffling was performed to enhance the fluorescent properties of C426A. To increase diversity, C426A was shuffled with three other LOV-coding sequences from Arabidopsis containing the photochemically inert cysteine-to-alanine substitution (Fig. 1A). Using C426A as a template scaffold for reassembly, shuffled populations were cloned and screened by virus-based expression in tobacco. Lesions exhibiting enhanced fluorescence relative to that of C426A were excised and pooled, with the exception that the brightest lesion was retained to confirm the veracity of the screening approach [supporting information (SI) Fig. S1]. A second round of DNA shuffling and screening was conducted (Fig. 1A) to establish whether beneficial mutations isolated from the first round could be combined to produce clones with additional improvements and 16 independent clones were obtained. Sequence analysis revealed that a number of amino acid substitutions occurred with high frequency (Table S1), most of which represented substitutions naturally found in LOV domains of phot1 or the LOV1 domain of phot2 (Fig. S2). Recombination of related LOV sequences was not evident in the progeny recovered suggesting that the conditions used favored insertion and recombination of point mutations within the LOV2-coding sequence of phot2. Despite this, sequential shuffling and virus-based screening were successful in producing additive improvements in LOV-mediated fluorescence (Fig. 1B).

Shuffled LOV Variants Show Enhanced Fluorescence and Reduced Photobleaching Characteristics.

Subsequent analysis was restricted to the brightest variants isolated from the first and second round of shuffling, derivatives 914 and 981, respectively (Fig. 1B). Comparative in vivo fluorescence measurements were performed by using liquid cultures of E. coli (Fig. 2A). Cells expressing derivative 914, and to a greater extent 981, showed improved levels of in vivo fluorescence relative to C426A upon UV irradiation fluorescence intensities were increased by 1.4-fold and 2-fold, respectively (Fig. 2B), resulting in a 10-fold greater in vivo fluorescence of 981 compared with that of wild-type LOV2 (Fig. 2B). Furthermore, continued exposure to UV light greatly diminished the level of green fluorescence from either C426A or wild-type LOV2 (lower panel in Fig. 2A). C426A showed a 23% reduction in fluorescence after arc lamp irradiation, whereas photobleaching was less apparent for 914 and 981, indicating that they were more photostable (Fig. 2C).

Photochemical characterization of shuffled LOV variants expressed in E. coli. (A) In vivo fluorescence in E. coli liquid cultures expressing wild-type Arabidopsis phot2 LOV2 (WT), derivative C426A and shuffled variants 914 and 981 viewed immediately under UV light (Cima) or after several minutes of UV irradiation (Fondo). Equal protein levels in E. coli cultures are shown by SDS/PAGE and Coomassie Blue staining using cells transformed with the expression vector only as a control (Medio). (B) Quantification of LOV-mediated in vivo fluorescence in E. coli liquid cultures. Fluorescence intensities of liquid cultures were recorded at 495 nm upon excitation with blue light (450 nm). (C) Fluorescence loss in LOV-expressing E. coli cultures after xenon arc lamp illumination. Fluorescence intensities were recorded as in (B). (D) Fluorescence excitation and emission spectra of purified C426A (solid line) and variant 981 (dashed line). Fluorescence excitation spectra (blue) were recorded by using an emission wavelength of 495 nm, whereas fluorescence emission spectra (green) were recorded by using an excitation wavelength of 450 nm. (mi) Reverse mutagenesis and quantification of 981-mediated in vivo fluorescence in E. coli liquid cultures. Point mutations indicated were introduced into 981 and the effect on in vivo fluorescence was assessed as in (B). Selective point mutations were then introduced into the progenitor C426A to confirm their role in enhancing fluorescence emission. (F) Structure of 981 was obtained by homology modeling with the program Swiss Model using the protein structure of Adiantum-capillus-veneris neochrome LOV2 (PDB entry IG28) and visualized by using PyMOL. Amino acid residues contributing to the enhanced fluorescence of 981 are indicated in magenta.

