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Empresas de síntesis de ADN: costo por base, tiempo de respuesta, algoritmos de optimización de codones

Empresas de síntesis de ADN: costo por base, tiempo de respuesta, algoritmos de optimización de codones


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Me gustaría sintetizar un gen de 3,4 kb (originalmente aislado de bacterias del suelo) y transformarlo en E. coli. Hay varias empresas (DNA2.0, GeneScript, BlueHeron) que sintetizarán el gen por usted. Me gustaría saber cómo se comparan estas empresas (u otras) entre sí en términos de:

  1. Optimización de codones: la mayoría de las empresas optimizarán la secuencia de codones y, por lo tanto, aumentarán la expresión de proteínas en el huésped deseado. Recientemente aprendí que existen diferentes algoritmos que se pueden aplicar. Lo que más me interesa es cómo se realiza la optimización de codones en las diferentes empresas y si existen algunas comparaciones directas de la expresión de proteínas entre ellas.

  2. costo por base: me gustaría encontrar el más barato. En general, el costo de la síntesis de genes generalmente depende del tamaño del fragmento, así como de la complejidad de la secuencia. Pero, por otro lado, DNA2.0 puede sintetizar un fragmento de 1 kb y un fragmento de 5 kb por el mismo precio.

  3. Tiempo de respuesta: ¿qué empresa sintetizará el fragmento más rápido? Creo que esto depende principalmente del tamaño. Por supuesto, tengo la opción de pedir 3 fragmentos de 1,1 kb y unirlos yo mismo, pero luego tengo que verificar la secuencia del producto final. Entonces, necesito encontrar la compensación.

Por favor, tenga en cuenta que no estoy preguntando por su empresa favorita, sino por características específicas de las empresas.


¿Estás trabajando en la academia? Podría valer la pena llamar a las empresas directamente y ver si hay una tarifa con descuento para su institución (es posible que otro laboratorio o departamento ya haya establecido algo).

No podrá obtener información sobre los diferentes algoritmos si son propietarios. Sin embargo, considerando que los datos de uso de codones son de conocimiento público y compartido, no puedo imaginar que los diferentes algoritmos sean tan diferentes. Creo que existen algunos trucos para elegir ciertos codones cerca del sitio de inicio de la transcripción en algunos organismos. Por lo que escuché, los algoritmos cambian constantemente. Podría decirte como mi E. coli El gen optimizado de GenScript funcionó hace dos años, pero probablemente lo diseñarían de manera diferente ahora.

De acuerdo, GenScript llama a su algoritmo "propietario", por lo que no comparte los detalles. DNA2.0 dice que su algoritmo está patentado, por lo que está disponible para su inspección. Publicaron un artículo PLOS sobre su E. coli algoritmo: Welch et al ..

Aunque, tal vez todo lo que hacen en estos días es escupir la secuencia de codones al azar:

Los resultados obtenidos en este estudio indican que el método de aleatorización de codones es una estrategia superior para la optimización de codones. Se obtuvo una mejora significativa en la expresión de proteínas para el proceso ampliamente establecido de producción de quimosina, lo que demuestra el poder de esta estrategia para reducir los costos de producción de enzimas industriales en huéspedes microbianos. (Menzella 2011)

Unir fragmentos sintetizados más pequeños funciona bien si tiene poco tiempo, pero suele ser más caro. Sin embargo, a veces estas empresas fijan precios especiales en síntesis por <1 kb, lo que hace que la costura sea una excelente opción. La respuesta es generalmente más rápida para tres fragmentos de 1 kb que para un fragmento de 3 kb.


Aquí hay una publicación de blog de Ginkgo BioWorks que muestra los tiempos de respuesta de 3 proveedores principales: http://blog.ginkgobioworks.com/2012/01/14/commercial-gene-synthesis/


Y aquí hay una publicación de blog de Reportergene que compara los precios reales, incluso si estoy de acuerdo con Mad Scientist en que la pregunta sobre el premio probablemente esté demasiado localizada.

http://www.reportergene.com/2011/08/gene-synthesis-review.html


Genómica sintética: potencial y limitaciones

Actualmente se encuentran disponibles tecnologías para ensamblar sintéticamente fragmentos de ADN del tamaño de un cromosoma, así como para permitir la realización de miles de cambios simultáneos en los genomas existentes. Estas capacidades se denominan colectivamente genómica sintética. Las implicaciones de la genómica sintética se extienden más allá de la vía limitada y la ingeniería genética del pasado para incluir la ingeniería o metabolismos completos, redes reguladoras e incluso ecosistemas. Sin embargo, para que se alcancen esos potenciales, se deben superar ciertas limitaciones y barreras. Estas barreras ya no incluyen la modificación y el ensamblaje del ADN, sino que se basan en los organismos limitados en los que funcionan muchos métodos de genómica sintética y el software limitado para diseñar secuencias genómicas personalizadas.

Gráficamente abstracto

Reflejos

► La genómica sintética puede extender la biología de laboratorio a organismos previamente intratables. ► El "arranque" del ADN sintético sigue siendo un factor limitante. ► Todavía se están desarrollando herramientas de diseño de software para genómica sintética.


DARPA SBIR HR001120S0019

NOTA: Las solicitudes y los temas enumerados en este sitio son copias de las diversas solicitudes de agencias SBIR y no son necesariamente las últimas y más actualizadas. Por esta razón, debe utilizar el enlace de la agencia que se indica a continuación, que lo llevará directamente al servidor de la agencia correspondiente, donde podrá leer la versión oficial de esta solicitud y descargar los formularios y las reglas correspondientes.

Temas de financiación disponibles

Rediseño, integración y defensa de la red mediante el modelado y análisis de sistemas eléctricos (GRIDMAPS)

OBJETIVO: El objetivo de GRIDMAPS es permitir la resiliencia crítica a largo plazo mediante el desarrollo de un programa de modelado de flujo de energía y conectividad que pueda: i) integrar datos en tiempo real con el panorama de la red dinámica y potencialmente reinfectada a medida que se somete a una limpieza cibernética incremental arriba ii) proporcionar retroalimentación operativa en tiempo real iii) crear datos relevantes que puedan informar rápidamente las decisiones y iv) ayudar en la restauración exitosa de instalaciones críticas.

El éxito de Black Start depende en gran medida del conocimiento de la situación en tiempo real y la capacidad de responder a la disponibilidad de elementos de la red durante un reinicio. Las respuestas a apagones inducidos por el ciberespacio tienen incertidumbres inherentes importantes que exigen flexibilidad. Específicamente, el desafío es identificar para su uso las rutas del sistema de energía disponibles que se encuentran solo al comprender la capacidad de energía y las limitaciones de flujo. Las herramientas flexibles en tiempo real que ayudan a comprender i) los estados del sistema de energía eléctrica, ii) las capacidades de suministro de energía de arranque en negro y iii) las ubicaciones de pivote alrededor de líneas de transmisión y distribución no disponibles mejorarán el potencial de éxito de manera exponencial para devolver la energía a los activos críticos.

Las herramientas necesarias no están destinadas a reemplazar las herramientas de análisis de estado heredadas, sino a ofrecer una capacidad de planificación y estimación de respuesta rápida para informar mejor las operaciones de arranque en negro. Específicamente, se sabe que las redes eléctricas después de un incidente cibernético no estarán disponibles en gran medida. El arranque negro comienza en los elementos más bajos con generadores individuales que alimentan los sistemas de distribución locales que migran un segmento a la vez a las subestaciones que alimentan energía a una capacidad de generación cada vez mayor. Esto, en efecto, restaura la red de una isla eléctrica a la vez y, finalmente, se combina en islas más grandes que alimentan cargas críticas.

El campo de pruebas se encuentra sacando el modelo del sistema con todos los elementos fuera de línea. Luego, encienda cada uno de ellos individualmente comenzando con los generadores de arranque negro, seguido de cada sección de distribución / subestación / transmisión a medida que se limpian y se liberan para su uso.

Los objetivos a largo plazo incluyen ayudar a desarrollar las mejores prácticas para escenarios de arranque en negro, lograr una respuesta más rápida a las fallas de la red eléctrica y ayudar a construir un marco de resiliencia nacional viable.

Este es un Directo a la Fase II ÚNICAMENTE.Los artistas deben demostrar conocimiento, habilidades y capacidad con los sistemas de energía, así como contingencia y análisis rápido para incluir condiciones de flujo de carga variable. Se requiere prueba de comprensión y capacidad para asimilar diagramas de sistemas de energía del tipo convencional, eléctrico y de sistemas. Se espera que los materiales de presentación y / o documentos técnicos, documentos técnicos, datos de prueba, diseños / modelos de prototipos y objetivos / resultados de rendimiento en sistemas de redes eléctricas y temas relacionados verifiquen el dominio del contenido requerido.

Para obtener información detallada sobre los requisitos y la elegibilidad de DP2, consulte la Sección 4.2, Requisitos de Directo a la Fase II (DP2) y el Apéndice B de HR001120S0019.

  • Ejecute un plan de investigación que incluya la definición de cómo ingerir el modelado del sistema existente (modelos de impedancia del sistema utilizados para los sistemas SCADA y EMS) al tiempo que permite las actualizaciones del estado actual del sistema.
  • En conjunto con los profesionales de las empresas de servicios públicos, desarrolle técnicas de modelado "¿Qué pasaría si ...?" Para respaldar las decisiones relacionadas con el enrutamiento de la red eléctrica deseada no disponible si la limpieza cibernética no tuvo éxito.
  • Desarrolle herramientas con la capacidad de ayudar en la restauración rápida de la red.
  • Desarrollar requisitos de productos para herramientas que puedan identificar las limitaciones del flujo de energía en función de los límites disponibles (por ejemplo, los límites actuales del generador o las líneas eléctricas) que respalden la toma de decisiones informada.
  • Desarrollar la capacidad en una plataforma distribuida móvil para aprovechar las operaciones de generación y servicios públicos, ya que los centros de datos y los grandes activos informáticos no estarían disponibles en una interrupción a gran escala.
  • Complete un plan de comercialización que aborde los costos relevantes de materiales, los posibles proveedores de materiales y equipos, la oportunidad de mercado y el posicionamiento anticipado, y la propiedad intelectual única.
  • Mes 2: informe sobre lecciones aprendidas, arquitecturas actualizadas, algoritmos y enfoques de aprendizaje
  • Mes 4: Informe sobre la adquisición de conjuntos de datos del mundo real de la Fase II, métricas de evaluación propuestas y resultados de análisis iniciales
  • Mes 6: informe provisional que describe el rendimiento del sistema del mundo real
  • Mes 8: informe provisional que cuantifica el rendimiento del sistema, comparándolo con enfoques alternativos de última generación que utilizan el aprendizaje automático, la teoría de control u otros métodos convencionales, y documenta las lecciones aprendidas
  • Mes 10: Demuestre la GUI para nuevos usuarios con capacidad sin ayuda para seleccionar entradas / salidas, informes y análisis.
  • Mes 12: Informe final de la Fase II que documenta las arquitecturas y algoritmos prototipo finales, los métodos, los resultados, las comparaciones con métodos alternativos y la cuantificación de la precisión, solidez y generalización.
  • Período de opción: si se ejerce, los hitos se revisarán para su consideración y modificación apropiadas.

FASE III: El apoyo principal será para el Departamento de Energía (DOE) y sus comunidades subsidiarias de la red eléctrica involucradas con la distribución, generación y transmisión, además de aquellas entidades que dependen de ellas. Los beneficios, cuando sean escalables, serán multifacéticos en todo el gobierno a través de estas entidades que proporcionan energía al DoD para incluir al DOE, el Consejo Coordinador del Subsector de Electricidad (ESCC) y todos los proveedores de energía comercial. La tecnología, en forma de herramientas cibernéticas, estaría disponible tanto para la generación de energía como para Las operaciones de servicios públicos se aprovechan como una capacidad fundamental que respalda la resiliencia de la red. No están destinadas a reemplazar las herramientas de análisis de estado heredadas, sino a ofrecer una mejor planificación de respuesta rápida y una capacidad de estimación a través de comentarios interactivos que informan mejor las operaciones de arranque en negro desde una perspectiva de amenaza en evolución. estas áreas del gobierno y la industria son fuentes probables de financiamiento de la Fase III.

PALABRAS CLAVE: Grid, Rediseño, Integración, Defensa, Modelado, Análisis, Power Systems, ciberseguridad, rapid, flow, conectores

[1] North American Electric Reliability Corporation (NERC), Glosario de términos utilizados en los estándares de confiabilidad de NERC, última actualización 24 de febrero de 2020, p. 16, https://www.nerc.com/files/glossary_of_terms.pdf

[2] NERC, "Acerca de las alertas", n.d., https://www.nerc.com/pa/rrm/bpsa/Pages/About-Alerts.aspx

[3] DOE, Manual de la industria eléctrica de Estados Unidos, julio de 2015, pág. 33, https://www.energy.gov/sites/prod/files/2015/12/f28/united-states-electricity-industry-primer.pdf

[4] Paul Stockton, Resilience for Grid Security Emergencies: Opportunities for Industry-Government Collaboration, 2018, https://www.jhuapl.edu/Content/documents/ResilienceforGridSecurityEmergencies.pdf

Replicando la complejidad del tejido humano para pruebas de alto rendimiento

ÁREA (S) DE TECNOLOGÍA: Bio Medical, Chem Bio Defense

OBJETIVO: Este SBIR mejoraría la detección de patógenos a partir de muestras complejas mediante el desarrollo de un sistema modelo fisiológicamente realista de alto rendimiento y bajo costo que demuestra la jerarquía del tejido humano y la heterogeneidad celular y, fundamentalmente, es compatible con microfluídicos de alta velocidad.

