Información

¿Por qué el marcaje con 4-tiouracilo para mapear las proteínas de unión al ARN causa un cambio en la T-C?

¿Por qué el marcaje con 4-tiouracilo para mapear las proteínas de unión al ARN causa un cambio en la T-C?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ahora estoy leyendo un artículo sobre la purificación e identificación de ARNm y sus proteínas de unión a ARN mediante el uso de inmunoprecipitación y entrecruzamiento UV. Me encontré con esta frase que me desconcertó

Hasta el 28% de todas las uridinas presentes en 3 'UTR mostraron cambios de T-C de diagnóstico en las lecturas de secuencia de perfiles de ocupación de proteínas. Este número es razonablemente alto, considerando las observaciones de que típicamente solo una de las pocas uridinas en los sitios de unión del ARN cuando se sustituye por 4SU, se reticula con proteínas.

Lo que no entiendo es por qué el etiquetado del 4-tiouracilo (4SU) en la celda muestra cambios en la T-C. ¿No se vería afectado el emparejamiento de bases de uracilo-adenina?

¿Cómo funciona realmente el etiquetado 4SU?


La técnica utilizada en ese documento se llama PAR-CLIP (Reticulación e inmunoprecipitación mejoradas con ribonucleósidos fotoactivables; ver Ascano et al., 2012 y Spitzer et al, 2014). Esta técnica implica sustituir la uridina (U) con 4-tiouridina (4SU) o sustituyendo guanosina (GRAMO) con 6-tioguanosina (6SG). La razón fundamental detrás del uso de estas bases modificadas es que mejoran la eficiencia de la reticulación ARN-proteína. Además, PAR-CLIP utiliza UV de 365 nm en lugar del UV de 254 nm utilizado en la reticulación convencional. Sin embargo, el proceso de reticulación provoca la pérdida del átomo de azufre provocando laUpara ser leído comoCdurante la transcripción inversa. Igualmente,6SGse lee comoA.

Ascano et al., 2012


¿Por qué el marcaje con 4-tiouracilo para mapear las proteínas de unión al ARN causa un cambio en la T-C? - biología

Las nuevas tecnologías han permitido el mapeo sistemático de las interacciones ARN-ARN, revelando decenas de miles de tales interacciones.

En condiciones celulares endógenas, los miARN y los lincRNA tienden a dirigirse específicamente a uno o algunos mRNA, lo que indica que todo el interactoma del ARN es una red sin escamas.

Cientos de genes snoRNA producen RNA cortos similares a miRNA que interactúan con los mRNA, proporcionando así un repertorio de genes de nuevos RNA reguladores.

Los pseudogenes y los transposones producen ARN que interactúan con los ARNm a través del emparejamiento de bases. Las regiones de interacción exhiben mayores niveles de conservación entre especies.

Las nuevas tecnologías permitieron el mapeo sistemático de las interacciones ARN-ADN, revelando cientos de ARN que interactúan con la cromatina.

Dado que la transcripción del genoma humano es bastante generalizada, es posible que aún no se hayan identificado muchas funciones nuevas del genoma no codificante. A menudo, las funciones del genoma no codificante se llevan a cabo mediante sus transcripciones de ARN, que pueden depender de sus estructuras y / o interacciones extensas con otras moléculas. Los desarrollos tecnológicos recientes están transformando los campos de la biología del ARN del estudio de un ARN a la vez al mapeo de estructuras e interacciones en todo el transcriptoma. Aquí, destacamos los avances recientes en el análisis de interacción de ARN en todo el transcriptoma. Estas tecnologías revelaron una sorprendente versatilidad del ARN para participar en diversos sistemas moleculares. Por ejemplo, se han revelado decenas de miles de interacciones ARN-ARN en células cultivadas, así como en el cerebro de ratón, incluidas las interacciones entre las transcripciones producidas por transposones y los ARNm. Además, la mayoría de los sitios de inicio de la transcripción en el genoma humano están asociados con ARN no codificante transcrito de otros loci genómicos. Estos descubrimientos recientes ampliaron nuestra comprensión de las funciones de los ARN en la organización de la cromatina, la regulación de genes y la señalización intracelular.