The absorption spectrum for purified 981 was identical to that of C426A (Fig. S3), as was its fluorescence excitation and emission spectra (Fig. 2D). Both proteins showed maximal absorption at 447 nm and maximal fluorescence emission at 497 nm upon excitation with blue light (450 nm). Consistent with our in vivo fluorescence measurements (Fig. 2B), purified 981 showed 2-fold greater fluorescence emission than C426A (Fig. 2D). Determination of fluorescence quantum yields (QF) revealed a QF of 0.32 and 0.44 for C426A and 981, respectively, the latter correlating well with the fluorescence associated with commonly used FPs such as CFP (20) and derivatives of DsRed (21). Because 981 contained multiple amino acid changes (Fig. S2), individual point mutations were introduced to ascertain whether the improved fluorescence properties could be assigned to specific amino acids. This process was simplified by the observation that >60% of the cloned progeny (Table S1), including 914 and 981, contained two substitutions normally found in LOV1 domains: S409G and F470L (22). Reverse mutagenesis of 981 revealed that both amino acid changes contributed to improved fluorescence (Fig. 2mi). The generation of triple mutants also indicated that residues Thr 394 and, to a lesser degree, Ile 452 and Met 475 in 981 contribute to fluorescence emission. Introduction of point mutations into C426A further confirmed that Thr 394 , Gly 409 and Leu 470 largely account for the improved fluorescence inherent to 981 and provide suitable targets for saturation mutagenesis.

Structural modeling of 981 indicates that Gly 409 is distantly located from the FMN cofactor (Fig. 2F) making it difficult to infer the exact impact of this mutation on the chromophore environment, whereas Thr 394 and Leu 470 are situated in close proximity to the FMN isoalloxazine moiety (Fig. 2F). Although further analysis is required to address how these mutations enhance fluorescence when combined, 981 exhibits many hallmarks of a fluorescence reporter, and is herein referred to as iLOV owing to its improved fluorescent properties.

Improved Fluorescent Properties Make iLOV Suitable for Confocal Imaging in Plant and Mammalian Cells.

TMV-based expression of iLOV was detectable in tobacco epidermal cells by fluorescence or confocal microscopy (Fig. 3A) in both the cytosol and the nucleus (Fig. 3B). Nuclear localization was used to quantify in vivo fluorescence. Como en E. coli (Fig. 2A), iLOV exhibited ≈2-fold increased fluorescence relative to C426A (Fig. 3C). Similar differences in fluorescence intensity were observed upon transient infiltration with Agrobacterium tumefaciens (Fig. S4). Furthermore, C426A fluorescence decreased rapidly after repeated laser scanning to reach a steady-state level indistinguishable from background (Fig. 3C). Fluorescence loss exhibited by iLOV and 914 was reduced by comparison, contributing to an improved level of detection over C426A (Fig. 3C). Prolonged laser scanning under these conditions caused iLOV fluorescence to decrease to only 50%, leaving sufficient signal to still be detectable by confocal imaging (Fig. S5).

Expression and subcellular targeting of iLOV in Nicotiana benthamiana and HEK cells. (A) Virus-based expression of free iLOV from a TMV vector. (B) Higher magnification of free iLOV expression showing both cytosolic and nuclear localization. (Scale bar, 50 μm.) (C) Photobleaching kinetics of LOV variants expressed in epidermal cells. LOV-mediated fluorescence from nuclei was used to quantify fluorescence loss in response to repeated scanning at 40% laser power. The first scan was used to focus on nuclei to be imaged and quantified. After 1 min, a series of 20 images was collected every s. Values represent the mean ± SE (norte = 21). (D) iLOV targeted to the endoplasmic reticulum with TMV.SP-iLOV-HDEL. (Scale bar, 50 μm.) (mi) iLOV targeted to the Golgi from TMV.ST-iLOV (indicated in green). Chloroplast autofluorescence is indicated in red. (Scale bar, 50 μm.) (F) iLOV expressed as a C-terminal fusion to Arabidopsis histone 2B. (Scale bar, 50 μm.) (GRAMO) Fluorescence imaging of free iLOV expressed in HEK cells. Bright field image is shown on the right. (Scale bar, 20 μm.) (H) iLOV accumulation in HEK cells detected by Western blotting using anti-iLOV antibody. HEK cells expressing GFP were used as a control. Ponceau S staining of the immunoblot below shows equal protein loading (20 μg).

