Información

Secuenciación de dos hebras de adn

Secuenciación de dos hebras de adn


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mi experiencia no es genética. 2. No me interesa saber cómo se realiza la secuenciación del ADN o el genotipado. 3. Solo me interesa la naturaleza de los resultados que se describen aquí.

Ahora, llegando a la pregunta: los seres humanos tenemos dos juegos de cromosomas en cada célula. Entonces, si digo secuenciar el cromosoma 1, ¿qué significa eso realmente? ¿Cuál de los dos cromosomas se secuencia? De la genotipificación, ¿la comparación tiene lugar entre dos + dos = cuatro cromosomas1? ¿O todo mi entendimiento es defectuoso?


Solo me interesa la naturaleza de los resultados que se describen aquí.

Al alinear esta secuencia con todos los nucleótidos de todos los organismos, nos daríamos cuenta de que la secuencia dada (corta) ocurre en varios organismos además de los humanos. Por lo tanto, podría provenir de una especie con un solo cromosoma, ver NCBI Blast.

Por el bien del ejemplo, supongamos que la especie tiene varias instancias de cada cromosoma (por ejemplo, una de la madre humana y otra del padre humano) y observe "los resultados como se describen aquí". Como no se dan detalles sobre el protocolo, asumamos además el escenario más común, es decir, que no hubo distinción o separación experimental de las instancias individuales de cromosomas.

Al observar los resultados, nos daríamos cuenta de que no se trata de "secuenciación de próxima generación", sino secuenciación de Sanger.

Ahora miramos el esquema proporcionado nuevamente (nota: esto no es datos experimentales reales): claramente, las bandas en el lado izquierdo solo ocurren para una letra / base, y en una posición dada de la secuencia, solo hay un pico muy claro en el lado derecho (en contraposición a la posibilidad de tener múltiples picos correspondientes a diferentes bases).

Tendríamos que concluir que cada instancia del cromosoma tiene una secuencia absolutamente idéntica. Por tanto, concluiríamos que no sería importante distinguir instancias individuales.

Pero espera, ¿no son diferentes los cromosomas maternos y paternos? Absolutamente, el ejemplo dado, sin embargo, solo mira 25 bases en lugar del cromosoma completo, y es muy posible que sean absolutamente idénticos. (nota: existen varias técnicas experimentales para seleccionar solo regiones específicas de ADN o ARN para el análisis).


Yo diría que su comprensión aquí no es necesariamente defectuosa, sino que se le está jugando un pequeño truco.

La figura muestra los resultados típicos de la secuenciación de Sanger. Este tipo de secuenciación siempre requiere un llamado cebador, una secuencia corta de alrededor de 20 bases que se conocen. Se secuenciará el código que sigue a esas 20 bases. Con esta técnica sola, prácticamente no se puede secuenciar un cromosoma completo; por lo general, solo es bueno para aproximadamente 700-1200 bases después del cebador.

Las bandas del gráfico de la izquierda y los picos del lado derecho corresponden a la base en la posición "cebador + n" (siendo n el número de bandas / picos que comienzan a contar en la parte inferior del gráfico).

Ahora considere que en la práctica, esta técnica se realiza en una muestra líquida que contiene, por supuesto, una gran cantidad de moléculas de ADN. En un escenario ideal, cada molécula es idéntica. En ese caso, la secuencia detrás de las 20 bases del cebador es idéntica y obtendrá bandas o picos claros como se muestra en el gráfico.

Cuando toma una muestra de un organismo como un humano, habrá una variedad de moléculas de ADN en la mezcla.

¿Qué se secuencia? Simple, todo lo que se encuentra detrás de la cartilla que estás usando para secuenciar. Si diferentes moléculas tienen diferentes secuencias allí, el resultado serán bandas en diferentes columnas en la misma posición en el gel (lado izquierdo del gráfico) o dos picos de diferentes colores en la misma ubicación en la cromatografía (lado derecho del gráfico) .