Abreviaturas

ADAR, adenosina desaminasa que actúa sobre el ARN

Chip, inmunoprecipitación de cromatina

dsRBD, dominio de unión a ARN bicatenario

KSRP, Proteína reguladora de empalme de tipo KH

lncRNA, ARN largos no codificantes

MAPK, proteína quinasa activada por mitógenos

PAZ, Piwi / Argonaute / Zwille

RBP, Proteínas de unión a ARN

Rhed, Dominio hemo de unión a ARN

RIIID, Dominio de RNasa III

RISC, Complejo silenciador inducido por ARN

snRNPs, ribonucleoproteínas nucleares pequeñas

TDP-43, Proteína de unión al ADN de alquitrán 43

La regulación de la expresión génica por pequeños ARN no codificantes está en el corazón de un número cada vez mayor de vías biológicas y definitivamente los biólogos no pueden pasarla por alto, sea cual sea su campo de investigación. Existen diferentes tipos de ARN reguladores pequeños, que se pueden clasificar por su origen genómico o su función. También pueden venir en diferentes sabores según el reino, pero en aras de la brevedad, solo mencionaremos aquí las diferentes familias que existen en los animales. A pesar de algunas diferencias en su biogénesis, los ARN pequeños comparten el mismo modo de acción. De hecho, actúan como guías específicas de secuencia para las proteínas efectoras, que pertenecen a la familia Piwi / Argonaute (AGO) [1]. Al cargar, los dirigen hacia sus ARN objetivo previstos. En términos generales, se pueden distinguir dos clases principales de ARN pequeños: (a) ARN de interferencia pequeños (si) y ARN micro (mi), que se generan mediante la escisión de moléculas precursoras de ARN bicatenario (ds) de tamaño variable por tipo. III ribonucleasas, también llamadas proteínas Dicer [2] y (b) ARN asociados a piwi (pi) específicos de la línea germinal, que no dependen del corte en cubitos de una molécula de ARNdc (para una revisión, ver [3]). Aunque comparten algunos factores de biogénesis comunes, los ARNip y los miARN son muy diferentes en términos de su función biológica en la célula. El primero puede verse como un sistema de defensa contra ácidos nucleicos bicatenarios extraños o no deseados, mientras que los últimos se expresan constitutivamente y desempeñan funciones importantes como sintonizadores finos de la expresión génica. El enfoque de esta revisión está en los miARN y, por lo tanto, no nos detendremos más en los ARNsi y piARN.

La biogénesis de los miARN, como se describe en la Figura 1, es un proceso complejo y compartimentado que comienza con la transcripción de una transcripción primaria larga llamada pri-miARN, que contiene todas las características de un ARNm codificante. Esta transcripción se realiza principalmente por la ARN polimerasa II (ARN pol II) [4], pero hay algunos casos de miARN codificados por virus que son transcritos por la ARN polimerasa III (ARN pol III) [5, 6]. Tras el reconocimiento de una estructura de tallo-bucle dentro del pri-miRNA por la RNase III Drosha [7] y su cofactor DGCR8 [8], es decir, el complejo Microprocesador, el

El (pre) miARN precursor de 65 nucleótidos de largo es escindido y asumido por el factor Exportin 5 [9] para ser translocado al citoplasma. Allí, el pre-miRNA sufre un segundo evento de escisión, que está mediado por la RNase III Dicer [10], con la ayuda de su cofactor TRBP [11]. El pequeño dúplex de ARN resultante se ensambla en una proteína AGO, donde se desenrolla para mantener solo una de las dos cadenas [12], que se convierte en el miARN maduro de 22 nucleótidos de longitud. Se ha demostrado que este proceso requiere la ayuda de acompañantes como Hsp90 [13]. En los seres humanos, hay cuatro proteínas AGO, que pueden acomodar indiscriminadamente miARN (para una revisión, ver [14]). La proteína AGO cargada con un miARN, también conocida como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) [15], escanea la población de moléculas de ARNm dentro de la célula hasta que encuentra una secuencia coincidente. El proceso de focalización es complejo y ha sido objeto de una enorme cantidad de trabajo por parte de varios grupos, y no lo cubriremos en detalles aquí. Brevemente, el reconocimiento de la diana por el RISC involucra un puñado (6-8) de nucleótidos ubicados 5 'del miARN, y acuñó la semilla [16]. Debido a que el requisito de emparejamiento de miARN-ARNm que da como resultado una regulación eficiente por AGO es tan limitado, no es de extrañar que la gran mayoría del genoma codificante pueda ser regulado por miARN. De hecho, en la actualidad hay casi 2000 genes de miARN reportados solo para humanos [17], y las estimaciones conservadoras son que al menos el 60% de los ARNm son objetivos de miARN [18]. El mecanismo por el cual el miRISC regula su ARNm objetivo requiere una revisión por sí solo. Baste decir que implica el reclutamiento de una proteína adaptadora llamada GW182 o TNRC6 en humanos que, a su vez, interactuará con varias otras proteínas, lo que finalmente conducirá a la inhibición del inicio de la traducción y la desestabilización del ARNm por desadenilación (para una revisión, ver [ 19]).