iLOV fluorescence relies on its FMN chromophore, whereas GFP-based FPs are inherently fluorescent (1). One potential drawback in using iLOV as a reporter could arise from its dependency on a cellular cofactor. However, inclusion of the endoplasmic reticulum (ER) signal peptide and tetrapeptide retention signal, HDEL, showed that fluorescent iLOV protein could be targeted to the lumen of this endomembrane compartment (Fig. 3D). In addition, iLOV was targeted to the trans face of the Golgi apparatus (Fig. 3mi) as a fusion protein to the sialyl transferase membrane-spanning domain resulting in fluorescent motile Golgi bodies (Movie S1) indistinguishable from those tagged with GFP (23). Fusion of iLOV to the C terminus of Arabidopsis histone 2B produced distinct labeling of the nucleus and nucleolus (Fig. 3F). Thus, the requirement for FMN does not limit the utility of iLOV as a fluorescent reporter in plant cells, at least for those subcellular compartments examined.

iLOV codon usage was also optimized for expression in human embryonic kidney (HEK) cells. iLOV was readily detectable by both confocal imaging (Fig. 3GRAMO) and western analysis using polyclonal antisera raised against iLOV (Fig. 3H), demonstrating that its utility can be extended to mammalian cells.

Photobleaching of iLOV in Vivo Is Reversible.

It is well established that GFP bleaches irreversibly under high-intensity imaging conditions (24). Although initially regarded as a problem for imaging, photobleaching of GFP and related FPs has been exploited to follow and quantify protein dynamics within living cells (1). Therefore, it was of interest to establish whether iLOV showed similar photobleaching properties. Nuclear-localized iLOV fused to histone 2B (Fig. 4A) was used to monitor fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Entire nuclei were scanned repeatedly at high laser power to maximize photobleaching (Fig. 4B) and avoid FRAP arising as an influx of molecules from any unbleached regions of the nucleus. iLOV fluorescence recovered fully after photobleaching (Fig. 4C) and time-lapse measurements revealed a half-maximal recovery time of ≈50 s (Fig. 4D). The reversible photobleaching of iLOV likely reflects a photochemical change(s) associated with the FMN chromophore that interchanges between fluorescent and nonfluorescent forms. High light intensities induce the formation of a neutral flavin semiquinone in LOV domains where the photoactive cysteine has been mutated (25) and may account for the observed photoreversible properties. Indeed, the blue fluorescence detected upon prolonged UV irradiation of E. coli cultures expressing C426A (Fig. 2A) would concur with the spectral characteristics of a protein-bound semiquinone (26).

Recovery of iLOV fluorescence after photobleaching. (A) iLOV expressed as a C-terminal fusion to Arabidopsis histone 2B was used to quantify fluorescence recovery after photobleaching. Representative images before photobleaching, after bleaching and post recovery are shown. (Scale bar, 5 μm.) (B) Photobleaching kinetics of nuclear-localized iLOV after repeated laser scanning at 88% laser power. A series of 40 scans was performed and one image collected every 6 s. Values represent the mean ± SE (norte = 18). (C) Recovery kinetics for iLOV fluorescence after photobleaching. Values represent the mean ± SE (norte = 18). Recovery fits to a first exponential and indicates a half-maximal recovery time of 54 s.

ILOV Outperforms GFP as a Reporter of Virus Infection and Movement.

Our main incentive for engineering an LOV-based fluorescent reporter was to overcome the limitations of using GFP for monitoring plant virus infection. Because the coding sequence of iLOV (≈300 bp) is considerably smaller than that of GFP (≈700 bp), we reasoned that the reduced genetic load of iLOV compared with GFP would be less detrimental to virus spread. To test this hypothesis, TMV-based vectors expressing either iLOV (TMV.iLOV) or GFP (TMV.GFP) were compared by inoculation of tobacco leaves. In half-leaf inoculations of reassembled transcripts for both constructs, TMV.iLOV produced pervasive, systemic green fluorescence (Fig. 5A), while TMV.GFP was restricted to local lesions at the sites of inoculation (Fig. 5A). Improved systemic spread of TMV.iLOV over TMV.GFP was also apparent after separate inoculations of plants after 4 days, all plants inoculated with TMV.iLOV showed extensive systemic movement, whereas only 10% of TMV.GFP-inoculated plants exhibited signs of systemic fluorescence. Similar improvements of systemic spread of TMV.iLOV over TMV.GFP were visualized at later stages of infection (Fig. S6). Reduced genetic load may account for the improved functionality of iLOV over GFP because fusion of iLOV to Arabidopsis histone 2B (≈800 bp) diminished the efficiency of systemic spread (Fig. S7).