Los combatientes son viajeros, continuamente expuestos a nuevos entornos y nuevos patógenos. Es cada vez más probable que estos nuevos patógenos emerjan y se propaguen debido a los cambios en el medio ambiente, el aumento de la población mundial y la disponibilidad inmediata de viajes por todo el mundo. Esto requiere herramientas nuevas y mejoradas de alto rendimiento que puedan identificar nuevas amenazas, revelar cómo son patógenas y detectar posibles tratamientos.

Los sistemas de modelos actuales que pueden examinar las interacciones entre el huésped y el patógeno están limitados por el tiempo necesario para devolver una respuesta o por el nivel de complejidad inherente al sistema. Por ejemplo, si bien las células de cultivo de tejidos tienen un costo relativamente bajo y una respuesta de alta velocidad, no replican la complejidad del hospedador. Los modelos animales demuestran claramente respuestas fisiológicamente relevantes a un patógeno, pero también requieren mucho tiempo, dinero y, a menudo, una amplia adaptación o modificación para recapitular la enfermedad humana, lo que aumenta aún más los costos y las demoras. Los recientes esfuerzos que utilizan células humanas organizadas y diferenciadas para representar a un ser humano, como los organoides y las tecnologías de órgano en un chip, son prometedores para salvar estas brechas. Sin embargo, para ser útiles en la detección de nuevos patógenos, aún requieren un rendimiento mucho mayor y costos significativamente más bajos. DARPA busca tecnologías que eliminen el cuello de botella en la determinación de la patogenicidad de bacterias desconocidas al lograr la complejidad de un modelo in vivo al tiempo que igualan la velocidad y el rendimiento de los ensayos basados ​​en microfluidos.

  • Estar basado en células y tejidos humanos.
  • Preservar la diversidad y jerarquía celular
  • Demostrar respuestas diferenciales a patógenos similares a los modelos in vivo, produciendo más información que las células de cultivo de tejidos.

De particular interés sería un sistema que captura la diversidad genética de una población, en contraste con la diversidad limitada de líneas celulares inmortalizadas. Además, la tecnología desarrollada a través de este SBIR debe ser de alto rendimiento, capaz de probar al menos 1,000 interacciones patógeno / huésped en un día, tener la capacidad de replicar respuestas a nivel de tejido y ser miniaturizada para ensayos de plataforma de alto rendimiento. La tecnología debe estar disponible "a pedido" mediante la reconstitución a partir de existencias de células congeladas. Por último, la tecnología debe ser transferible a nuevos usuarios y adaptable a las tecnologías de alto rendimiento asociadas con la detección de patógenos y drogas.

La Fase I debería desarrollar tecnología que reproduzca la respuesta del huésped a al menos dos organismos patógenos y dos no patógenos. La complejidad del sistema debe superar la del cultivo de tejidos y representar una patogenicidad comparable a la de los modelos in vivo. Por último, los proponentes deben identificar conceptos y métodos para escalar para pruebas de alto rendimiento y proporcionar un plan para la implementación práctica de la tecnología propuesta.

  • Mes 1: Informe que compara la tecnología en desarrollo con un modelo de células de cultivo de tejidos relevante y fenotipos de modelos humanos e in vivo reales o reportados utilizando especies patógenas bacterianas relevantes para los tejidos & ge3.
  • Mes 3: Informe de estudios para identificar y definir marcadores diferenciales de susceptibilidad del hospedador consistentes con el establecimiento de metas de desempeño.
  • Mes 4: Demuestre e informe un ensayo prototipo que pueda diferenciar las bacterias patógenas de las no patógenas con la cuantificación de la tasa de error, la señal y el ruido.
  • Mes 5: Informe provisional que compara la respuesta al patógeno entre las células antes y después de la congelación-descongelación.
  • Mes 6: Informe final de la Fase I que resume la comparación de enfoques de cómo la respuesta de la tecnología replica la complejidad del hospedador de manera significativa en comparación con la comparación de células de cultivo de tejidos con otra metodología de vanguardia cuantificación de la precisión cuantificación de la robustez a errores, ruido y modelo o evaluación de los límites requeridos para alcanzar las metas de desempeño.

La Fase II se enfocará en avanzar en el desempeño de la tecnología, aumentando la amplitud de marcadores de hospedante / patógeno, demostrando un rápido despliegue de tecnología al recibirla y escalando la tecnología para su comercialización. El resultado de este SBIR será un prototipo que podría probarse fácilmente para un análisis de alto rendimiento y para facilitar la operación en un laboratorio separado. Los proponentes deben demostrar el mérito comercial y la viabilidad de la tecnología que se difundirá a los usuarios intermedios.

El sistema definitivo debe demostrar la capacidad de identificar las respuestas del huésped a los patógenos con un rendimiento de prueba de al menos 1000 patógenos / día. Además, la tecnología debe demostrar la capacidad de pasar rápidamente de métodos de conservación congelados u otros a procesar al menos 5.000 patógenos en una semana.

El año de opción de la Fase II implicaría trabajar con socios académicos o comerciales para demostrar la tecnología.

  • Mes 2: Informe de nuevas capacidades, que identifica adiciones y modificaciones que serán investigadas, desarrolladas y personalizadas para su incorporación en la demostración piloto.
  • Mes 4: Informe de decisión provisional sobre la tecnología de marcadores que describe las fortalezas y debilidades relativas de los informantes seleccionados, y los resultados de las pruebas que demuestran su capacidad para cumplir con los objetivos de rendimiento.
  • Mes 12: Demuestre y entregue un informe para un sistema prototipo que pueda identificar al menos 3 respuestas de huésped / patógeno relevantes para la búsqueda de nichos, la evasión del sistema inmunológico o la degradación de membranas y que sea compatible con el procesamiento de muestras de alto rendimiento y la toma de decisiones para al menos 3 patógenos relevantes para el tejido diana.
  • Mes 15: Informe que describe el examen de tipos de tejido adicionales para la expansión de la tecnología, incluido el examen de la diversidad y jerarquía celular y la comparación de la capacidad para diferenciar patógenos y no patógenos.
  • Mes 18: Informe sobre la demostración de la tecnología con modelos de al menos 3 tipos de tejidos más relevantes derivados de al menos 3 tejidos más distintos genéticamente.
  • Mes 24: Demuestre y entregue un informe para un sistema prototipo que pueda identificar al menos 10 respuestas de las células huésped a un patógeno. El enfoque debe ser compatible con el procesamiento de muestras de alto rendimiento, debe demostrar una variedad de respuestas y debe provenir de interacciones con al menos 3 patógenos relevantes para el tejido objetivo.

Opción de fase II El año de opción de fase II se centraría en mejorar el rendimiento trabajando con socios académicos o comerciales para aumentar la cantidad de tejidos que se pueden desplegar y la velocidad con la que se pueden emplear. La tecnología también debe refinarse y escalarse para su comercialización.

  • Mes 30: Informe sobre la demostración exitosa de la tecnología por parte de un equipo sin experiencia previa con la tecnología. Una demostración exitosa identificaría una interacción biológica revelada por la construcción multicelular que no se ve en células individuales o en cultivos de células inmortalizadas.
  • Mes 36: Informe sobre la demostración exitosa de la tecnología por parte de un equipo sin experiencia previa con la tecnología. Una demostración exitosa identificaría al menos 3 interacciones biológicas diferentes reveladas por la construcción multicelular que no se ve en células individuales o en cultivos de células inmortalizadas. La prueba debe realizarse en el dispositivo prototipo utilizando componentes entregados y almacenados de manera consistente con la comercialización futura, como descongelarlos de existencias que habían sido congeladas y enviadas.

FASE III: Los clientes potenciales incluyen agencias gubernamentales con intereses en la detección de patógenos de alto rendimiento, así como otros socios gubernamentales y no gubernamentales que trabajan en áreas que van desde la investigación básica hasta las aplicaciones clínicas. La tecnología desarrollada puede transferirse directamente como herramientas o terapias avanzadas, o licenciarse como propiedad intelectual para acelerar el desarrollo de terapias avanzadas por parte de otros.

PALABRAS CLAVE: Detección de patógenos de alto rendimiento Complejidad de tejidos Jerarquía celular Modelos in vivo alternativos

[1] Simian, M. y Bissell, M. Organoids: una perspectiva histórica del pensamiento en tres dimensiones. Revista de biología celular. (2017) 216 (1): 31-40. DOI: 10.1083 / jcb.201610056

[2] Fatehullah, A., Tan, H.S. y Barker, N. Organoids como modelo in vitro de desarrollo humano y enfermedad. Biología celular de la naturaleza. (2016) 18 (3): 246-254. DOI: 10.1038 / ncb3312

Fabricación de novo rápida y flexible de moléculas de ADN para biología sintética y aplicaciones terapéuticas

ÁREA (S) DE TECNOLOGÍA: Bio Medical, Chem Bio Defense

OBJETIVO: Desarrollar una capacidad de fabricación de ADN sintético de novo rápida y rentable.

Existe una necesidad crítica del Departamento de Defensa de poder sintetizar rápida y eficientemente construcciones de ADN de longitud de pares de kilobase (kb) de alta precisión para contramedidas médicas y aplicaciones de biología sintética. ADN sintético y la generación, manipulación y entrega oportunas de construcciones genéticas. La producción actual de ADN sintético es costosa, requiere mucho tiempo y requiere equipo y conocimientos técnicos altamente especializados. En consecuencia, pocos proveedores comerciales son capaces de producir ADN sintético con una longitud adecuada para las tecnologías DARPA (es decir,> 2500 pares de bases (pb)) en el tiempo de respuesta de días requerido para una respuesta rápida. Primero, debido a la base de capacidad limitada, las fuentes comerciales experimentan un retraso significativo en los servicios de producción de ADN sintético, lo que amplía los plazos de I + D que dependen de productos codificados por genes y aumenta los costos para el consumidor. En segundo lugar, los métodos actuales para la síntesis o el ensamblaje de construcciones de longitud de kilobase son a menudo propensos a errores, lo que requiere purificación manual y / o pasos de análisis para lograr el producto final. En tercer lugar, a medida que aumenta la demanda de producción de ADN sintético, cualquier aumento de rendimiento logrado deberá mantener o incluso disminuir el costo por par de bases.

Las propuestas de la Fase I deberían hacer avanzar la ciencia de la síntesis de ADN de novo y desarrollar una plataforma capaz de generar oligonucleótidos con suficiente precisión de secuencia, longitud, diversidad y cantidad para el ensamblaje aguas abajo en fragmentos de longitud completa. Para avanzar de los esfuerzos de la Fase I a la Fase II, los participantes deben demostrar el ensamblaje del producto final (> 2500 pb) a partir de sus oligonucleótidos sintetizados utilizando una metodología disponible comercialmente o un método de ensamblaje de ADN patentado y novedoso. Las propuestas Directas a la Fase II deben incluir el desarrollo tanto de la síntesis de ADN de novo como de las plataformas de ensamblaje.

  • Fase I: La plataforma de síntesis de ADN de novo debe tener la capacidad de sintetizar, en dos semanas, una cantidad suficiente de oligonucleótidos> 150 pb con una precisión> 99%, que, una vez ensamblados, generarían al menos 96 fragmentos únicos> 2500 pb ( por ejemplo, el ensamblaje de 96 secuencias únicas de 2500 pb requeriría 1.600 oligonucleótidos de 150 pb o 960 oligonucleótidos de 250 pb)
  • Transición de la Fase I a la Fase II: El ensamblaje del producto final debe demostrarse utilizando un método de ensamblaje disponible comercialmente o un método de ensamblaje novedoso y patentado 96 productos únicos de 2.500 pb ensamblados con una precisión del 99% después de aplicar las metodologías de corrección de errores
  • Fase I y II: la precisión del producto debe determinarse utilizando una tecnología de secuenciación
  • Fase I y II: los reactivos no deben ser peligrosos e idealmente acuosos
  • Fase II: el costo por nucleótido en el producto final debe ser 99%> 99%> 99%

Plataforma de síntesis de ADN de novo: los participantes desarrollarán una plataforma de síntesis de ADN rápida de novo capaz de generar oligonucleótidos de más de 150 pb de longitud con una precisión de> 99% .Los productos de oligonucleótidos deben producirse en cantidades suficientes para el ensamblaje posterior y la corrección de errores en plantillas más grandes, aunque no se requiere innovación en el ensamblaje de ADN en la Fase I. Específicamente, la plataforma de síntesis de ADN de novo debe producir suficiente producto en un plazo de producción de dos semanas para permitir el ensamblaje de 96 fragmentos únicos> 2500 pb. los participantes deben demostrar la capacidad de la plataforma para producir estos oligonucleótidos basados ​​en objetivos definidos por DARPA en menos de dos semanas. Los participantes deben demostrar adicionalmente el ensamblaje de los oligonucleótidos en 96 productos de ADN únicos> 2500 pb utilizando un método patentado comercialmente disponible o novedoso.