Aunque aquí describimos los pasos clave involucrados en la biogénesis de miARN canónicos, hay una serie de formas alternativas que se han informado en la literatura mediante las cuales estos pequeños ARN también pueden madurar. Ya nos referimos a la implicación del RNA pol III en la transcripción de pri-miRNA, que hasta la fecha solo se ha reportado en pocos virus como el herpesvirus murido 4 (MuHV4), que sintetiza un híbrido de tRNA-pre-miRNA madurado por tRNasa Z [6], o el virus de la leucemia bovina [5]. El paso de maduración de Drosha no es obligatorio para hacer un miARN, hay varias formas independientes de Drosha para sintetizarlos. Los más conocidos son los mirtrones, que se generan mediante el corte y empalme del pre-miRNA a partir de un mRNA [20, 21]. Otros miARN se generan de manera independiente de Dicer, aunque son mucho más raros. En este caso, el pre-miRNA se carga directamente en AGO2, que escinde un brazo de la horquilla, antes de que el RNA resultante sea acortado por una exoribonucleasa [22].

Estas vías alternativas para la biogénesis de miARN destacan los diversos pasos que pueden desviarse y que, por lo tanto, están bajo un estricto control por parte de la célula. Dado el poder regulador de los miARN, es de suma importancia mantener su expresión bajo control y garantizar el control de calidad en todos y cada uno de los pasos del camino. Ahora sabemos que la regulación de la biogénesis de miARN ocurre desde la transcripción del pri-miARN hasta la estabilidad del producto de miARN maduro final (para una revisión general sobre la regulación de la biogénesis de miARN, ver [23]). Aquí, revisaremos el primer paso de la maduración de miARN mediada por el complejo microprocesador en el núcleo. Describiremos cómo ocurre antes de centrarnos en su regulación por varios cofactores que ayudan a controlar la homeostasis celular o la respuesta al estrés. Detallaremos más específicamente los cofactores de proteínas y su modo de acción, pero también se discutirán hallazgos recientes sobre modos alternativos de regulación del procesamiento de pri-miRNA.


INTRODUCCIÓN

La localización de ARNm es un mecanismo universal para impulsar de manera eficiente la selección de proteínas en eucariotas y procariotas. El direccionamiento de los ARNm facilita la acumulación de proteínas traducidas localmente en compartimentos celulares específicos y, por lo tanto, es un mecanismo esencial para establecer la polaridad celular, el patrón y la determinación del destino, así como la clasificación de proteínas (Herbert y Costa, 2019 Hughes y Simmonds, 2019 Tian et al., 2019b, 2020.

La localización del ARNm se produce como un proceso de varios pasos. Después de la transcripción, cis-los elementos que actúan (códigos postales de ARN) son reconocidos y vinculados por trans-factores que actúan, principalmente proteínas de unión a ARN (RBP) para formar un complejo primario de ARNm-nucleoproteína (mRNP). Después de la exportación al citoplasma, el complejo mRNP sufre una remodelación extensa con el reclutamiento de nuevos factores y el desprendimiento de otros que permiten el transporte basado en el citoesqueleto al sitio de destino (Blower, 2013 Weis et al., 2013 Tian y Okita, 2014).