Utility of iLOV as a cytosolic fluorescent reporter for TMV infection. (A) Half-leaf inoculations of Nicotiana tabacum show that systemic spread of TMV.iLOV is extensive 4 days post inoculation (dpi) whereas TMV.GFP is still restricted to primary lesions on the inoculated leaf. Arrows indicate half-leaf inoculation sites. (B) Size of TMV.GFP lesion at 2 dpi. (Scale bar, 500 μm.) Lesions typically measured 687 μm ± 103 (norte = 14). (C) Size of TMV.iLOV lesion at 2 dpi. (Scale bar, 500 μm.) Lesions typically measured over 3045 μm ± 113 (norte = 8).

Local virus movement during the early stages of infection was also examined. TMV.GFP produced small groups of infected cells (Fig. 5A) whereas multicellular fluorescent lesions were detected for TMV.iLOV (Fig. 5C) indicating that cell-to-cell movement of TMV was less impeded, rendering iLOV a more efficient reporter than GFP for monitoring both local and systemic viral infections. Similarly, increased cell-to-cell movement of iLOV over DsRed was observed at the infection front of lesions created by TMV expressing both fluorescent proteins (Fig. S8), suggesting that iLOV matures faster than DsRed and/or may diffuse into neighboring cells owing to its smaller size.

GFP has been used extensively to investigate the function and localization of the TMV movement protein (MP), a 30-kDa-protein essential for cell-to-cell movement of the virus through specialized channels in the cell wall known as plasmodesmata (PD) (27). TMV MP binds single-stranded RNA and accumulates in PD during viral infection (3, 27, 28). Fusion of iLOV to the C terminus of TMV MP produced PD localization in tobacco (Fig. 6 C.A), similar to that reported for MP-GFP (29). Moreover, the systemic spread of TMV expressing MP-iLOV was much greater compared with virus expressing MP-GFP (Fig. 6D). Whereas fusion of GFP is known to compromise the functionality of some viral MPs (30), iLOV may be less disruptive with respect to steric hindrance given its smaller size. Potato mop-top virus (PMTV), unlike TMV, requires the read-through product of the viral coat protein (CP RT ) for cell-to-cell movement of the viral genome (31). Fusion of YFP to the C terminus of PMTV CP RT restricted movement of this RNA virus to single or a few cells on the inoculated leaf surface (Fig. 6mi), whereas multicellular lesions were observed with virus expressing CP RT -iLOV (Fig. 6F) that localized to punctate bodies at the cell periphery, consistent with its function in cell-to-cell transport of RNA-protein complexes (31).

Utility of iLOV as a fluorescent reporter fusion for TMV and PMTV infection. (A) TMV MP-iLOV localization to plasmodesmata. (Scale bar, 20 μm.) (B) Callose staining at plasmodesmata with aniline blue. (C) Colocalization of TMV MP-iLOV fluorescence with aniline blue staining of plasmodesmata. (D) Systemic spread of TMV MP-iLOV and TMV MP-GFP. Upper leaves of Nicotiana tabacum at 4 days post inoculation. TMV MP-iLOV shows extensive systemic spread and unloads from all major vein classes, spreading into neighboring ground tissue (left). TMV MP-GFP by comparison shows no or limited systemic spread unloading only patchily from the midrib and some secondary veins. Leaves were photographed simultaneously to allow direct comparison of green fluorescence intensity. (mi) Representative image showing the lesions size produced by PMTV expressing CP RT -YFP 2 days post bombardment of Nicotiana tabacum sale de. (Scale bar, 100 μm.) (F) Lesion size for PMTV expressing CP RT -iLOV visualized as in (mi). (Scale bar, 100 μm.)

Further Application of iLOV as a Fluorescent Reporter.