Programación / Hitos / Entregables para la plataforma de síntesis de ADN de novo Entregables de la fase I: Diseño de prototipo básico de la plataforma de síntesis de ADN de novo y método de ensamblaje asociado en un informe final que debe incluir: (1) métricas de desempeño del prototipo (2) resultados de la demostración de capacidad (3) métodos propuestos para escalar la síntesis de ADN de novo hacia niveles de producción capaces de generar más de 192 secuencias únicas en una semana y (4) evaluación competitiva del mercado.

Los planes para la Fase II deben incluir objetivos de diseño de optimización e hitos tecnológicos clave para escalar no menos de 192 o más moléculas de ADN únicas de 2500 bp u oligonucleótidos equivalentes para ensamblar en una semana.

Los proponentes interesados ​​en presentar una propuesta Directo a la Fase II (DP2) deben proporcionar documentación de la plataforma de ensamblaje Y síntesis de ADN de novo para corroborar que se ha cumplido con el mérito científico y técnico y la viabilidad descritos anteriormente y se describen las posibles aplicaciones comerciales. La documentación debe incluir toda la información relevante, incluidos, entre otros: informes técnicos, datos de prueba, diseños / modelos de prototipos y objetivos / resultados de rendimiento. Para obtener información detallada sobre los requisitos y la elegibilidad de DP2, consulte la Sección 4.2, Requisitos de Directo a la Fase II (DP2) y el Apéndice B de HR001120S0019.

  • Mes 1: Reunión de lanzamiento e informe inicial sobre el estado de la metodología de síntesis de ADN de novo y el enfoque para cumplir con los requisitos de la fase I
  • Mes 6: Demostrar capacidad para sintetizar> 150 oligonucleótidos de pares de bases con> 99% de precisión Demostrar el ensamblaje inicial de esos oligonucleótidos en moléculas de ADN más largas
  • Mes 11: Demostrar la capacidad de escalar la síntesis de oligonucleótidos para su ensamblaje en 96 moléculas de ADN únicas de más de 2500 pares de bases de longitud en dos semanas.
  • Mes 12: Informe final de la fase I que resume el informe del enfoque de síntesis de ADN de novo que resume la capacidad de ensamblar 96 secuencias de ADN únicas de más de 2500 pares de bases de longitud utilizando una metodología patentada comercialmente disponible o novedosa.

Plataforma de síntesis y ensamblaje de novo: Desarrollar y demostrar una plataforma multiplexada flexible para la síntesis rápida de novo de moléculas de ADN basada en el prototipo básico desarrollado durante la Fase I.La plataforma debe permitir la síntesis de novo a escala de al menos 192 secuencias de genes únicas de al menos 2.500 pb. Al final de la Fase II, los participantes demostrarán la viabilidad de producir 192 secuencias de ADN únicas basadas en objetivos definidos por DARPA en una semana.Las secuencias producidas para cada hito en esta fase deben tener una precisión de más del 99% y menos de .03 por nucleótido. .

Entregables de la Fase II: Prototipo de trabajo del sistema multiplexado y un informe final que incluye: (1) métricas de desempeño del sistema (2) resultados de la demostración de capacidad y (3) proyecciones de rendimiento y costos de fabricación a escala comercial.

    Mes 13: Demuestre la capacidad de sintetizar y ensamblar al menos 96 secuencias de ADN únicas de más de 2500 pares de bases con una precisión de más del 99% en dos semanas y cerrar

Diseño de biosensor acelerado por IA

ÁREA (S) DE TECNOLOGÍA: Bio Medical, Chem Bio Defense

OBJETIVO: Aplicar inteligencia artificial (IA) para acelerar el diseño de biomarcadores de ingeniería altamente específicos para la detección rápida de virus.

DESCRIPCIÓN: Este SBIR busca aprovechar las tecnologías de IA para acelerar el desarrollo de biosensores basados ​​en aptámeros que se unen específicamente a estructuras biomoleculares. Los aptámeros son secuencias cortas de ácidos nucleicos monocatenarios capaces de unirse a estructuras biomoleculares tridimensionales de forma similar a los anticuerpos. Los aptámeros tienen varias ventajas en comparación con los anticuerpos, que incluyen una vida útil prolongada, estabilidad a temperatura ambiente, inmunogenicidad baja o nula y bajo costo. Los diseños actuales de aptámeros de última generación se basan en gran medida en enfoques in vitro como SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) y sus variaciones avanzadas. SELEX es un proceso cíclico que implica múltiples rondas de selección y amplificación sobre un gran número de candidatos (> 10 ^ 15). La naturaleza iterativa y experimental de SELEX hace que la obtención de candidatos a aptámeros requiera mucho tiempo (de semanas a meses), y la probabilidad general de obtener finalmente un aptámero útil es baja (30% -50%). Intentos de mejorar el rendimiento del SELEX original El proceso generalmente resulta en un aumento de la complejidad del sistema y el costo del sistema, así como una mayor demanda de experiencia en dominios especiales para su uso. Además, una gran cantidad de parámetros pueden influir en el proceso SELEX. Por lo tanto, este es un dominio que está listo para la IA. La investigación reciente de IA ha demostrado el potencial de las tecnologías de aprendizaje automático para codificar el conocimiento del dominio para restringir significativamente el espacio de solución de problemas de búsqueda de optimización, como la resolución de problemas inversos biomoleculares. En consecuencia, tales técnicas in silico ofrecen el potencial de proporcionar una alternativa rentable para hacer que el proceso de diseño de aptámeros sea más confiable y, por lo tanto, más eficiente. Este SBIR busca aprovechar las tecnologías de IA emergentes para desarrollar una capacidad de diseño de aptámeros asistidos por IA basada en escritorio que acelera la identificación de aptámeros de alto rendimiento para detectar nuevos antígenos biológicos.

FASE I: Esta SBO está aceptando propuestas Directas a la Fase II ÚNICAMENTE. Los proponentes deben demostrar la viabilidad de un prototipo de algoritmo que pueda ayudar al diseño in vitro de apatmeros con un potencial de unión mejorado con respecto a los enfoques in vitro de referencia. Dicho prototipo de algoritmo debe demostrar la capacidad de un aptámero diseñado para la detección de una proteína / péptido único con alta afinidad (la constante de disociación de equilibrio, K_d 1015) y puede lograr el objetivo eficiente en el tiempo de la Fase II.

El esfuerzo de la Fase II se centrará en mejorar el rendimiento del algoritmo computacional y mejorar la eficiencia computacional para que pueda implementarse con recursos informáticos de escritorio y escalarse a espacios de búsqueda muy grandes (número de candidatos de secuencia> 1015). La Fase II también desarrollará un proceso de integración que combina los algoritmos in silico con procesos in vitro que mejoran significativamente la consistencia y autonomía del diseño. Se requiere la colaboración de un diseñador de aptámeros in vitro. El enfoque combinado demostrará la identificación rápida de biosensores de aptámeros prometedores (en días frente a semanas / meses requeridos solo para enfoques in vitro) para la detección de agentes biológicos en todas las clases de proteínas / péptidos diana, con la probabilidad de identificar con éxito una alta afinidad (KD Cerrar

Criptografía para arquitecturas de hiperescala en una Internet de las cosas robusta (CHARIOT)

OBJETIVO: CHARIOT desarrollará enfoques revolucionarios para operaciones criptográficas rápidas, eficientes y resistentes a los cuánticos para dispositivos de Internet de las cosas (IoT). Deben demostrarse las comunicaciones confidenciales, la integridad de los mensajes, la pertenencia a grupos y la gestión de claves escalable.

Las mejoras exponenciales de precio / rendimiento en la tecnología de semiconductores derivadas de la Ley de Moore están permitiendo que incluso los dispositivos más pequeños y más específicos de la aplicación, como sensores y actuadores, incluyan capacidades de red. La inmensa mayoría de estos dispositivos serán baratos y tendrán limitaciones de energía. Los bajos costos de los dispositivos permiten la implementación en cantidades sin precedentes, con algunas estimaciones de hasta un billón de dispositivos, que para CHARIOT llamamos "hiperescala". El soporte para la comunicación entre dichos dispositivos en, o usando, redes inalámbricas 5G los hace "hiperconectados" y, en conjunto, forman lo que se llama Internet de las cosas (IoT).

Se necesitan tecnologías de seguridad revolucionarias para los dispositivos de IoT. La aparición de la criptografía de clave pública, como el esquema RSA (Rivest-Shamir-Adleman) basado en la dureza de la factorización, utilizó conceptos teóricos numéricos para derivar protocolos para comunicaciones confidenciales, verificación de identidad con firmas digitales, verificación de integridad de mensajes con hash seguro. , etc. Sin embargo, surge un desafío logístico, ya que estos protocolos presumen la legitimidad de la clave pública utilizada. Si bien no existe una infraestructura de clave pública universal (PKI), la legitimidad ahora está "certificada" mediante una secuencia de firmas digitales a partir de una autoridad confiable como el Departamento de Defensa.

Se espera una vida útil de implementación de más de 10 años para algunos tipos de dispositivos de IoT. Hoy en día, la energía (como la energía de la batería) consumida por las operaciones criptográficas reduce la vida útil de la implementación, lo que desalienta a los fabricantes a incluir la seguridad. Además, el algoritmo de Shor, que utiliza la computación cuántica para acelerar la factorización, socava el modelo de seguridad de la criptografía basada en RSA. La computación cuántica puede aparecer antes de que terminen las implementaciones actuales. dispositivos.

CHARIOT creará un prototipo de técnicas criptográficas post-cuánticas de bajo costo y poco espacio con un uso mínimo de energía para dispositivos en un IoT.Los requisitos técnicos deben tener su génesis en los casos de uso esperados.Usos integrados en vehículos y portátiles con una arquitectura de red de confianza cero. son de particular interés, por ejemplo, usos dentro de un escenario más amplio de pasajeros equipados con dispositivos portátiles que entran, viajan y salen de un vehículo como un transporte de tropas o un autobús escolar.

  1. informes técnicos que describen los resultados y las conclusiones del trabajo existente, en particular con respecto a la oportunidad comercial o la oportunidad de inserción del Departamento de Defensa, y las evaluaciones de riesgos / mitigaciones
  2. materiales de presentación y / o libros blancos
  3. papeles tecnicos
  4. datos de prueba y medición
  5. diseños / modelos de prototipos
  6. proyecciones de rendimiento, metas o resultados en sistemas a múltiples precios y,
  7. documentación de temas relacionados, como cómo la solución CHARIOT propuesta puede permitir la creación de redes de confianza cero.

Esta recopilación de material verificará el dominio del contenido requerido para la consideración de DP2.

Los proponentes de DP2 también deben demostrar conocimientos, habilidades y capacidad en ciberseguridad, aplicaciones criptográficas avanzadas, informática, matemáticas e ingeniería de software.

Para obtener información detallada sobre los requisitos y la elegibilidad de DP2, consulte la Sección 4.2, Requisitos de Directo a la Fase II (DP2) y el Apéndice B de HR001120S0019.

  1. describir un diseño / arquitectura propuestos para lograr estos objetivos, junto con interfaces de programación de aplicaciones que permitan un ecosistema de IoT seguro (por ejemplo, uno basado en principios de confianza cero)
  2. presentar un plan para la maduración de la arquitectura en un sistema prototipo para demostrar comunicaciones confidenciales, integridad de mensajes, pertenencia a grupos y administración de claves escalables y,
  3. detallar un plan de prueba, completo con las métricas y el alcance propuestos (por ejemplo, estructura de la red, tipos / números de dispositivos, etc.), para la verificación y validación de la criptografía del sistema.

La Fase II culminará con una demostración del sistema utilizando uno o más casos de uso de IoT convincentes consistentes con oportunidades comerciales y / o inserción en el programa DARPA / I2O Open Programmable Secure 5G (OPS-5G).

El siguiente programa de hitos y entregables se proporciona para establecer las expectativas y los resultados / productos finales deseados para el esfuerzo de la Fase II.

Calendario / Hitos / Entregables Durante la Fase II, los proponentes ejecutarán el plan de Investigación y Desarrollo (I + D) como se describe en la propuesta.

  • Mes 1: Reunión informativa inicial de la Fase II (con diapositivas anotadas) para el Director de Proyectos de DARPA (en persona o virtual, según sea necesario) que incluye: cualquier actualización del plan propuesto y el enfoque técnico, riesgos / mitigaciones, cronograma (incluidas las dependencias) con hitos de capacidad y entregables, métricas propuestas y plan para la demostración / validación de prototipos.
  • Meses 4, 7, 10: Informes trimestrales de progreso técnico que detallan el progreso técnico realizado, las tareas realizadas, los principales riesgos / mitigaciones, un plan técnico para el resto de la Fase II (aunque normalmente se informará el progreso con respecto al plan detallado en la propuesta o presentado en En la sesión informativa inicial, se entiende que los descubrimientos científicos, la competencia y los cambios regulatorios pueden tener un impacto en el trabajo planificado y se debe informar a DARPA de cualquier revisión que resulte), actividades planificadas, resúmenes de viajes y cualquier problema potencial o área problemática. que requieren la atención de la DARPA PM.
  • Mes 12 Informe de progreso técnico intermedio (con diapositivas anotadas) al director de proyectos de DARPA (en persona o virtual según sea necesario) que detalla el progreso realizado (incluye una evaluación cuantitativa de la capacidad desarrollada hasta la fecha), tareas realizadas, principales riesgos / mitigaciones, actividades planificadas y plan para la segunda mitad de la Fase II, el plan de demostración / verificación para el final de la Fase II, resúmenes de viajes y cualquier problema potencial o área problemática que requiera la atención del PM de DARPA.
  • Mes 15, 18, 21: Informes trimestrales de progreso técnico que detallan el progreso técnico realizado, las tareas realizadas, los principales riesgos / mitigaciones, un plan técnico para el resto de la Fase II (con las actualizaciones necesarias como en el comentario entre paréntesis para los meses 4, 7 y 10 ), actividades planificadas, resúmenes de viajes y cualquier problema potencial o área problemática que requiera la atención del PM de DARPA.
  • Mes 24 / Fase final II Entregables: arquitectura de seguridad con detalles documentados de administración de claves, demostrando comunicaciones seguras entre múltiples subgrupos independientes y superpuestos, interfaces de programación de aplicaciones documentadas cualquier otra documentación necesaria (incluyendo, como mínimo, manuales de usuario y un documento de diseño detallado del sistema y el plan de comercialización de fin de fase).