Aunque se han adquirido amplios conocimientos sobre la localización de ARNm mediante estudios en Drosophila melanogaster, levadura (Saccharomyces cerevisiae) y células de mamíferos, solo han surgido unos pocos ejemplos de plantas superiores. El modelo mejor definido en plantas es la localización de ARNm de proteína de almacenamiento en arroz en desarrollo (Oryza sativa) células del endospermo, donde los ARNm que codifican glutelina y prolamina son reconocidos por RBP de código postal y transportados a dos subdominios distintos del retículo endoplásmico cortical (ER), el cisternal-ER y el cuerpo proteico-ER (PB-ER), respectivamente (Chou et al. , 2019 Tian et al., 2019b). La traducción de los ARNm de prolamina en el PB-ER da como resultado el ensamblaje de gránulos intracisternos de prolamina que forman un cuerpo proteico I derivado del RE (PB-I), mientras que los precursores de glutelina se exportan al aparato de Golgi y luego se transportan a las vacuolas de almacenamiento de proteínas (PSV). para procesamiento y almacenamiento (Chou et al., 2019 Tian et al., 2019b). Aunque se han identificado varias RBP asociadas al citoesqueleto necesarias para la localización del ARNm (Doroshenk et al., 2009, 2012), la información sobre cómo estos ARNm se transportan a distintos subdominios de ER sigue siendo difícil de alcanzar.

La evidencia emergente de los sistemas de modelos de hongos revela el vínculo íntimo del transporte de ARNm con el tráfico de membranas (Schmid et al., 2006 Jansen et al., 2014 Haag et al., 2015 Niessing et al., 2018). Varios ARNm de levadura, Candida albicans, y Ustilago maydis son co-transportados con ER móviles o endosomas de transporte (Schmid et al., 2006 Jansen et al., 2014 Haag et al., 2015 Pohlmann et al., 2015 Niessing et al., 2018). CENIZA1 así como otros ARNm se cotransportan en el RE tubular que se mueve hacia la yema emergente o la célula hija en la levadura. Este proceso está mediado por las RBP She2p y She3p, con She2p que tiene propiedades de unión a la membrana y She3p que actúa como una proteína adaptadora que une el mRNP-cER a la proteína Myo4P (Schmid et al., 2006 Niessing et al., 2018). los cdc3 El ARNm se transporta en los endosomas de transporte en el hongo de la obscenidad, U. maydis, un proceso que requiere la localización de la RBP Rrm4 en los endosomas y la interacción de una proteína enlazadora asociada a la membrana Upa1 con Rrm 4 (Pohlmann et al., 2015 Niessing et al., 2018). Parece que se necesitan proteínas adaptadoras específicas para enganchar mRNP en endosomas para el transporte activo a larga distancia. Más recientemente, se ha demostrado que los gránulos de ARN neuronal hacen autostop en lisosomas en movimiento utilizando anexina11 como atadura (Liao et al., 2019). Aunque se propuso que el co-transporte de ARNm con compartimentos membranosos era un mecanismo común en eucariotas superiores (Jansen et al., 2014), queda por determinar si el mecanismo es utilizado por plantas superiores.

Estudios anteriores sugirieron que la endocitosis y el tráfico de membranas probablemente juegan un papel en la localización del ARNm en las plantas. Por ejemplo, la pérdida de función de la pequeña GTPasa Rab5a y su factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) afín dio como resultado defectos en la endocitosis y el tráfico de membrana y la mala orientación de las proteínas glutelina a la prolamina que contiene PB-I, así como a la cuerpo paramural extracelular (PMB) en células de endospermo de arroz (Fukuda et al., 2011 Wen et al., 2015). Como la orientación de la proteína de almacenamiento está regulada por su localización de ARNm en las células del endospermo de arroz, la orientación incorrecta de las proteínas de glutelina en el mutante sugiere una relación entre el transporte endosómico y la localización de ARNm de glutelina en el arroz. La distribución extracelular de los ARNm de glutelina dentro de los PMB de un mutante que expresa un GEF defectuoso (Yang et al., 2018) respalda aún más la posible participación del tráfico endosómico en el transporte de ARNm de glutelina. Sin embargo, aún no se han establecido pruebas directas que muestren el cotransporte de ARNm de glutelina con endosomas de transporte y cómo el tráfico endosómico participa en la localización del ARNm de glutelina. Tal mala dirección de los ARNm de glutelina en líneas de arroz que expresan Rab5a mutante y GEF puede ser simplemente una consecuencia de la pleiotropía.