Our findings demonstrate that iLOV represents a new class of genetically encoded FP that outperforms GFP as a reporter for plant virus movement and confers improved viral protein functionality. As many viral replication/movement events occur early in the infection cycle, the slow maturation of the GFP fluorophore limits its use for real-time studies of viral movement processes (29). It will now be important to establish whether iLOV can circumvent this problem. FP genes have predominantly been inserted into the genomes of filamentous plant viruses (28) because packaging constraints hinder their application to spherical viruses (5, 7). The smaller size of the iLOV coding sequence is likely to extend the range of plant and animal viruses that can be fluorescently tagged in vivo and enhance the study of intercellular protein trafficking. It is noteworthy that LOV-mediated fluorescence is extremely stable over a wide pH range (19) and may circumvent the pH sensitivity commonly associated with GFP-related FPs (1). iLOV may also remedy problems associated with dysfunctional GFP fusions given its smaller size, and prove useful for double and triple labeling studies where expression of multiple GFP derivatives can result in gene silencing. Although LOV-based FPs have been used successfully to monitor bacterial cell populations (12, 16), our studies highlight the necessity for protein engineering through DNA shuffling to create variants with improved characteristics that are suitable for fluorescence imaging. In contrast to GFP that bleaches irreversibly under sustained high light intensities (24), iLOV exhibits a latent photochemistry that recovers spontaneously, offering advantages where repeated laser scanning is desired. Although GFP-based FPs are likely to remain the main choice of researchers for the immediate future, we anticipate that iLOV-based fluorescent probes will provide attractive alternatives for specific applications where current genetically encoded FP technologies fall short.


MÉTODOS

Tb 3+ -doped glass capillaries

Tb 3+ -doped glass consisted of 62.6 mol % SiO2, 4.9 mol % Al2O3, 9.8 mol % B2O3, 14.0 mol % Na2O, 5.5 mol % MgO, 3.1 mol % Tb2O3, and 0.1 mol % CeO2. The starting materials were 99.9% pure SiO2, Al2O3, B2O3, N / A2CO3, MgO, Tb4O7, and CeO2. Approximately 300-g batches of the materials were fully melted within a platinum crucible in an electronic furnace at 1500°C. For the first 1 hour, the glass melt was stirred at 1500°C. Then, the melt was poured onto a steel plate, annealed at 630°C for 1 hour, and gradually cooled at a rate of 0.5°C/min in an electric furnace. The glass block was cut into a cylindrical shape (outer diameter: 9.0 mm, inner diameter: 5.1 mm, and length: 100 mm). This tube-shaped glass was pulled at 550° to 650°C to obtain glass capillaries (outer diameter: 1.5 mm, inner diameter: 0.85 mm, and length: 100 mm). The source of Tb 3+ was Tb4O7, which contained Tb 3+ and Tb 4+ . By the addition of CeO2 in batches, we improved the quantum yield of Tb 3+ -doped glass from 48.8 to 68.4%. The final Tb 3+ concentration in the glass was 3.1 mol %, which corresponded to 1.5 × 10 21 ions/cm 3 .

Terbium-doped glass properties

The excitation and emission spectra were measured through a 0.69-mm-thick glass plate using an F-4500 spectrofluorometer (Hitachi High-Technologies). The transmittance spectra were measured through 1.00-mm-thick glass plates using an ultraviolet-visible/NIR spectrophotometer (V-770, JASCO). The quantum yield was measured in a glass block (10 cm by 10 cm by 10 cm) using Quantaurus-QY (Hamamatsu Photonics). To obtain the image shown in Fig. 1D, the tips of the pipettes were coated with osmium with an osmium plasma coater (OPC80T, Filgen) and observed with a scanning electron microscope (S-4800, Hitachi High-Technologies). Thermomechanical analysis (TMA TD-5000SA, Bruker) was performed on glass rod samples measured at a heating rate of 5°C/min from room temperature to 680°C. The coefficient of thermal expansion was calculated on the linear section of the curve (range from 50° to 350°C). The glass transition temperature was determined as a change in the slope of the curve. The sag temperature (glass viscosity: approximately 10 10 dPa∙s) was determined by TMA as the point at which the glass rod started to sag (loading weight: 5 g). The dielectric constant was measured with 0.7 mm thickness using a Precision LCR meter (E4980A, Agilent) and the dielectric test fixture (16541B, Agilent). The Tb 3+ -doped pipettes were pulled using a P-1000 micropipette puller (Sutter Instrument). The pipette capacitance was measured on the surface of a Sylgard bead (49).

Animal experiment ethics

Experiments were performed with the approval of the Animal Experiment Ethics Committee at the University of Tokyo (approval no. P29-3, P29-9) and according to the University of Tokyo guidelines for the care and use of laboratory animals.