El trabajo de la Fase III estará orientado hacia la transición y comercialización de la tecnología de seguridad desarrollada. El proponente debe obtener financiación del sector privado, de una fuente gubernamental que no sea SBIR, o de ambos, para desarrollar el prototipo de software en un producto viable o un servicio que no sea de I + D para la venta en los mercados del sector militar o privado. La Fase III se refiere al trabajo que deriva de, extiende o completa un esfuerzo realizado bajo acuerdos previos de financiamiento SBIR, pero es financiado por fuentes distintas al Programa SBIR.

El apoyo primario de CHARIOT será a los esfuerzos nacionales para desarrollar enfoques para proteger la infraestructura y las tecnologías de la red (por ejemplo, 5G). Los resultados tienen el potencial de beneficiar significativamente al Departamento de Defensa y a numerosas entidades comerciales al proporcionar capacidades protegidas y resistentes. Específicamente, en el espacio comercial, las tecnologías de seguridad CHARIOT tienen aplicaciones para empresas que desarrollan entidades digitales (por ejemplo, redes, nubes, dispositivos que participan en el IoT, etc.) en el espacio DoD, las tecnologías de seguridad CHARIOT tienen valor para todos los Componentes del Servicio debido a el uso generalizado y la migración a tales entidades digitales para apoyar las operaciones de la misión.

PALABRAS CLAVE: Internet de las cosas (IoT), gestión de claves, seguridad post-cuántica, dispositivos conectados a 5G, compromiso digital seguro, arquitecturas de confianza cero, criptografía de sistemas


INTRODUCCIÓN

La producción de proteínas recombinantes es un requisito previo esencial para la producción rentable y versátil de productos biológicos complejos que se pueden usar como andamios para mostrar proteínas y péptidos que pueden representar epítopos antigénicos de patógenos, incluidos virus que causan enfermedades infecciosas. Los virus se caracterizan por una capa proteica que encierra y protege el material genético viral que se libera y se replica tras la infección del organismo de la célula huésped. El sistema inmunológico del huésped típicamente monta su defensa contra las estructuras patógenas de la superficie que representan los epítopos antigénicos con el objetivo de derrotar y eliminar al patógeno. Desde el principio, se reconoció que la administración de tales epítopos antigénicos, por ejemplo en forma de especies patógenas virales inactivadas por calor, puede dar como resultado respuestas protectoras que preparan el escenario para las vacunaciones, posiblemente la intervención más exitosa en términos de salvar vidas humanas hasta la fecha. Una alternativa atractiva a la administración de virus inactivados o atenuados se deriva de la producción recombinante de la cubierta proteica, o partes de ella, lo que da como resultado partículas similares a virus (VLP). Las VLP pueden ser físicamente similares o incluso idénticas a los virus vivos, pero carecen de información genética y, por lo tanto, son seguras, ya que la replicación no puede ocurrir. Las VLP se utilizan para la vacunación contra una variedad de enfermedades infecciosas, incluida la influenza y las neoplasias malignas basadas en infecciones virales, como el cáncer de cuello uterino causado por el virus del papiloma (Charlton & Lua, 2017 Cox & Hollister, 2000 Jeong & Seong, 2017 Pouyanfard & Müller, 2017 Schiller & Lowy, 2006 Temchura y Überla, 2017).

Escherichia coli es en general el sistema dominante para la expresión de proteínas recombinantes en biología molecular; sin embargo, los productos biológicos complejos, como las VLP, a menudo no se pueden expresar de manera eficiente en E. coli debido a una plétora de razones, incluidas modificaciones postraduccionales o maquinarias de plegado especializadas que no están presentes en E. coli pero qué sistemas de expresión eucariotas pueden permitirse (Nettleship et al., 2015 Nettleship, Assenberg, Diprose, Rahman-Huq y Owens, 2010 Nie et al., 2009 Nie et al., 2016 Vijayachandran et al., 2011).

El sistema de vector de expresión de baculovirus (BEVS) ha surgido como una tecnología particularmente poderosa para la producción de proteínas biológicas complejas que son auténticamente dirigidas y modificadas postraduccionalmente, incluida la formación de enlaces disulfuro y la glicosilación. Desarrollamos MultiBac, un sistema de expresión modular basado en baculovirus particularmente adecuado para producir eficientemente conjuntos de proteínas desafiantes para una amplia gama de aplicaciones, como nosotros y otros hemos descrito con considerable detalle (por ejemplo, Barford, Takagi, Schultz y Berger, 2013 Berger et al., 2013 Berger, Fitzgerald y Richmond, 2004 Bieniossek, Imasaki, Takagi, y Berger, 2012 Bieniossek, Richmond y Berger, 2008 Fitzgerald et al., 2006 Fitzgerald et al., 2007 Nie et al., 2009 Sari et al. al., 2016 Trowitzsch, Bieniossek, Nie, Garzoni y Berger, 2010 Trowitzsch, Palmberger, Fitzgerald, Takagi y Berger, 2012 Vijayachandran et al., 2011). MultiBac ha sido ampliamente adoptado en la academia y la industria, acelerando la investigación y el desarrollo en todo el mundo, con el enfoque en los últimos años cambiando a personalizar el sistema para tareas especializadas que incluyen, por ejemplo, la producción de glicoproteínas humanizadas (Palmberger, Klausberger, Berger y Grabherr, 2013 Palmberger, Wilson, Berger, Grabherr y Rendic, 2012), expansión del código genético (Koehler et al., 2016) o entrega de ADN multifuncional en células y tejidos de mamíferos y humanos, entre otros (Aulicino, Capin y Berger, 2020 Mansouri et al., 2016 Sari et al., 2016).

En este artículo, describimos VLP-factory ™, un sistema MultiBac personalizado que está diseñado para la expresión de alto nivel de VLP basado en la proteína de la cápside de la influenza M1. Un gen que codifica M1 de la cepa de influenza H1N1, así como un gen que codifica la proteína fluorescente mCherry para monitorear el curso de la amplificación del virus y la producción de VLP en el cultivo celular, se integraron en el esqueleto viral (Fig. 1). Una serie de VLP de la influenza que incluyen conjuntos de mutaciones en un dominio potencialmente inmunosupresor (ISD) dentro de la proteína de superficie de la influenza hemaglutinina (HA) se produjo de manera eficiente utilizando VLP-factory ™. Se descubrieron ISD en retrovirus, y la evidencia sugiere que la influenza HA también comprende un ISD que se superpone con su segmento de péptido de fusión, lo que potencialmente impacta en las respuestas inmunes innatas en macrófagos y células dendríticas (Bahrami, Laska, Pedersen y Duch, 2016 Holm et al., 2012). El ISD está ubicado en la parte estructuralmente sensible de HA, que es fundamental para la fusión de membranas. Por lo tanto, cualquier diseño en esta parte que aboliera la supresión inmunológica y mejore la antigenicidad necesitaría ser cuidadosamente elaborado para mantener la funcionalidad de HA en la fusión de membranas. Para identificar tales mutantes, se requirió una serie de VLP de influenza que contengan aminoácidos aleatorizados en ciertas posiciones en el ISD (Sari-Ak et al., 2019). Las variantes de VLP de influenza resultantes (mutantes HA o HA ISD de tipo salvaje) pueden probarse funcionalmente para determinar la actividad de fusión de membranas in vitro, así como la actividad inmunosupresora in vivo en modelos animales. Sería muy útil tener VLP de influenza que contengan mutaciones ISD para su uso como antígenos hiperinmunogénicos basados ​​en VLP que podrían representar vacunas de influenza de protección fuerte y amplia. Las mutaciones de ISD que comprenden HA identificadas como las más potentes para abolir la inmunosupresión y aumentar la antigenicidad de HA probablemente provocarán títulos de anticuerpos neutralizantes más fuertes tras la administración en comparación con HA sin modificar. El proceso de preparación de VLP de influenza basadas en M1 que comprenden HA con una serie de mutaciones ISD se detalla aquí. De la misma manera, otras glicoproteínas virales o no virales, dominios de las mismas o epítopos estructurados o proteínas diana de elección pueden mostrarse de manera eficiente usando VLP-factory, proporcionando un dominio transmembrana nativo o heterólogo para anclar las proteínas que se mostrarán en el superficie VLP envuelta.

La generación de plásmidos de transferencia y la inserción en el genoma MultiBac se detallan en nuestras publicaciones anteriores (Bieniossek et al., 2008 Fitzgerald et al., 2006 Haffke, Viola, Nie y Berger, 2013). Por lo tanto, en este artículo, nos enfocamos en el proceso de producción, purificación y análisis de la matriz VLP de influenza utilizando VLP-factory ™, nuestra herramienta de expresión baculoviral derivada de MultiBac personalizada. La proteína de la influenza M1 es el elemento clave de VLP-factory ™. Identificamos a M1 de la cepa de influenza H1N1 como particularmente adecuada para el autoensamblaje y la formación de cápside (Sari-Ak et al., 2019). Además, las cápsides formadas por H1N1 M1 se liberan fácilmente de las células en el cultivo de expresión, adquiriendo la envoltura de la bicapa lipídica que comprende proteínas de membrana expresadas heterólogamente durante el proceso de gemación. Debido a estas características del H1N1 M1, nuestro VLP-factory ™ no se limita a las VLP de influenza con HA en la envoltura, sino que se puede utilizar para producir VLP que muestren diversas proteínas de la envoltura viral, una o varias simultáneamente, de diversos subtipos de influenza o incluso de otros patógenos, que se expresan a partir de genes insertados además de M1 y mCherry en el baculovirus VLP-factory ™. Estas proteínas luego se integrarán con éxito en la membrana celular y, por lo tanto, en la envoltura de las VLP basadas en M1 durante la gemación, como se muestra aquí para HA. VLP-factory ™, por lo tanto, tiene un potencial considerable como una herramienta de producción flexible para una amplia gama de vacunas VLP que muestran antígenos proteicos de superficie de patógenos virales.

Las VLP no envueltas que carecen de una membrana lipídica también representan candidatos populares para nuevas y mejores vacunas (Bachmann et al., 2013 Draper, et al., 2010 Frietze, Peabody y Chackerian, 2016 Fuenmayor, Gòdia y Cervera, 2017 Unzueta et al. ., 2015). Un inconveniente importante de las VLP envueltas, pero también de muchas VLP de proteína solo disponibles en la actualidad, y de hecho, de la mayoría de las vacunas actualmente implementadas, se origina en su falta de termoestabilidad, lo que requiere una elaborada cadena de frío desde la producción hasta el punto de atención para mantener refrigeración, que a menudo es difícil o incluso imposible en áreas pobres y remotas, lo que genera pérdidas significativas (Ashok, Brison y LeTallec, 2016).

Para superar estas limitaciones, desarrollamos ADDomer ©, nuestro andamio sintético de exhibición de péptidos multiepítopos autoensamblantes para una vacunación altamente eficiente (Vragniau et al., 2019) (Fig.2). ADDomer © se deriva de un componente del adenovirus humano, la denominada proteína de base pentona. Los adenovirus se utilizan ampliamente en la terapia génica y se consideran seguros (Crystal, 2014). La cápside de adenovirus consta de hexones, pentones y extrusiones de fibras. Curiosamente, la proteína base formadora de pentonas de algunos serotipos de adenovirus puede autoensamblarse espontáneamente en una partícula simétrica que consta de 60 protómeros (Norrby, 1966). Estos protómeros se ensamblan en 12 pentones formando un dodecaedro, preservando la capacidad similar a un adenovirus para penetrar en las células epiteliales (Fender, Boussaid, Mezin y Chroboczek, 2005). Aprovechando estas características, desarrollamos ADDomer ©, nuestra plataforma de dodecaedro sintético termoestable para visualización de múltiples epítopos altamente eficiente, como una plataforma VLP de próxima generación para vacunas y terapias de proteínas (Vragniau et al., 2019). ADDomer © se produce a altos niveles utilizando nuestro sistema de expresión de baculovirus MultiBac. Se puede mostrar una amplia gama de epítopos usando ADDomer, incluidos, hasta la fecha, epítopos tan cortos como unos pocos aminoácidos o que abarcan varios cientos de residuos de aminoácidos, que pueden incluir dominios estructurados (Vragniau et al., 2019).