Estudios recientes (Tian et al., 2018, 2019a) identificaron dos RBP, RBP-P y RBP-L, que contienen dos y tres dominios de motivos de reconocimiento de ARN (RRM), respectivamente. Estas RBP se unen específicamente a las secuencias de ARNm del código postal de glutelina y regulan la localización del ARNm de glutelina. En este estudio, utilizando estas dos RBP de código postal de glutelina como puntos de entrada, identificamos sus socios interactuantes, el factor sensible a la n-etilmaleimida (NSF) y la pequeña GTPasa Rab5a, que participan en el tráfico de la membrana endosomal. Las cuatro proteínas pueden formar un complejo cuaternario que lleva ARNm de glutelina para el transporte activo en los endosomas a la membrana cortical del RE. La identificación de estas proteínas enlazadoras clave que permiten el transporte de ARNm mediado por endosomas en las células del endospermo de arroz proporciona nuevos conocimientos sobre cómo se pueden distribuir los ARNm en ubicaciones específicas en eucariotas.


MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo celular, construcciones de ADN y transfección

La línea celular HeLa se obtuvo mediante la American Type Culture Collection (ATCC, CCL-2, Manassas, VA, RRID: CVCL_0030). Las líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 (células HeLa) (Thermo Fisher Scientific, Monza MB, IT) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Thermo Fisher Scientific), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 μg / ml) y Glutamina 2 mM a 37 ° C en CO al 5%2. Los plásmidos que codifican las secuencias de las isoformas de HNRNPD (p45, p42, p40 y p37) fusionadas con la etiqueta FLAG fueron un regalo de R.J. Schneider, Departamento de Microbiología y Oncología Radioterápica, Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York. El plásmido que codifica SAF-A-FLAG wt fue un regalo de Nick Gilbert, Unidad de Genética Humana del MRC, Instituto de Genética y Medicina Molecular, Universidad de Edimburgo, Crewe Road, Edimburgo, Reino Unido. El plásmido que codifica la GFP-RNasa H1 humana fue un regalo de Robert Joseph Crouch, División de Biología del Desarrollo, Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU. Para generar los mutantes HNRNPD, clonamos en el vector pFLAG CMV-1, a través de los sitios EcoRI y BamHI, los ADN correspondientes amplificados por PCR a través de los cebadores enumerados en la Tabla complementaria S1. Para generar los mutantes HNRNPD para E. coli Se clonó la expresión en el vector pET-duet, a través de los sitios EcoRI y HindIII, los ADN correspondientes amplificados por PCR a través de los cebadores enumerados en la Tabla complementaria S1. Para generar líneas celulares HeLa que expresan de manera estable ER-AsiSI (17), las células se sembraron al 90% de confluencia en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 1 μg de pBABE ER-AsiSI (un obsequio de G. Legube, Centro de Biología Integrativa, Universidad Paul Sabatier, Francia) a través del reactivo Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). Las células que expresan ER AsiSI se seleccionaron usando puromicina (Sigma Aldrich S.r.l, Milan IT) a la concentración previamente optimizada de 5 µg / ml. Para los experimentos de silenciamiento, las células HeLa se transfectaron con ON-TARGETplus Human HNRNPD siRNA Dharmacon, 30 nM de siCTR (D-001810-10) o siHNRNPD (L-004079) usando Dharmafect 1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ARNip ON-TARGETplus están optimizados para lograr una alta reducción de los efectos fuera del objetivo. Las células knockout HeLa HNRNPD se generaron a través del sistema CRISPR-Cas9. Brevemente, las células se transfectaron con pSpCas9 (BB) -2A-Puro (PX459) V2.0 (18) (obsequio de Feng Zhang, plásmido Addgene n. ° 62988) que contiene ARN guía que se dirigen al exón dos de HNRNPD (5'-TCCTATCACAGGGCGATCAA-3 ′) Y se seleccionó con 5μg / ml de puromicina. Los clones de células generados se analizaron mediante transferencia Western y secuenciación para verificar la desactivación de HNRNPD.Para los experimentos de reconstitución, generamos las isoformas de HNRNPD resistentes a PAM a través del kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II (Agilent) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con los cebadores indicados en la Tabla complementaria S1.