Primary culture preparation

Primary cultures were used for in vitro patch-clamp recordings. Dissociated hippocampal cells were prepared from postnatal 0-day-old C57BL/6J mice (50). The hippocampi were dissociated in prewarmed Hanks’ balanced salt solution and treated with 0.25% trypsin/EDTA at 37°C for 15 min. Next, the tissue was treated with 0.01% deoxyribonuclease I (Sigma-Aldrich) at room temperature for 5 min and washed with Hanks’ balanced salt solution, which was then replaced with Neurobasal plating medium containing 2% B27 supplement, 0.5 mM glutamine, 25 μM glutamate, 0.1% penicillin, 0.1% streptomycin, 1 mM Hepes, and 10% horse serum. The tissues were triturated with Pasteur pipettes and filtered through a 40-μm-pore cell strainer (Corning). The dissociated cells were plated onto 13-mm coverslips coated with poly- d -lysine at a cell density of 8.0 × 10 4 cells per well in culture medium in 24-well plates and were incubated at 37°C in a humidified 5% CO2 atmósfera. The medium was changed on day in vitro (DiV) 1 and thereafter every 3 days. The cells were treated with AAV-hSyn-EGFP [1.4 × 10 12 vector genomes (vg)/ml] at DiV 7. Whole-cell recordings were performed on DiV 9.

Acute slice preparation

Acute slices were prepared from the hippocampi and cerebral cortices of ICR mice (17 to 28 postnatal days). The mice were anesthetized with isoflurane and decapitated. The brains were removed and placed in ice-cold oxygenated (95% O2/ 5% CO2) artificial cerebrospinal fluid (aCSF) containing 127 mM NaCl, 1.6 mM KCl, 1.24 mM KH2correos4, 1.3 mM MgSO4, CaCl 2,4 mM2, 26 mM NaHCO3, and 10 mM glucose. The brains were sliced horizontally or coronally at a thickness of 400 μm using a vibratome (VT1200S, Leica) in ice-cold, oxygenated modified aCSF consisting of 222.1 mM sucrose, 27 mM NaHCO3, 1.4 mM sodium phosphate buffer, 2.5 mM KCl, 1.0 mM CaCl2, 7.0 mM MgSO4, and 0.5 mM ascorbic acid, as previously described (51). Slices were maintained for 30 min at 35°C in oxygenated aCSF and then incubated for at least 30 min at room temperature before use.

In vitro electrophysiology

All recordings were performed at 33° to 35°C. Whole-cell recordings were obtained from hippocampal CA1 pyramidal cells or layer 5 pyramidal cells in the somatosensory cortex using a MultiClamp 700B amplifier and a Digidata 1550A digitizer controlled by pCLAMP10.5 software (Molecular Devices). Glass pipettes (3 to 6 megohms) were filled with a solution containing 130 mM CsMeSO4, 10 mM CsCl, 10 mM Hepes, 10 mM Na2-phosphocreatine, 4.0 mM MgATP, 0.3 mM Na2GTP or 120 mM K-gluconate, 5.0 mM KCl, 1.0 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 10 mM Na2-phosphocreatine, 2.0 mM MgATP, and 0.1 mM Na2GTP.

Single-cell RNA sequencing

Glass pipettes (3 to 5 megohms) were filled with 1 μl of solution containing 120 mM K-gluconate, 5.0 mM KCl, 1.0 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.2 mM EGTA, 10 mM Na2-phosphocreatine, 2.0 mM MgATP, and 0.1 mM Na2GTP. While cells were held in the whole-cell voltage-clamp mode, a moderate negative pressure (approximately −50 mPa) was applied for 3 to 8 min. After the cytosol was obtained by this method, the intrapipette solution was pressure-ejected into 100 μl of lysis buffer (LB1 in NucleoSpin RNA Plus XS, Clontech), and total RNA was isolated with NucleoSpin RNA Plus XS (Clontech). Isolated total RNAs were converted to complementary DNA and amplified with the SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing (Clontech). The final sequencing libraries were constructed with the Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) and the Nextera XT Index Kit (Illumina). The pooled sequencing library was analyzed on a NovaSeq 6000 (Illumina). Reads were aligned to the mouse genome (mm10 assembly Ensembl Genome Browser) using STAR (v2.7.3a). Read counts were calculated using RSEM (v1.3.3).