Ejemplo: genotipado

Consideramos el gen XYZ. Hay dos variantes de este gen en humanos, y la única diferencia está en la posición 167 del gen, donde una variante tiene una A y la otra una G. Gracias al proyecto del genoma humano, conozco la secuencia completa del gen XYZ. , así que diseño mi imprimación para abarcar las posiciones 50-70 de XYZ. Por lo tanto, mi resultado de secuenciación debería producir el gen XYZ, comenzando en algún lugar alrededor de la posición 100 (incluso las reacciones de secuenciación de mayor calidad pierden algunas bases después del cebador). Si tomo una muestra de un humano que tiene la misma variante XYZ en ambos cromosomas hermanos, solo obtendré un único resultado de secuenciación, ya sea con A o G en la posición ~ 67 de mi secuenciación. Si mi muestra proviene de un ser humano que tiene una variante en un cromosoma y la otra variante en el otro, mi secuenciación será ambigua en la posición ~ 67, y tras una inspección más cercana, secuenció dos variantes de esta muestra: una con una A y otra con una G en esta posición ambigua. De esta manera puedo determinar el genotipo humano de este gen: homocigoto XYZAUTOMÓVIL CLUB BRITÁNICO, XYZCAMA Y DESAYUNO o heterocigoto XYZA / B.

PD: No permita que la naturaleza de doble hebra del ADN confunda su pensamiento aquí, la secuenciación de Sanger siempre solo secuencia una hebra (para la que diseñó el cebador). Entonces, dos cromosomas hermanos = dos hebras dobles = cuatro hebras simples, de las cuales dos serán secuenciadas porque las otras dos contienen las secuencias complementarias.

PPS: la forma en que esto funciona puede causar grandes problemas si la imprimación no está diseñada correctamente. Con 20 bases, es posible que las mismas 20 bases aparezcan en otras partes del genoma y, de repente, las secuencias que siguen al cebador no solo son diferentes en una o dos posiciones, sino en todas partes.


Esa es una imagen de la secuenciación de Sanger. Si esa secuenciación se hubiera realizado en una región donde un organismo diploide fuera heterocigoto para un SNP simple, el archivo de seguimiento, en lugar de tener picos limpios únicos, tendría en el punto del SNP dos picos de dos colores de la mitad de tamaño para las dos letras presente en ese sitio. Si la diferencia entre los dos alelos fuera más complicada que un polimorfismo de un solo nucleótido, el archivo de seguimiento podría verse bastante diferente.

Entonces, si digo secuenciar el cromosoma 1, ¿qué significa eso realmente?

La gente no suele secuenciar un cromosoma completo como ese, y prácticamente nadie lo haría con la tecnología Sanger. Pero si estuviera secuenciando un organismo diploide no endogámico, esperaría que en los puntos de heterocigosidad se obtenga una mezcla de señales.

De la genotipificación, ¿la comparación tiene lugar entre dos + dos = cuatro cromosomas1?

Los organismos diploides tienen 2 copias de un cromosoma dado, no 4. Cada cromosoma tiene dos hebras, pero la información sobre las hebras complementarias es idéntica.


ACTUALIZAR


Antes de proceder a la secuenciación, debe considerar que no está secuenciando un solo cromosoma de una sola célula. Está secuenciando una muestra de ADN correspondiente a una población de células que contiene todos los cromosomas. No conozco un procedimiento para apuntar a un solo cromosoma, existen procedimientos dirigidos para regiones específicas en los genes que rodean el genoma.

¿O todo mi entendimiento es defectuoso?

Sí, yo diría que carece de defectos.

Dicho eso

Entonces, si digo secuenciar el cromosoma 1, ¿qué significa eso realmente?

Hipotéticamente, eso significaría que está secuenciando el ADN del cromosoma 1 correspondiente a una población de células. Lo que significa que está recuperando la secuencia del cromosoma 1 para su uso en el análisis posterior al polimerizar su secuencia de ADN complementaria aprovechando el procedimiento de replicación del ADN.

¿Cuál de los dos cromosomas se secuencia?

No hay forma de diferenciar entre dos cromosomas en los experimentos de secuenciación convencionales. La célula no tiene idea de qué cromosoma es cuál y tú tampoco, por lo que ambos cromosomas se secuencian al mismo tiempo. Tenga en cuenta que dije no hay forma de diferenciar entre dos cromosomas en los experimentos de secuenciación convencionales

¿Tiene lugar la comparación entre dos + dos = cuatro cromosomas1?