Los plásmidos pCBASceI y pDRGFP fueron un regalo de Maria Jasin, el plásmido Addgene nº 26477 (19) y el plásmido Addgene nº 26475 (20), respectivamente.

Anticuerpos y western blot

Se utilizaron los siguientes anticuerpos: HNRNPD (1: 1000, 07-260, Millipore, RRID: AB_2117338), HNRNPD (1: 1000, D6O4F, Cell Signalling, Danvers, MA, RRID: AB_2616009), RPA32 (1: 5000, A300 –244A, Bethyl Laboratories, RRID: AB_185548), RPA32 S4 / S8 (1: 2000, A300–245A, Bethyl Laboratories), H3 (1: 1000, n.º 9715, señalización celular, RRID: AB_331563), CHK1 S345 (1: 1000, # 2348, señalización celular), CHK1 (1: 1000, # 2360, señalización celular), GAPDH (1: 1000, sc-25778, Santa Cruz, Dallas), MRE11 (1: 1000, NB100–142, Novus Biological ), EXOI (1: 1000, A302–640A, Bethyl Laboratories), CtIP (1: 1000, # 61142, Motivo activo) SAF-A (1: 1000, ab10297, Abcam), RAD17 S645 (1: 2000, ab3620, Abcam), FLAG-M2 (1: 1000, F1804, SIGMA Aldrich), etiqueta HA (1: 500, sc-805, Santa Cruz Biotechnology), Lamin A / C (1: 1000, # 4777, señalización celular), GFP (1: 5000, ab6556, Abcam), etiqueta His (1: 1000, 05-531, Millipore). Para la extracción de proteína total, las células se lisaron a 4 ° C en HEPES 50 mM pH 7,5, Triton X-100 al 1%, NaCl 150 mM, EGTA 5 mM, suplementado con cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa (Roche Applied Science). Los lisados ​​se clarificaron mediante centrifugación a 10000 xg durante 20 min. Los lisados ​​que contenían cantidades iguales de proteínas, estimadas mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad), se sometieron a una página SDS. Las imágenes quimioluminiscentes se obtuvieron utilizando ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare).

Inmunoprecipitación

Para la coinmunoprecipitación de proteínas, las células HeLa se lisaron en tampón de extracción de proteínas como para la transferencia Western. El lisado de proteína se cuantificó y 2 mg, para cada condición, se aclararon previamente con proteína G más agarosa (22851, Thermo Fischer Scientific) 45 min a 4 ° C en balanceo. La inmunoprecipitación se llevó a cabo a 4 ° C en balanceo durante la noche con FLAG-M2 (1 μg Ab a 1 mg de proteínas, F1804, Sigma Aldrich) y su control negativo IgG1 (BD Pharmingen ™), o HA-tag (5 μg Ab a 2 mg de proteínas, 000000011583816001, Sigma Aldrich) y su control negativo IgG2 (550339, BD Pharmingen ™).

Desplegable de RPA-ssDNA / dsDNA

El ensayo de extracción de ADN biotinilado se realizó según lo informado por Yang y Zou (21) con algunas modificaciones (ver Figura 1). Brevemente, 87 pmol de ssDNA biotinilado de 70 nt se hibridaron con 87 pmol de ssDNA de 21 nt, parcialmente complementario, para generar el intermedio de resección final de ADN utilizado como cebo en el cribado proteómico, o con la misma cantidad de otros ssDNA de diferente longitud. para generar fragmentos de ADN, ya sean romos o con diferente longitud de ADNss. Las reacciones se realizaron en tampón de hibridación (NaCl 20 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,5) durante 3 min a 90 ° C seguido de incubación de 15 min a 37 ° C en un baño de agua. El ADN recocido se unió a perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Thermo Fisher Scientific) en tampón de unión (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, glicerol al 10%, NP-40 al 0,01%) durante 15 min de oscilación a TA seguido de incubación con o sin RPA purificado a TA durante 30 min. Al final de la incubación, los complejos de perlas magnéticas recubiertos de ADN-estreptavidina se lavaron dos veces con el tampón de unión para eliminar las proteínas no unidas y, posteriormente, se incubaron con extracto de proteína de HeLa enriquecido para la fracción nuclear a temperatura ambiente durante 30 min, seguido de dos lavados antes. análisis de transferencia Western o LC / MS. Las secuencias de ADN utilizadas se enumeran en la Tabla complementaria S1.