Slice culture preparation and electroporation

Organotypic slice cultures were used for single-cell electroporation. Entorhinal-hippocampal organotypic slices were prepared from 7-day-old Wistar/ST rats as previously described (52, 53). Rat pups were anesthetized by hypothermia and decapitated. The brains were removed and placed in ice-cold oxygenated Gey’s balanced salt solution supplemented with 25 mM glucose. The tissues were sliced horizontally at a thickness of 300 μm using a vibratome (DTK-1500, Dosaka). The slices were placed on Omnipore membrane filters (JHWP02500, Millipore) and incubated in 5% CO2 a 37 ° C. The culture medium—which was composed of 50% minimal essential medium, 25% Hanks’ balanced salt solution, 25% horse serum, 0.1% penicillin, and 0.1% streptomycin—was changed every 3.5 days. Phosphate-buffered saline containing AAV-hSyn-EGFP (1.4 × 10 11 vg/ml) was dripped onto the slices on DiV 1. Experiments were performed on DiV 12 to 19. For electroporation, pipettes were filled with intracellular solution including pCMV-tdTomato vector (100 ng/μl gift from Koyama R.) and attached to target cells. Stimulation was 200 electric pulses with a duration of 1 ms and an amplitude of 0.4 V at 200 Hz (54).

Virus injection and surgical procedures in vivo

Postnatal 8-week-old mice (male, C57BL/6J) were anesthetized by an intramuscular injection of ketamine (74 mg/kg) before the surgery. After the mice were anesthetized, a 2 × 4 mm craniotomy was performed over the left forelimb primary motor cortex (approximately 0.2 mm anterior and 1.0 mm lateral to the bregma) as previously described (55). Before virus injection, a pulled glass pipette (broken and beveled to a 25- to 30-μm outer diameter Sutter Instruments) and a 5-μl Hamilton syringe were back-filled with mineral oil (Nacalai Tesque) and front-loaded with virus solution. Layer 2/3 of the left forelimb primary motor cortex was stereotaxically targeted, and a total of 1 μl of AAV1-CaMKII-Cre (1.6 × 10 11 vg/ml) and AAV1-CAG-Flex-tdTomato (4.8 × 10 12 vg/ml) was injected at 0.02 μl/min using a syringe pump (KDS310). After injection, the pipette was maintained in place for 10 min and then slowly withdrawn. A 2-mm by 4-mm glass coverslip (#4 thickness Matsunami Glass) was pressed onto the brain surface, and its edges were sealed with dental cement. One week after virus injection, the mice were anesthetized with 1% isoflurane and used for recording and imaging. Before the experiment, the glass window was replaced with 3% agarose (w/v). A 3-mm by 3-mm glass coverslip (#1 thickness Matsunami Glass) was pressed onto the agarose surface, and its edges were sealed with a silicone elastomer (Kwik-Cast World Precision Instruments).

Multiphoton imaging and in vivo electrophysiology

Multiphoton images were acquired with an FVMPE-RS system (Olympus), a 25× water immersion objective lens (XLPLN25XSVMP2, Olympus), and a broadly tunable laser with a pulse width of 120 fs and a repetition rate of 80 MHz (InSight DS+ Dual, Spectra Physics) as previously described (56). The signals passed through emission filters of 410 to 455 nm or 495 to 540 nm (V30-FVG, Olympus) and were collected using a GaAsP photomultiplier tube (Hamamatsu Photonics). The frame acquisition rate was 1 frame/s, with two galvanometric scanning mirrors for the X y y axes. The pixel dwell time was 2 μs, and the size of the imaging fields was 512 × 512 pixels (0.994 μm per pixel for pipette imaging and 0.249 μm per pixel for in vivo imaging). To take pipette images, pipettes were filled with Milli-Q, and the images were z-stacked. For whole-cell recordings, pipettes were filled with intracellular solution containing 135 mM K-gluconate, 4.0 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.3 mM EGTA, 10 mM Na2-phosphocreatine, 4.0 mM MgATP, 0.3 mM Na2GTP, and 0.2% biocytin.

THG measurement

The light source was a regeneratively amplified femtosecond laser (Astrella1K-USP, Coherent Inc.) and an optical parametric amplifier (HE-TOPAS-Prime-UV2, Light Conversion Ltd.) operating at a wavelength of 1300 nm with a pulse duration of 80 fs at a repetition rate of 1 kHz. Attenuated laser pulses with less than 0.5 mW average power through the ND filter were focused onto the sample glass with a diameter of approximately 30 μm. The THG signals collinear to the incident beam were analyzed by a monochromator (SR163, Andor Technology) with a charge-coupled device camera (DU420LC-BU2, Andor Technology). The measurement was performed at room temperature.


Ver el vídeo: Qué es la fluorescencia y la fosforescencia? (Febrero 2023).