Este artículo presenta instrucciones detalladas para generar, utilizando VLP-factory ™, una matriz VLP de influenza que muestra mutantes de la glicoproteína HA. Además, este artículo presenta el enfoque basado en MultiBac del ADDomer © derivado de Ad3 para mostrar múltiples epítopos de péptidos. El Protocolo básico 1 proporciona instrucciones para la generación del genoma baculoviral de fábrica de VLP. El Protocolo básico 2 describe las etapas para preparar la matriz VLP de influenza mediante el uso de VLP-factory ™. El Protocolo básico 3 describe la purificación de las VLP de la influenza. Las diferentes partes del proyecto se ilustran en un diagrama de flujo de trabajo (Fig. 3). El Protocolo básico 4 detalla cómo diseñar, producir y purificar ADDomer © utilizando el sistema MultiBac. Finalmente, en el Protocolo básico 5, se explica el enfoque para diseñar la plataforma ADDomer © para el desarrollo de vacunas contra una enfermedad infecciosa.


Introducción a la secuenciación del genoma

Un genoma consta de todo el ADN contenido en el núcleo de una célula. El ADN se compone de cuatro bloques de construcción químicos o "bases" (para simplificar, abreviado G, A, T y C), con la información biológica codificada dentro del ADN determinada por el orden de esas bases. Los organismos diploides, como los humanos y todos los demás mamíferos, contienen copias duplicadas de casi todo su ADN (es decir, pares de cromosomas con un cromosoma de cada par heredado de cada padre). Por lo general, se considera que el tamaño del genoma de un organismo es el número total de bases en una copia representativa de su ADN nuclear. En el caso de organismos diploides (como los humanos), eso corresponde a la suma de los tamaños de una copia de cada par de cromosomas.

Los organismos generalmente difieren en el tamaño de sus genomas. Por ejemplo, el genoma de E. coli (una bacteria que vive en su intestino) es

5 millones de bases (también llamadas megabases), la de una mosca de la fruta es

123 millones de bases, y la de un humano es

3 mil millones de bases). También hay algunos extremos sorprendentes, como en el caso del pino piñonero: su genoma es

23 mil millones de bases de tamaño, más de siete veces más grande que la nuestra. Obviamente, el costo de secuenciar un genoma depende de su tamaño. La discusión a continuación se centra en el genoma humano, tenga en cuenta que una sola copia 'representativa' del genoma humano es

3.000 millones de bases de tamaño, mientras que el genoma real (diploide) de una persona determinada es

Los genomas son grandes y, al menos con los métodos actuales, sus bases no se pueden 'leer' en orden (es decir, secuenciar) de un extremo a otro en un solo paso. Por el contrario, para secuenciar un genoma, su ADN primero debe descomponerse en trozos más pequeños, y luego cada trozo resultante debe someterse a reacciones químicas que permitan deducir la identidad y el orden de sus bases. El orden de base establecido derivado de cada fragmento de ADN a menudo se denomina 'lectura de secuencia', y la colección del conjunto resultante de lecturas de secuencia (a menudo numeradas en miles de millones) se vuelve a ensamblar computacionalmente para deducir la secuencia del genoma inicial . Actualmente, la secuenciación de genomas humanos se ve favorecida por la disponibilidad de secuencias de "referencia" disponibles del genoma humano, que desempeñan un papel importante en el proceso de ensamblaje computacional. Históricamente, el proceso de descomponer los genomas, secuenciar las piezas individuales de ADN y luego reensamblar las lecturas de la secuencia individual para generar una secuencia del genoma inicial se llamaba `` secuenciación de escopeta '' (aunque esta terminología se usa con menos frecuencia en la actualidad). Cuando se secuencia un genoma completo, el proceso se denomina "secuenciación del genoma completo". Consulte la Figura 2 para ver una comparación de los métodos de secuenciación del genoma humano durante el tiempo del Proyecto Genoma Humano y alrededor de

Una alternativa a la secuenciación del genoma completo es la secuenciación dirigida de parte de un genoma. La mayoría de las veces, esto implica simplemente secuenciar las regiones codificantes de proteínas de un genoma, que residen dentro de los segmentos de ADN llamados 'exones' y reflejan la parte actualmente 'mejor entendida' de la mayoría de los genomas. Por ejemplo, todos los exones del genoma humano (el 'exoma' humano) corresponden a

1,5% del genoma humano total. Los métodos ahora están disponibles para 'capturar' (o aislar) experimentalmente solo los exones, que luego pueden secuenciarse para generar una 'secuencia de exoma completo' de un genoma. La secuenciación del exoma completo requiere manipulaciones de laboratorio adicionales, por lo que una secuencia del exoma completo no cuesta

1,5% de una secuencia de genoma completo. Pero dado que se secuencia mucho menos ADN, la secuenciación del exoma completo es (al menos actualmente) más barata que la secuenciación del genoma completo.

Otro factor importante de los costos asociados con la generación de secuencias del genoma se relaciona con la calidad de los datos. Esa calidad depende en gran medida del número medio de veces que se "lee" cada base del genoma durante el proceso de secuenciación. Durante el Proyecto Genoma Humano (HGP), los niveles típicos de calidad considerados fueron: (1) 'secuencia de borrador' (que cubre

99,9% de precisión) y (2) 'secuencia terminada' (que cubre & gt95% del genoma en

99,99% de precisión). La producción de una secuencia 'terminada' de alta calidad según esta definición es muy costosa, el proceso de 'terminación de la secuencia' es muy laborioso y, por lo tanto, está asociado con altos costos. De hecho, la mayoría de las secuencias del genoma humano producidas en la actualidad son "secuencias preliminares" (a veces por encima y otras por debajo de la precisión definida anteriormente).

Por lo tanto, hay una serie de factores a considerar al calcular los costos asociados con la secuenciación del genoma. Existen múltiples tipos y niveles de calidad diferentes de secuencias del genoma, y ​​puede haber muchos pasos y actividades involucradas en el proceso en sí. Por lo tanto, comprender el costo real de una secuencia del genoma requiere conocer lo que se incluyó y lo que no se incluyó en el cálculo de ese costo (por ejemplo, generación de datos de secuencia, finalización de secuencia, actividades iniciales como mapeo, amortización de equipos, gastos generales, servicios públicos, salarios, análisis de datos, etc.). etc.). En realidad, a menudo existen diferencias en lo que se incluye al estimar los costos de secuenciación del genoma en diferentes situaciones.

A continuación se muestra información resumida sobre: ​​(1) el costo estimado de secuenciar el primer genoma humano como parte del HGP (2) el costo estimado de secuenciar un genoma humano en 2006 (es decir, hace aproximadamente una década) y (3) la estimación costo de secuenciar un genoma humano en 2016 (es decir, la actualidad).

Un genoma consta de todo el ADN contenido en el núcleo de una célula. El ADN se compone de cuatro bloques de construcción químicos o "bases" (para simplificar, abreviado G, A, T y C), con la información biológica codificada dentro del ADN determinada por el orden de esas bases. Los organismos diploides, como los humanos y todos los demás mamíferos, contienen copias duplicadas de casi todo su ADN (es decir, pares de cromosomas con un cromosoma de cada par heredado de cada padre). Generalmente, se considera que el tamaño del genoma de un organismo es el número total de bases en una copia representativa de su ADN nuclear. En el caso de organismos diploides (como los humanos), eso corresponde a la suma de los tamaños de una copia de cada par de cromosomas.

Los organismos generalmente difieren en el tamaño de sus genomas. Por ejemplo, el genoma de E. coli (una bacteria que vive en su intestino) es

5 millones de bases (también llamadas megabases), la de una mosca de la fruta es

123 millones de bases, y la de un humano es

3 mil millones de bases). También hay algunos extremos sorprendentes, como en el caso del pino piñonero: su genoma es

23 mil millones de bases de tamaño, más de siete veces más grande que la nuestra. Obviamente, el costo de secuenciar un genoma depende de su tamaño. La discusión a continuación se centra en el genoma humano, tenga en cuenta que una sola copia 'representativa' del genoma humano es

3.000 millones de bases de tamaño, mientras que el genoma real (diploide) de una persona determinada es

Los genomas son grandes y, al menos con los métodos actuales, sus bases no se pueden 'leer' en orden (es decir, secuenciar) de un extremo a otro en un solo paso. Por el contrario, para secuenciar un genoma, su ADN primero debe descomponerse en trozos más pequeños, y luego cada trozo resultante debe someterse a reacciones químicas que permitan deducir la identidad y el orden de sus bases. El orden de base establecido derivado de cada fragmento de ADN a menudo se denomina 'lectura de secuencia', y la colección del conjunto resultante de lecturas de secuencia (a menudo numeradas en miles de millones) se vuelve a ensamblar computacionalmente para deducir la secuencia del genoma inicial . Actualmente, la secuenciación de genomas humanos se ve favorecida por la disponibilidad de secuencias de "referencia" disponibles del genoma humano, que desempeñan un papel importante en el proceso de ensamblaje computacional. Históricamente, el proceso de descomponer los genomas, secuenciar las piezas individuales de ADN y luego reensamblar las lecturas de la secuencia individual para generar una secuencia del genoma inicial se llamaba `` secuenciación de escopeta '' (aunque esta terminología se usa con menos frecuencia en la actualidad). Cuando se secuencia un genoma completo, el proceso se denomina "secuenciación del genoma completo". Consulte la Figura 2 para ver una comparación de los métodos de secuenciación del genoma humano durante el tiempo del Proyecto Genoma Humano y alrededor de

Una alternativa a la secuenciación del genoma completo es la secuenciación dirigida de parte de un genoma. La mayoría de las veces, esto implica simplemente secuenciar las regiones codificantes de proteínas de un genoma, que residen dentro de los segmentos de ADN llamados 'exones' y reflejan la parte actualmente 'mejor entendida' de la mayoría de los genomas. Por ejemplo, todos los exones del genoma humano (el 'exoma' humano) corresponden a

1,5% del genoma humano total. Los métodos ahora están disponibles para 'capturar' (o aislar) experimentalmente solo los exones, que luego pueden secuenciarse para generar una 'secuencia de exoma completo' de un genoma. La secuenciación del exoma completo requiere manipulaciones de laboratorio adicionales, por lo que una secuencia del exoma completo no cuesta

1,5% de una secuencia de genoma completo. Pero dado que se secuencia mucho menos ADN, la secuenciación del exoma completo es (al menos actualmente) más barata que la secuenciación del genoma completo.

Otro factor importante de los costos asociados con la generación de secuencias del genoma se relaciona con la calidad de los datos. Esa calidad depende en gran medida del número medio de veces que se "lee" cada base del genoma durante el proceso de secuenciación. Durante el Proyecto Genoma Humano (HGP), los niveles típicos de calidad considerados fueron: (1) 'secuencia de borrador' (que cubre

99,9% de precisión) y (2) 'secuencia terminada' (que cubre & gt95% del genoma en

99,99% de precisión). La producción de una secuencia 'terminada' de alta calidad según esta definición es muy costosa, el proceso de 'terminación de la secuencia' es muy laborioso y, por lo tanto, está asociado con altos costos. De hecho, la mayoría de las secuencias del genoma humano producidas en la actualidad son "secuencias preliminares" (a veces por encima y otras por debajo de la precisión definida anteriormente).

Por lo tanto, hay una serie de factores a considerar al calcular los costos asociados con la secuenciación del genoma. Existen múltiples tipos y niveles de calidad diferentes de secuencias del genoma, y ​​puede haber muchos pasos y actividades involucradas en el proceso en sí. Por lo tanto, comprender el costo real de una secuencia del genoma requiere conocer lo que se incluyó y lo que no se incluyó en el cálculo de ese costo (por ejemplo, generación de datos de secuencia, finalización de secuencia, actividades iniciales como mapeo, amortización de equipos, gastos generales, servicios públicos, salarios, análisis de datos, etc.). etc.). En realidad, a menudo existen diferencias en lo que se incluye al estimar los costos de secuenciación del genoma en diferentes situaciones.

A continuación se muestra información resumida sobre: ​​(1) el costo estimado de secuenciar el primer genoma humano como parte del HGP (2) el costo estimado de secuenciar un genoma humano en 2006 (es decir, hace aproximadamente una década) y (3) la estimación costo de secuenciar un genoma humano en 2016 (es decir, la actualidad).


Métodos

Conjunto de datos de plásmidos

Las secuencias de ADN plasmídico y los metadatos se obtuvieron en forma de un archivo JavaScript Object Notation (JSON) obtenido a pedido de Addgene, con fecha de febrero de 2016. Analizamos este archivo para registrar el ID de PubMed (PMID) y el Identificador de objeto digital (DOI) asociados de cada plásmido. . Para determinar el año de publicación de un plásmido, primero intentamos ubicar el PMID dentro de un archivo de conversión de ID de manuscrito almacenado localmente (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/pmc/PMC-ids.csv.gz). Si no se encontró el PMID, intentamos localizar el DOI correspondiente. Si se encontró el PMID o el DOI, se almacenó el año de publicación. Si no se pudo encontrar ninguno dentro del archivo almacenado localmente, se utilizó una herramienta de búsqueda de PubMed (https://pypi.python.org/pypi/pubmed-lookup) para solicitar la información del servidor NCBI. Aunque más lento que el enfoque local, pudimos localizar todas las fechas de publicación restantes con la excepción de 15 plásmidos, que no tenían información de fecha proporcionada y fueron excluidos de la Fig. 1b. También analizamos el archivo JSON para almacenar el laboratorio de depósito de cada plásmido y las secuencias de ADN asociadas. Para los plásmidos con múltiples laboratorios de depósito enumerados, la combinación de laboratorio se trató como su propio depositante único. A continuación, se clasificaron todos los depositantes únicos en función de su número de plásmidos depositados (Fig. 1c). Las secuencias de ADN plasmídico en el archivo JSON venían etiquetadas como: (1) "Repositorio completo", donde Addgene envió la secuencia de ADN completa, (2) "Depositante completo", donde el laboratorio depositante envió la secuencia de ADN completa, (3 ) "Depósito parcial", donde una o más secciones del plásmido fueron enviadas por Addgene, o (4) "Depositante parcial", donde una o más secciones del plásmido fueron enviadas por el laboratorio de depósito. Sumamos el número total de nts asociados con un plásmido en cada categoría (y también la suma de las cuatro categorías) y luego clasificamos los plásmidos en consecuencia (Fig. 1d).