Pantalla proteómica y capacidad de unión a cromatina HNRNPD. (A) Representación esquemática del cribado proteómico mediante el uso de una estructura de ADN sintético recubierto con el complejo heterotrimérico RPA wt, incluidas las isoformas de 70, 32 y 14 kDa, que se utilizó como cebo para el cribado proteómico después de ser desafiado con extractos nucleares HeLa. (B) Ensayo de extracción de ADN de la estructura de ADN sintético recubierto o no con el complejo de RPA recombinante producido en E. coli (entrada) seguido de análisis de transferencia Western con los anticuerpos indicados. El extracto nuclear de HeLa se incubó durante 30 min con 0,3 mg / ml de RNasa A en hielo, seguido de centrifugación para eliminar los desechos. (Las secuencias se enumeran en la Tabla complementaria S1). (C) Despliegue de ADN de las estructuras de ADN biotiniladas indicadas esquemáticamente (las secuencias se enumeran en la Tabla complementaria S1). La biotina se representa como puntos negros. El análisis de transferencia Western se realizó con los anticuerpos indicados. El asterisco indica una banda no específica (que aparece usando el anticuerpo Millipore). (D) Se realizó una purificación enriquecida con cromatina tras 2 h de tratamiento con 1 µM de CPT seguido de análisis de transferencia Western. El tratamiento con DNasa I de la primera fracción de sedimento (P) se realizó, cuando se indicó, con 80U de enzima durante 30 min a 30 ° C originando un nuevo sobrenadante y fracción de sedimento (S1 y P1 respectivamente). Todos los pasos de purificación se realizaron tras la incubación durante 30 min con 0,3 mg / ml de RNasa A en hielo, seguido de centrifugación para eliminar los desechos. Se utilizaron H3 y GAPDH como marcadores para la cromatina y las fracciones solubles, respectivamente. Se utilizó RAD17 S645 como control de daños en el ADN. (mi) Representación esquemática de mutantes por deleción de HNRNPD. (F) Se transfectaron células HeLa con el ADN indicado, seguido de 48 h de incubación. La purificación enriquecida con cromatina se realizó tras 2 h de tratamiento con 1 µM de CPT seguido de análisis de transferencia Western. Todos los pasos de purificación se realizaron tras la incubación durante 30 min con 0,3 mg / ml de RNasa A en hielo, seguido de centrifugación para eliminar los residuos. Se utilizaron H3 y GAPDH como marcadores para la cromatina y las fracciones solubles, respectivamente. Se utilizó RPA32 como control de daños en el ADN.

Pantalla proteómica y capacidad de unión a cromatina HNRNPD. (A) Representación esquemática del cribado proteómico mediante el uso de una estructura de ADN sintético recubierto con el complejo heterotrimérico RPA wt, incluidas las isoformas de 70, 32 y 14 kDa, que se utilizó como cebo para el cribado proteómico después de ser desafiado con extractos nucleares HeLa. (B) Ensayo de extracción de ADN de la estructura de ADN sintético recubierto o no con el complejo de RPA recombinante producido en E. coli (entrada) seguido de análisis de transferencia Western con los anticuerpos indicados. El extracto nuclear de HeLa se incubó durante 30 min con 0,3 mg / ml de RNasa A en hielo, seguido de centrifugación para eliminar los desechos. (Las secuencias se enumeran en la Tabla complementaria S1). (C) Despliegue de ADN de las estructuras de ADN biotiniladas indicadas esquemáticamente (las secuencias se enumeran en la Tabla complementaria S1). La biotina se representa como puntos negros. El análisis de transferencia Western se realizó con los anticuerpos indicados. El asterisco indica una banda no específica (que aparece usando el anticuerpo Millipore). (D) Se realizó una purificación enriquecida con cromatina tras 2 h de tratamiento con 1 µM de CPT seguido de análisis de transferencia Western. El tratamiento con DNasa I de la primera fracción de sedimento (P) se realizó, cuando se indicó, con 80U de enzima durante 30 min a 30 ° C originando un nuevo sobrenadante y fracción de sedimento (S1 y P1 respectivamente). Todos los pasos de purificación se realizaron tras la incubación durante 30 min con 0,3 mg / ml de RNasa A en hielo, seguido de centrifugación para eliminar los desechos. Se utilizaron H3 y GAPDH como marcadores para la cromatina y las fracciones solubles, respectivamente. Se utilizó RAD17 S645 como control de daños en el ADN. (mi) Representación esquemática de mutantes por deleción de HNRNPD. (F) Se transfectaron células HeLa con el ADN indicado, seguido de 48 h de incubación. La purificación enriquecida con cromatina se realizó tras 2 h de tratamiento con 1 µM de CPT seguido de análisis de transferencia Western. Todos los pasos de purificación se realizaron tras la incubación durante 30 min con 0,3 mg / ml de RNasa A en hielo, seguido de centrifugación para eliminar los residuos. Se utilizaron H3 y GAPDH como marcadores para la cromatina y las fracciones solubles, respectivamente. Se utilizó RPA32 como control de daños en el ADN.