Esto tiene dos partes. ¿Qué quieres decir con cuatro? Si está insinuando que el cromosoma 1 tiene dos hebras y eso equivale a 4, entonces no, las dos hebras juntas forman un cromosoma. Su célula tiene 2n o dos cromosomas 1. Si está secuenciando una población de células (digamos 1000), tiene dos mil cromosomas 1 que se están secuenciando, todos los cuales están presentes en pares en 1000 células.

¿Se realizan comparaciones?

En los experimentos convencionales no comparamos. Dicho esto, existen métodos para diferenciar entre los dos cromosomas 1. El más antiguo que pude encontrar es un artículo de M. Nagano sobre secuenciación específica de alelos. En este caso, dado que tus padres contribuyen igualmente a tu ADN, cada uno de ellos porta algunas mutaciones específicas de su ADN. Con esta función podemos diferenciar entre el cromosoma 1 paterno y materno.

También hay secuenciación de una sola célula, en este caso estaría secuenciando los dos cromosomas 1 de una sola célula, teóricamente también puede realizar una secuenciación específica de alelos en una sola célula, lo que le permite diferenciar entre los dos cromosomas 1 presentes en la célula.

Finalmente, no hay forma de diferenciar las dos hebras, después de la secuenciación, cuando alinee sus datos con el genoma de referencia, llegará a conocer el varamiento de los datos.

Respuesta a la pregunta anterior


Hoy en día, la secuenciación de palabras es sinónimo de secuenciación de alto rendimiento, y el artículo al que vinculó en el comentario también se relaciona con técnicas de secuenciación de alto rendimiento (lo entendí de un vistazo rápido).

Al secuenciar el ADN, ¿cuál de las dos hebras se secuencia?

Ambos se secuencian.

¿En qué orden se proporcionan los resultados?

Aleatorio

mientras se secuencia, ¿cómo se secuencian estas dos cadenas?

Si se trata de una secuenciación de un solo extremo, no sabemos qué hebra se secuenció primero. (Hay formas, pero por simplicidad no vayamos allí)

Si se trata de una secuenciación final emparejada, una lectura se origina en la hebra de sentido y la otra lectura se origina en la hebra opuesta.

Puedes ver un video de youtube aquí para descubrir cuál es la diferencia

¿Es que el resultado de una hebra se proporciona primero y luego la otra o es que solo se secuencia una de las dos hebras?

Ambos se informan.

La pregunta que ha hecho es muy amplia, puedo continuar con un puñado de páginas A4 y aún no terminar. Al llegar a su primera pregunta, dije que ambos se secuenciaron, porque no tenemos forma de saber mientras secuenciamos qué hebra se secuencia (hay técnicas de secuenciación de cadenas, pero primero debe digerir lo que se menciona / enlaza aquí y luego con más la investigación vuelve con una pregunta sobre la secuenciación varada).

Después de la secuenciación, obtiene su resultado en orden aleatorio, porque lo que obtiene no es realmente un resultado, sino más archivos de datos sin procesar que se denominan archivos FASTQ. Lea un poco sobre FASTQ. Después de la secuenciación, realmente no obtiene un FASTQ, pero obtiene un BCL o un archivo de llamada base, que debe convertirse a FASTQ. Estos FASTQ deben filtrarse o no según la calidad y luego alinearse con un genoma de referencia. Aquí es donde puede saber qué lectura proviene de qué hebra.

Debería leer más sobre la secuenciación de un solo extremo y la secuenciación de extremos emparejados para comprender mejor cómo se secuencia el ADN. También mira este video. Esta es la versión más simplificada que pude encontrar. Debería despertar su curiosidad sin bombardearlo con demasiada información.

Por último, en una secuenciación de un solo extremo, no tiene forma de saber sin alineación qué hebra se secuenció, pero en el extremo emparejado (donde un fragmento de ADN se secuencia desde ambos extremos, generando dos lecturas emparejadas) generalmente, una pareja se alinea con el sentido hebra mientras que la otra se alinea con la hebra antisentido.


Ver el vídeo: Replicación del ADN (Febrero 2023).