Preprocesamiento y codificación de entrada

Para tener suficientes secuencias de plásmidos para conocer el laboratorio de origen, primero eliminamos los laboratorios y sus plásmidos asociados si el laboratorio había depositado menos de nueve plásmidos. Si un plásmido tenía una secuencia de ADN asociada que se categorizó como Repositorio completo, usamos solo esa secuencia de ADN para el entrenamiento e ignoramos toda la información de la secuencia asociada. Si no había una secuencia de ADN de depósito completo, sino que había una secuencia de depósito completo, usamos solo esa secuencia de ADN para el entrenamiento e ignoramos otras secuencias. Si, en cambio, solo había una secuencia de ADN de depósito parcial y / o de depósito parcial para un plásmido (a menudo como resultado de lecturas de secuenciación de Sanger), concatenamos todas esas secuencias parciales separadas por secuencias espaciadoras de 48 N para crear la secuencia de entrenamiento.

Posteriormente, para reducir el tiempo de entrenamiento, truncamos largas secuencias de ADN a 8000 nts. En el raro caso de que los caracteres de la secuencia de ADN no fueran A, T, G, C o N, el carácter se convirtió en N. Rellenamos las secuencias resultantes con Ns hasta una longitud total de 8000 pb y luego concatenamos el reverso de la secuencia. complementarse a sí mismo separado por una secuencia espaciadora de 48 Ns. Por último, codificamos cada nt en la secuencia final como un vector one-hot donde A = [1 0 0 0], T = [0 1 0 0], G = [0 0 1 0], C = [0 0 0 1] y N = [0 0 0 0] (Fig. 2a). De manera similar, la identidad del laboratorio de depósito también se codificó como un vector monocaliente con una longitud de 827. Estas entradas de secuencia de un vector activo y las etiquetas de los depositantes se utilizaron para entrenar la red neuronal.

Red neuronal convolucional

Implementamos y entrenamos arquitecturas de redes neuronales usando Keras (versión 2.0.4) usando el backend de Tensorflow (versión 1.1.0) en Python (versión 3.5.2) con NumPy (versión 1.13.0) y SciPy (versión 0.19.0). Otros paquetes incluyen Pickle para la serialización de datos, json (versión 2.0.9) para analizar el archivo de datos Addgene y pubmed_lookup (versión 0.2.1). Las redes neuronales se entrenaron en una GPU NVIDIA GRID K520 utilizando Amazon Web Services Elastic Cloud Compute (EC2) con Ubuntu 16.04.1 LTS.

La arquitectura CNN comprende desde la entrada hasta la salida: la capa de entrada de secuencia de ADN de un vector caliente de 16.048 × 4, una sola capa convolucional con múltiples filtros, una capa de agrupación máxima para cada filtro en toda la longitud de entrada, una capa de normalización por lotes, un capa completamente conectada, una segunda capa de normalización por lotes, una segunda capa completamente conectada donde cada nodo corresponde a un laboratorio de depósito y una conversión a probabilidad usando la función softmax. Softmax se calcula tomando la señal zj generado para el nodo de salida de cada laboratorio j y convertir a probabilidad usando la ecuación: ( sigma left ( right) = frac <<>>> << mathop < sum> nolimits_k e ^>>) .

Para la capa convolucional, usamos el modo de borde de Keras mismo para generar vectores de salida con el mismo tamaño que la entrada. Se ha demostrado que las capas de normalización por lotes (utilizadas después de la capa de grupo máximo y la primera capa completamente conectada) aceleran el entrenamiento profundo de la red al reducir el cambio de covariables 74. Usamos la función de activación de la unidad lineal rectificada (ReLU) para las capas convolucionales y completamente conectadas, la Adán función de optimización para el entrenamiento, una función de pérdida de entropía cruzada categórica para propagar los errores de la salida y un tamaño de mini lote de 8 entradas por actualización. Para compensar los números de depósito de plásmidos sesgados en los laboratorios, utilizamos el método Keras class_weight variable para ponderar la función de pérdida durante el entrenamiento por el recíproco del número de plásmido de entrenamiento para ese laboratorio.

Los datos de entrenamiento se dividieron en seis subconjuntos debido a limitaciones de memoria, y los subconjuntos se cargaron y entrenaron secuencialmente durante cada época. Después de entrenar durante 100 épocas, almacenamos la arquitectura y los parámetros de la red neuronal final para su uso posterior. Visualizamos los pesos de los filtros (Fig.2a) convirtiendo los pesos de los filtros nt por posición (w) a los factores de Boltzmann utilizando la siguiente fórmula, donde el parámetro de temperatura T fue seleccionado a ojo para maximizar el contraste en un mapa de calor: (f left (w right) = e ^ <- w / T> )

Para calcular el número de secuencias de ADN que podrían analizarse por segundo, utilizamos los conjuntos de validación y validación cruzada, cada uno de los cuales contiene 2481 secuencias de plásmidos. Antes de cronometrar, preprocesamos los datos de entrada, concatenamos la secuencia con 48 N seguidos de la secuencia del complemento inverso y luego los codificamos como vectores one-hot (sección anterior). Utilizando la arquitectura de la red neuronal almacenada desde arriba, predijimos el laboratorio de origen para todos los conjuntos de validación codificada y validación cruzada mientras seguíamos los segundos transcurridos. La evaluación tomó 40.5 s para hacer predicciones para ambos conjuntos, lo que corresponde a 4962 secuencias de 8000 pb cada una, o una tasa de 980,000 pb s -1.

Optimización bayesiana de hiperparámetros

Para explorar diferentes conjuntos de hiperparámetros para la longitud del filtro, el número de filtros y el número de nodos completamente conectados, utilizamos una técnica de optimización bayesiana que modela el rendimiento de generalización del paisaje de hiperparámetros como un proceso gaussiano 75. Usamos un paquete Python de optimización bayesiana disponible en Github (https://github.com/fmfn/BayesianOptimization).

Optimizamos la precisión de la validación por tiempo de reloj de pared al final de 5 épocas utilizando la estrategia de exploración de "límite de confianza superior" con alfa igual a 10 −5 y kappa igual a 5. Variamos el número de filtros convolucionales entre 1 y 512, la longitud de los filtros convolucionales entre 1 y 48 nts y el número de nodos en la capa completamente conectada entre 1 y 256. Los límites superiores del hiperparámetro se eligieron debido a limitaciones de memoria. La formación de 23 arquitecturas diferentes produjo una gama de precisiones de formación, precisiones de validación y tiempos de reloj de pared. Muchas arquitecturas no pudieron aprender después de cinco épocas, y estas se caracterizaron por pocos filtros, una longitud de filtro pequeña o ambos. Los hiperparámetros que dieron como resultado la mayor precisión de validación por tiempo de entrenamiento (128 filtros, una longitud de filtro de 12 nt y 64 nodos completamente conectados) se seleccionaron para un entrenamiento extendido.

Permutación de la autoría del plásmido

Como control adicional para probar el sobreajuste, mezclamos las etiquetas de laboratorio de depósito en todos los plásmidos y luego los dividimos en conjuntos de entrenamiento, validación y validación cruzada. Las secuencias de ADN plasmídico no se modificaron. La frecuencia de cada laboratorio del conjunto de datos no codificados se mantuvo en el conjunto de datos codificados y usamos el class_weight variable de la misma manera que la anterior para compensar las diferencias en la frecuencia de depósito en el laboratorio. Entrenamos la red durante 100 épocas, después de lo cual la precisión de la validación fue del 0,04%, comparable a lo que se esperaría de la elección aleatoria de un laboratorio de la lista (0,12%).

Simulación y cálculo de PAG valores

Para determinar la significancia estadística de las actividades neuronales pre-softmax generadas por la CNN, calculamos PAG valores de una distribución de actividad para secuencias de ADN aleatorias 51,52. Primero generamos 104 secuencias de ADN aleatorias de longitud nt con las mismas frecuencias de A, T, G y C que el conjunto de entrenamiento de Addgene. Repetimos esto para secuencias de ADN con longitudes de 1000 nt, 3685 nt (la longitud de pCI-YFP) y 8000 nt (la longitud máxima permitida en nuestra arquitectura). Para cada secuencia de ADN aleatoria, rellenamos y concatenamos el complemento inverso de la secuencia de la misma manera que el conjunto Addgene (ver más arriba), antes de convertir la secuencia en una codificación one-hot. Luego usamos la CNN entrenada para calcular la actividad neural máxima pre-softmax en todos los laboratorios para cada secuencia. Un histograma normalizado de las actividades máximas puede aproximarse mediante una distribución de valor extremo, que tiene una función de distribución acumulativa de y = exp (−exp (-λ(Xμ))). La probabilidad de observar una actividad, A, mas grande que X es, por lo tanto PAG(A & gt X) = 1 − exp (−exp (-λ(Xμ))), dónde λ es el parámetro de inclinación y μ es el desplazamiento de la distribución de 0. Ajustamos las distribuciones empíricas a esta ecuación, que luego se utilizó para calcular la PAG valor de la actividad neuronal pre-softmax para una secuencia de ADN de longitud N.

Análisis BLAST

Para la alineación del pCI-YFP secuencia a secuencias en Genbank, BLAST se realizó contra la colección nr / nt nt utilizando la interfaz web (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Se utilizaron los parámetros predeterminados, excepto que la consulta Entrez es "NO genoma", las secuencias objetivo máximas eran 20.000, el umbral de expectativa era 0,1 y las coincidencias máximas en un rango de consulta eran 5000. Las puntuaciones de coincidencia / discordancia son 1, -2 y la brecha el costo fue lineal. Para características de plásmido KanR, p15A, y YFP, web BLAST se realizó contra la colección nr / nt utilizando los parámetros predeterminados de megablast y el número de alineaciones informadas. Además, para cada característica, BLAST se realizó localmente contra el conjunto de entrenamiento y se registró el número de alineaciones en el archivo de salida. Para ello, se crearon archivos FASTA para cada función y se creó una base de datos BLAST a partir de un archivo FASTA con todas las secuencias de ADN de entrenamiento de Addgene. Para un archivo FASTA que contiene el pCI-YFP secuencia, BLAST se realizó contra el conjunto de entrenamiento Addgene y se registraron las puntuaciones de los 10 mejores laboratorios (Fig. 3b). La alineación de todo pCI-YFP El plásmido del conjunto de entrenamiento de Addgene devolvió & gt10 4 coincidencias. Encontramos el más pequeño distinto de cero mi-valor (4 × 10 −180) y luego contó el número de alineaciones con un mi-valor de cero para concluir que 11369 alineaciones de plásmidos tienen un mi-valor & lt 10 −180.

Trayectorias mutacionales

Se introdujeron mutaciones puntuales en el pCI-YFP Secuencia de ADN iterativamente durante 1000 generaciones para una sola trayectoria. Cada mutación puntual en una trayectoria se realizó en una posición única en comparación con todas las mutaciones anteriores (es decir, las posiciones de mutación se seleccionaron sin reemplazo). La identidad del nt post-mutación fue uno de los tres nt que no estaban presentes en esa posición antes de la mutación. Después de cada mutación, la nueva secuencia de ADN fue evaluada por la red neuronal completamente entrenada y se registró la predicción de probabilidad para el laboratorio de Christopher Voigt. Se realizaron treinta de tales trayectorias mutacionales, cada una a partir de la original. pCI-YFP secuencia. Se calculó la media geométrica de las probabilidades en cada paso de mutación.

Escaneo de secuencia para determinar la firma

Para determinar la importancia de las diferentes regiones dentro de un plásmido para las predicciones, se escaneó una ventana de 50 Ns a través del plásmido para enmascarar la secuencia subyacente en cada posición. Para cada plásmido, la secuencia de ADN inicial fue la secuencia de ADN de entrenamiento antes de rellenarla hasta una longitud de 8000 pb y concatenarla con su complemento inverso. Usando esta secuencia, se aplicó una condición de límite periódica de modo que, cuando cualquiera de los N en la ventana de escaneo de 50 N se extendiera más allá del límite final de la secuencia de ADN, esos N se volvieron a colocar al comienzo de la secuencia de ADN. Para cada posición del escaneo de la ventana, la secuencia de ADN enmascarada resultante se rellenó a 8000 pb, se concatenó con un espaciador de 48 Ns seguido del complemento inverso, se convirtió en un vector de un solo calor y se introdujo en la red neuronal completamente entrenada. Se evaluaron las actividades neuronales pre-softmax y las probabilidades de softmax para los mejores laboratorios predichos. Para cada nt en un plásmido, se promediaron y visualizaron las predicciones de CNN de los 50 cuadros donde la ventana deslizante enmascaraba ese nt (Fig. 4, trazos de línea). También se visualizó la predicción de laboratorio superior para cada posición de la ventana de enmascaramiento (Fig. 4, barras de colores, anchos no a escala).

Disponibilidad de código

Disponibilidad de datos

Los autores declaran que todos los datos que respaldan este estudio están disponibles dentro del artículo y su archivo de información complementaria o están disponibles del autor correspondiente a pedido.


Fragmentos génicos gBlocks

Los gBlocks y los fragmentos de genes comerciales son fragmentos de ADN de doble hebra de 125 y ndash3000 pb de longitud.Son el estándar de la industria para fragmentos de genes de doble hebra, diseñados para una construcción o modificación de genes asequible y fácil, aplicaciones como la investigación de anticuerpos y la edición del genoma mediada por CRISPR, estándares de qPCR y más.

Los NUEVOS fragmentos de genes HiFi gBlocks (1000 y ndash3000 bp de longitud) están optimizados para el ensamblaje de construcciones grandes. Elija menos colonias y lleve a cabo sus proyectos más rápido con estos fragmentos de alta pureza.

  • Alta fidelidad y pureza para el ensamblaje de genes.
  • Compatible con todos los métodos de clonación posteriores
  • Listo para usar sin secuencias adicionales para eliminar

Cita destacada

El entrelazamiento de secuencias sintéticas aumenta la estabilidad y la contención de la información genética en las células

Blazejewski T, Ho HI, Wang HH.
Ciencias. doi: 10.1126 / science.aav5477 (2019)

Ordenando

GBloquea fragmentos genéticos en tubos

Solo residuos A, T, C y G. Se entrega seco y normalizado a 250, 500 o 1000 ng, según la longitud.

GBloquea fragmentos genéticos en placas

Los pedidos requieren un mínimo de 24 fragmentos por placa. Resuspendido en 25 µL de agua libre de nucleasas (concentración: 10 ng / µL). Se envía en hielo seco dentro de los 10 días hábiles posteriores a la confirmación del pedido (excepto los viernes).

Cargando.

GBlocks Fragmentos de genes de alta fidelidad en tubos

No hay pedidos mínimos de tubos. Se envía en seco dentro de los 6 y 10 días hábiles posteriores a la confirmación del pedido (excepto los viernes).

Bibliotecas de fragmentos génicos gBlocks en tubos

Se entrega seco, normalizado a 200 ng. Las bibliotecas no están disponibles en formato de placa.

1 BD, días hábiles. El tiempo de envío depende de la longitud y complejidad de los fragmentos de gBlocks solicitados. En algunos casos, el tiempo de envío puede exceder el tiempo estimado.

Detalles de producto

Fragmentos génicos gBlocks

Los fragmentos génicos gBlocks son fragmentos de ADN de doble hebra de 125 y ndash3000 pb de longitud con una tasa de error media de menos de 1: 5000. Se fabrican con las mismas químicas de síntesis de alta fidelidad líderes en la industria que se desarrollaron para nuestros Ultramer & Trade DNA Oligos.

Cada fragmento de gen gBlocks pasa por un proceso de control de calidad, que incluye verificación de tamaño por electroforesis capilar e identificación de secuencia por espectrometría de masas. Esta rigurosa prueba asegura que la mayoría de las colonias recombinantes obtenidas de la clonación de cada fragmento génico gBlocks contendrán el inserto deseado. Las secuencias más complejas pueden necesitar que el usuario final secuencie clones adicionales.

NUEVOS fragmentos de genes de alta fidelidad gBlocks

Los fragmentos de genes gBlocks HiFi son fragmentos de ADN de doble hebra con tamaños entre 1000 y ndash3000 pb y verificados con una tasa de error media de menos de 1: 12.000 a través de NGS. Estas construcciones de alta calidad y alta fidelidad facilitan el ensamblaje de secuencias grandes y complejas, igualando tanto la longitud como la precisión necesarias para minimizar la introducción de errores de sustitución o deleción no deseados.

Con gBlocks o gBlocks HiFi Gene Fragments, puede ensamblar y clonar fácilmente su fragmento de ADN en el vector de su elección utilizando una variedad de métodos de clonación, incluido el método Gibson Assembly & reg (Synthetic Genomics, Inc.) y blunt- o cohesive- poner fin a los protocolos de clonación. Para mayor flexibilidad, puede solicitar fragmentos génicos gBlocks con o sin un grupo 5 y fosfato primario.

Bibliotecas de fragmentos de genes gBlocks

Las bibliotecas de fragmentos génicos gBlocks son fragmentos gBlocks agrupados de 251 a 500 pb de longitud total. Las bibliotecas de fragmentos génicos gBlocks son ideales para generar anticuerpos recombinantes o para la ingeniería de proteínas, lo que permite a los investigadores generar cientos de miles de construcciones con un presupuesto razonable. Las regiones variables pueden tener hasta 18 bases N o K consecutivas de longitud y deben tener al menos 125 pb desde cualquier extremo del fragmento del gen (Figura 1).

Figura 1. Formato de pedido de las bibliotecas de fragmentos de genes gBlocks. Colocar una base mixta K en la tercera posición de codones elimina los codones de terminación TAA y TGA de ser incluidos en las bibliotecas de fragmentos de genes, dejando solo TAG como el posible codón de terminación.

Para las bibliotecas de fragmentos génicos gBlocks, cada región constante se verifica de manera similar a los fragmentos génicos gBlocks estándar. El tamaño del producto final de la biblioteca se verifica mediante electroforesis capilar.


La revolución industrial ciberbiológica

Este cambio de cultura tiene el potencial de permitir una revolución industrial. Recientemente, el foro económico mundial ha reconocido la aparición de sistemas ciberfísicos como catalizadores de la 4ª revolución industrial [51]. Los sistemas ciberfísicos son sistemas híbridos compuestos por una serie de entidades físicas conectadas a software que ejecutan algoritmos de control para dirigir dispositivos individuales en respuesta a los datos recibidos de varias fuentes. Las aplicaciones de navegación que se ejecutan en dispositivos móviles (Google Maps, Waze) crean un sistema de transporte ciberfísico que muchas personas utilizan a diario. Los teléfonos inteligentes proporcionan información sobre la posición y el tráfico a un servidor central. La información proporcionada por esta red de dispositivos se analiza en tiempo real y junto con otras fuentes de datos para proporcionar direcciones individualizadas a cada usuario. Más allá del transporte, la red eléctrica, la fabricación, el comercio minorista, la atención médica y el control del tráfico aéreo ahora incluyen muchos sistemas ciberfísicos.

Con su fuerte énfasis en la biología impulsada por modelos, la biología sintética también incluye sistemas ciberfísicos. Por ejemplo, la fabricación de moléculas de ADN personalizadas es un proceso físico impulsado por varias capas de software. Los laboratorios virtuales como Transcriptic o Emerald Cloud Labs también son ejemplos de sistemas ciberfísicos en biotecnología. Sin embargo, la biología sintética va más allá al codificar algoritmos de control dentro de las moléculas de ADN, diseñar organismos que pueden reproducirse, comunicarse entre sí o aprovechar redes complejas de interacciones entre huéspedes y patógenos, presas y depredadores, etc. Existe un nivel de complejidad sin precedentes en estos sistemas biológicos diseñados que los hace diferentes de los sistemas ciberfísicos. Pueden describirse mejor como "ciberbiológicos" (Figura 2).

La biología sintética ciertamente no es tan madura como las tecnologías que catalizaron el surgimiento de los sistemas ciberfísicos. Todavía es en su mayoría muy artesanal, pero hay indicios tempranos de que los sistemas ciberbiológicos tienen el potencial de catalizar la quinta revolución industrial en la segunda mitad del siglo XXI. Es importante recordar que Internet y los Sistemas de Posicionamiento Global, dos tecnologías clave que permitieron el desarrollo de los sistemas ciberfísicos actuales, fueron desarrollados por el Departamento de Defensa de Estados Unidos hace más de cuarenta años [52]. Esta perspectiva histórica ayuda a apreciar la importancia de las inversiones que la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) ha estado haciendo en biología sintética durante los últimos años. Su programa “Living Foundries” [53] articuló una visión de una nueva industria basada en sistemas ciberbiológicos. Esta frontera es tan importante para DARPA que recientemente crearon una nueva oficina de Tecnologías Biológicas [54].

También hay evidencia de que el centro de gravedad de la comunidad de biología sintética se ha ido desplazando progresivamente hacia la industria. Empresas como Amyris, Synthetic Genomics, Gingko Bioworks, Intrexon o Twist Biosciences han recaudado recursos que les permiten desarrollar infraestructuras de investigación a escala industrial más allá del alcance de los grupos de investigación académicos. El exitoso programa de la industria de SynBERC ha inspirado a algunas empresas maduras a desarrollar iniciativas de biología sintética internamente o mediante colaboraciones con nuevas empresas de biología sintética.


Capítulo once - Síntesis de genes a escala industrial

Los desarrollos más recientes en el área de la secuenciación profunda del ADN y el análisis funcional y cuantitativo posterior están agregando rápidamente una nueva dimensión a la comprensión de las vías bioquímicas y las interdependencias metabólicas. Estos conocimientos crecientes allanan el camino para diseñar nuevas estrategias que aborden las necesidades públicas, incluidas las aplicaciones ambientales y las invenciones terapéuticas, o nuevas fábricas de células para fuentes de energía o sustancias químicas sostenibles y reconciliables. Agregar otro nivel es construir sobre redes y caminos que ocurren de forma no natural. Los desarrollos recientes en biología sintética han creado opciones económicas y confiables para diseñar y sintetizar genes, operones y, finalmente, genomas completos. Mientras tanto, el diseño de alto rendimiento y la síntesis de secuencias de ADN extremadamente completas se han convertido en una tecnología habilitadora que ya es indispensable en varios sectores de las ciencias de la vida en la actualidad. A continuación, describimos la perspectiva industrial de la síntesis genética moderna y su relación con la biología sintética. La síntesis de genes contribuyó significativamente al surgimiento de la biología sintética no solo proporcionando el material genético en alta calidad y cantidad, sino también permitiendo su ensamblaje, de acuerdo con los principios del diseño de ingeniería, en un formato estandarizado. La biología sintética, por otro lado, agregó la necesidad de ensamblar circuitos complejos y grandes complejos, fomentando así el desarrollo de métodos adecuados y ampliando el alcance de las aplicaciones. La biología sintética también ha estimulado la colaboración interdisciplinaria, así como la integración del público en general, al abordar las oportunidades y preocupaciones socioeconómicas, filosóficas, éticas, políticas y legales. Los logros tecnológicos impulsados ​​por la demanda de la síntesis de genes y los procesos implementados se ejemplifican en un entorno industrial de síntesis de genes a gran escala, que describe la producción desde el pedido hasta la entrega.


Secuenciador de ADN portátil

Secuenciador de ADN portátil

Larry H. Bernstein, MD, FCAP, curador

MinION podría ayudar a lograr el objetivo de los NIH de secuenciar el genoma humano de $ 1,000 y, en clínicas remotas y zonas de brotes, alejar las pruebas de los laboratorios médicos

La tecnología de secuenciación de ADN en el punto de atención se está acercando cada vez más al uso comercial generalizado a medida que el secuenciador Oxford Nanopore MinION recibe elogios y registra éxitos en las pruebas previas al lanzamiento.

Una máquina de secuenciación de genes del tamaño de un bolsillo, como MinION, podría transformar el mercado al trasladar las pruebas de ADN a clínicas remotas y zonas de brote y eliminar la necesidad de devolver las muestras a los laboratorios clínicos para su análisis. También se espera que dichos dispositivos aumenten la necesidad de patólogos genéticos y tecnólogos médicos capacitados.

Después de mucha anticipación, MinION cumple sus promesas

El MinION, producido por Oxford Nanopore Technologies, con sede en el Reino Unido, es un instrumento miniaturizado del tamaño de una memoria USB que se conecta directamente al puerto USB de una PC o computadora portátil. A diferencia de los secuenciadores de sobremesa, el MinION utiliza tecnología de secuenciación de cadena n ° 8221 con nanoporos para ofrecer datos de secuencia de una sola molécula de longitud de lectura ultralarga.

“El secuenciador alimentado por USB contiene miles de pozos, cada uno de los cuales contiene nanoporos, canales de proteínas estrechos que solo son lo suficientemente anchos para una sola hebra de ADN. Cuando el ADN ingresa a los canales, cada base emite una firma electrónica única que puede ser detectada por el sistema, proporcionando una lectura de la secuencia de ADN ”, informó.

Después de varios años de promesas incumplidas, Oxford comenzó a entregar el MinION en la primavera de 2014 a los investigadores que participaban en su programa de acceso temprano llamado MAP. Por una tarifa de acceso de $ 1,000, los participantes reciben un kit de inicio y pueden comprar suministros consumibles. El precio actual de las celdas de flujo adicionales oscila entre $ 900 por una y $ 500 por pieza cuando se compran en cantidades de 48 unidades.

Nick Loman, investigador independiente del Instituto de Microbiología e Infecciones de la Universidad de Birmingham, Reino Unido, se había preguntado si la promesa de MinION se cumpliría alguna vez. Pero el secuenciador del tamaño de un USB lo convenció después de que lo usó para detectar Salmonella en 15 minutos en muestras enviadas desde un hospital local.

Loman recibió el MinION en mayo de 2014 como parte del programa MAP y rápidamente probó su utilidad. Después de usar el dispositivo para secuenciar una cepa de Pseudomonas aeruginosa, una infección hospitalaria común (HAI), ayudó a resolver el enigma de un brote de infección por Salmonella en un hospital de Birmingham que había afectado a 30 pacientes y personal.

“El hospital quería entender rápidamente lo que estaba sucediendo”, dijo Loman. “Pero la secuenciación rutinaria del genoma es bastante lenta. Por lo general, se necesitan semanas o incluso meses para recuperar la información ".

Usando MinION, Loman detectó Salmonella en algunas de las muestras enviadas desde el hospital en menos de 15 minutos. En última instancia, la fuente principal del brote se remonta a un proveedor de huevos alemán.

"El MinION simplemente me dejó boquiabierto", declaró Loman en Wired. "La idea de que se pueda realizar la secuenciación en una especie de memoria USB que se pueda tirar aumenta la credulidad".

La secuenciación portátil abre posibilidades fascinantes para los patólogos

En mayo de 2015, Oxford lanzó una segunda versión del dispositivo, el MinION MkI. Según el sitio web de la compañía, el MinION actualizado es un "dispositivo de producción completo que presenta mejoras de rendimiento y facilidad de uso", como un control de temperatura mejorado y un mecanismo actualizado para conectar el dispositivo con las celdas de flujo consumibles.

“Los secuenciadores de sobremesa abrieron el mercado hasta cierto punto”, dice Loman. “Empezaste a verlos en grupos de investigación intensivos y en la clínica. Pero, ¿y si alguien pudiera tener esto colgando de su llavero e ir a secuenciar? Esa es una idea loca y realmente no sabemos qué significará en términos de las aplicaciones potenciales. Estamos muy empezando a pensar en lo que podríamos hacer, si alguien puede secuenciar cualquier cosa, en cualquier lugar ".

Joshua Quick, candidato a doctorado en la Universidad de Birmingham, Reino Unido, cree que el dispositivo portátil y económico de Oxford Nanopore Technologies cambiará el panorama de la secuenciación genética.

Precisión, una compensación por la portabilidad

Los beta-testers han demostrado que el dispositivo en miniatura puede leer tramos relativamente largos de secuencia genética con una precisión cada vez mayor, pero según el informe de la revista. Naturaleza , el MinION MkI deberá corregir varias deficiencias encontradas en el secuenciador original:

• No es práctico secuenciar genomas grandes con el dispositivo, y algunos expertos estiman que la versión original tardaría un año en secuenciar el equivalente de un genoma humano.

• La máquina tiene una alta tasa de error en comparación con los secuenciadores de tamaño completo existentes, identificando erróneamente la secuencia de ADN entre el 5% y el 30% de las veces.

• También tiene dificultades para leer secciones del genoma que contienen tramos largos de una sola base de ADN.

Sin embargo, los investigadores que han utilizado el dispositivo siguen entusiasmados con el futuro de esta técnica de secuenciación de cuarta generación, que puede tener el potencial de lograr el objetivo de $ 1,000 por genoma humano establecido por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

"Esta es la democratización de la secuenciación", dijo a Nature Joshua Quick, candidato a doctorado en la Universidad de Birmingham. "No tiene que depender de una infraestructura cara y equipos costosos".

Las cuentas de noticias no proporcionaron información sobre los planes de Oxford Nanopore para obtener una marca de la UE para su dispositivo MinION. Ese será el siguiente paso para demostrar que el dispositivo está listo para un uso clínico generalizado. Al mismo tiempo, los gerentes de laboratorio clínico y el patólogo deben tomar nota de las capacidades del MinION MkI como se describe anteriormente. Los investigadores ya lo están encontrando útil para identificar enfermedades infecciosas en entornos clínicos donde otros métodos de diagnóstico aún no han identificado el agente causante de la infección.


Compañias en lista

Las siguientes empresas y organizaciones se han mencionado en el informe.

  1. 1ra base
  2. 23andMe
  3. AbbVie
  4. AbCellera
  5. Motivo activo
  6. Activiomics
  7. Adaltis
  8. Salud de Admera
  9. Agiomix
  10. Laboratorios AgriGenome
  11. AKESOgen
  12. Grupo Almac
  13. Asociación Americana para la Investigación del Cáncer
  14. Amgen
  15. Tecnología de genes Annoroad
  16. ANTISEL
  17. Materiales biológicos aplicados
  18. Instituto de Genómica de Arizona
  19. Empresas de tecnología de Arizona
  20. Investigación sobre artritis en el Reino Unido
  21. Laboratorios ARUP
  22. Asper Biogene
  23. AstraZeneca
  24. Asuragen
  25. Auragen
  26. Centro australiano de investigación del genoma
  27. BaseClear
  28. Bayer
  29. BGI
  30. Bio Básico
  31. Laboratorio de servicios bioanalíticos (Universidad de Maryland)
  32. BIOFIDAL
  33. Genómica Bionano
  34. Tecnologías de biosearch
  35. Centro de biotecnología (Universidad de Wisconsin)
  36. Boehringer Ingelheim
  37. Bristol-Myers Squibb
  38. Instituto amplio
  39. C-Camp (instalación de genómica de próxima generación)
  40. CD Genomics
  41. CeGaT
  42. Terapéutica Celsius
  43. CEN4GEN
  44. Centro de Genómica Aplicada (Hospital de Niños de Filadelfia)
  45. Centro de apoyo a la investigación biomédica (Universidad de Texas)
  46. Centógeno
  47. Centro de Biología del Genoma (Universidad de Bolonia)
  48. Centro de Investigación Genómica (Universidad de Liverpool)
  49. Cromado
  50. Núcleo de genómica de próxima generación de Cold Spring Harbor Laboratory
  51. Centro del genoma de Columbia
  52. Universidad de Colombia
  53. Genómica completa
  54. Informática
  55. Genómica contextual
  56. CosmosID
  57. Daiichi Sankyo
  58. Laboratorios Dante
  59. DBS Genomics (Universidad de Durham)
  60. Terapéutica DC3
  61. Genómica de Novo
  62. genética deCODE
  63. DiaCarta
  64. Diagnóstico
  65. Diversigen
  66. ADN Genotek
  67. Enlace de ADN
  68. Secuenciación de ADN y centro de genotipado de amplificadores Instituto de Biotecnología de Delaware
  69. Centro de análisis de genes y secuenciación de ADN (Universidad de Washington)
  70. Centro de secuenciación de ADN (Universidad Brigham Young)
  71. DNAnexus
  72. DNAVision
  73. Dow Agrosciences
  74. Instituto Earlham
  75. Edimburgo Genomics
  76. Núcleo de epigenómica
  77. Eurofins Genomics
  78. Fasteris
  79. Ferring Pharmaceuticals
  80. Firalis
  81. Cinco terapias principales
  82. Fundación Medicina
  83. Bioinformática de Frasergen
  84. Genética fulgente
  85. Genomas completos
  86. Centro de Genómica Funcional de Zúrich (Universidad de Z & uumlrich)
  87. GenapSys
  88. Gencove
  89. Gene por Gene
  90. Genentech
  91. GenePlanet
  92. GeneTech
  93. GENEWIZ
  94. Tecnologías Genia
  95. Genialis
  96. Genoma
  97. Centro de Innovación Genome Quebec
  98. Centro de acceso a la tecnología del genoma (Universidad de Washington)
  99. GenomeFan
  100. GenomeScan
  101. GenomeStream
  102. Centro de secuenciación y genómica (Universidad de Rhode Island)
  103. Intercambio de información sobre neoplasias de evidencia genómica
  104. Medicina genómica Irlanda
  105. Salud personalizada genómica
  106. Centro de servicios de secuenciación genómica (Stanford Medicine)
  107. Genomix4Life
  108. Genoptix
  109. Genosidad
  110. Tecnología genotípica
  111. Ciencias de Galaad
  112. GlaxoSmithKline
  113. GRIAL
  114. Terapéutica Halozyme
  115. Universidad Harvard
  116. Centro de salud Wadsworth
  117. Cuidado de la salud y biociencias iNet
  118. Histogenética
  119. Descubrimiento del horizonte
  120. Centro de secuenciación del genoma HudsonAlpha
  121. Ciencias del Genoma Humano
  122. Longevidad humana
  123. Instituto Icahn de Ciencia de Datos y Tecnología Genómica
  124. Illumina
  125. Inotrem
  126. Instituto de Seguridad y Salud Alimentaria (Instituto de Tecnología de Illinois)
  127. Núcleo de Genómica Integrativa (Ciudad de la Esperanza)
  128. Consorcio Internacional de Secuenciación del Genoma del Trigo
  129. Jan-Willem de Gier (Universidad de Estocolmo)
  130. Universidad Johns Hopkins
  131. Johnson y Johnson
  132. Jouvene
  133. Biosistemas de Kapa
  134. Instituto de Investigación de ADN Kazusa
  135. Laboratorio de secuenciación KCCG (Instituto Garvan de Investigación Médica)
  136. LC Ciencias
  137. Genómica de bucles
  138. Oncología Loxo
  139. Lucigen
  140. Macrogen
  141. Maryland Genomics
  142. Hospital General de Massachusetts
  143. Instituto de Tecnología de Massachusetts
  144. Servicio del genoma de Massey (Universidad de Massey)
  145. Max Planck-Genome-center Colonia
  146. Instituto del Genoma McDonnell (Universidad de Washington)
  147. Universidad McGill
  148. MedGenome
  149. MedImmune (una subsidiaria de AstraZeneca)
  150. Medivir
  151. Merck
  152. MGI Tech
  153. Microba
  154. Microgenómica
  155. Microsintético
  156. Laboratorios MNG (Neurogenética médica)
  157. MOgene
  158. Soluciones MolDiag
  159. Núcleo de Biología Molecular y Genómica (Universidad Estatal de Washington)
  160. MongoDB
  161. Unidad de Genética Humana del MRC (Universidad de Edimburgo)
  162. myGenomics
  163. Genética innumerable
  164. Nabsys
  165. Infraestructura Nacional de Genómica (Universidad de Uppsala)
  166. Centro Nacional de Instrumentación para la Gestión Ambiental
  167. Genómica de la nebulosa
  168. Centro del genoma de Nueva York
  169. Núcleo de secuenciación de próxima generación (Fundación de Investigación Médica de Oklahoma)
  170. Instalación de secuenciación de próxima generación (Universidad de Leeds)
  171. Novartis
  172. Novogene
  173. Nucleicos
  174. Nucleoma
  175. Legado del genoma oceánico
  176. Okairos y Conatus
  177. Bioservicios Omega
  178. Oncinmune
  179. OpGen
  180. Otogenética
  181. Centro de Genómica de Oxford
  182. Tecnologías Oxford Nanopore
  183. Consorcio de la Universidad de Oxford
  184. Biociencias del Pacífico
  185. Medicina personalizada de Partners HealthCare
  186. PerkinElmer Genomics
  187. Pfizer
  188. Phalanx Biotech
  189. Diseños moleculares de Phoenix
  190. Pierre Fabre
  191. Instalación de proteínas y ácidos nucleicos
  192. Psomagen
  193. Soluciones Q2
  194. QIAGEN
  195. Biología rápida
  196. Instituto Rady Children & # 39s de Medicina Genómica
  197. Centro Ramaciotti de Genómica (UNSW Sydney)
  198. Genómica de RAPiD
  199. REPROCELAR
  200. Roche
  201. RTLGenomics
  202. Centro de supercomputación de San Diego
  203. Sanofi
  204. Instituto de Ciencias Traslacionales Scripps
  205. Segundo genoma
  206. SeqLL
  207. SeqMatic
  208. Centro de secuenciación
  209. Shanghai OE Biotech
  210. Fuente BioScience
  211. SRM
  212. Universidad Stanford
  213. StarSEQ
  214. Stratos Genomics
  215. Tecnologías Synbio
  216. Centro tecnológico de genómica y bioinformática (UCLA)
  217. Texas A y ampM AgriLife
  218. Theragen Etex Bio
  219. Thermo Fisher Scientific
  220. Genética de Toldot
  221. UCB
  222. Centro de Genómica Clínica de UCLA
  223. Fundación de Investigación Médica del Reino Unido
  224. United Therapeutics
  225. Universidad de California
  226. Universidad de Leicester
  227. Universidad de londres
  228. Centro de Genómica de la Universidad de Minnesota
  229. Universidad de Nottingham
  230. Salud de la Universidad de Utah
  231. Veritas
  232. Instituto Waksman de Microbiología (Universidad de Rutgers)
  233. Instituto Wellcome Sanger
  234. WuXi NextCODE
  235. Laboratorios Xcelris
  236. Xenomics de Yaazh
  237. Centro de Yale para el análisis del genoma (Facultad de medicina de Yale)
  238. Yikon Genomics

Segmentación

La oportunidad financiera de USD 19 mil millones (para 2030) dentro del mercado de secuenciación de próxima generación se ha analizado en los siguientes segmentos:


Ver el vídeo: Ejercicio: Transcripción de una cadena de ADN a ARNm (Diciembre 2022).