Fraccionamiento celular

El fraccionamiento celular se realizó como lo describió anteriormente Ishii. et al. con modificaciones menores (22). Brevemente, se recolectaron 3 × 10 6 células, por condición, y se resuspendieron en 200 μl de tampón CSK (PIPES 10 mM pH 6,8, NaCl 100 mM, MgCl 300 mM2, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, Triton X-100 al 0,1%, sacarosa 0,34 M) suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa y se mantuvo durante 5 min en hielo. La fracción citoplásmica soluble (S) se separó de los núcleos (P) mediante centrifugación de 4 min a 1300 xga 4 ° C. La fracción P se lavó con CSK y luego se resuspendió en 200 μl de "tampón de transferencia Western", se sonicó y se centrifugó durante 30 min a 4 ° C a 10000 × g. Después de SDS-PAGE, las muestras se analizaron mediante transferencia Western con los anticuerpos indicados. Para el tratamiento con DNasa I, la fracción P se incubó con 80 U de DNasa I (Roche Applied Science, Mannheim Alemania) durante 30 min a 30 ° C seguido de 30 min de centrifugación a 1300 × ga 4 ° C para obtener la fracción solubilizada (S1) y pellet post DNasa A (P1).

Inmunofluorescencia y microirradiación UVC

Las células HeLa, cultivadas en cubreobjetos de vidrio, se fijaron con paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con tritón al 0,5%. Las muestras se bloquearon durante 10 min en BSA al 1% a TA y se incubaron durante 1 h con anti-BrdU (1: 200, 347580, BD Biosciences) o anti-γH2Ax S139 (1: 600, 05-636, Millipore) a 37 ° C. Después del lavado, las muestras se incubaron 45 min a 37 ° C con IgG (H + L) de pollo anti-conejo conjugado con AlexaFluor 594 y anti-ratón de conejo conjugado con 488 o anti-ratón de cabra conjugado con 555 (Life Technologies), y se analizaron con un microscopio confocal Zeiss LSM100.

La microirradiación UVC se realizó como lo describe Suzuki. et al. (23), luego se usaron los siguientes anticuerpos para la detección de proteínas HNRNPD (1: 200, 07-260, Millipore), γH2Ax S139 (1: 600, 05-636, Millipore).

Análisis de citometría de flujo

Tras 48 h después de la transfección con ARNip, las células HeLa se trataron o no con camptotecina 1 μM (CPT) (Sigma Aldrich) durante 2 hy se procesaron según lo informado por Forment. et al. (24) con algunas modificaciones. Brevemente, se resuspendieron 1 x 106 células HeLa, por condición, en tampón CSK + Triton al 0,5% + solución de RNasa A 0,3 mg / ml con inhibidores de proteasa y se incubaron durante 5 min en hielo. Al final de la incubación, las células se lavaron dos veces con tampón CSK seguido de centrifugación durante 3 min a 1300 xga 4 ° C. Posteriormente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min a TA, se lavaron dos veces en PBS1X y se resuspendieron en 100 μl de tampón de incubación (PBS 1 × + Saponina al 0,5%) durante 1 h con, RPA (1: 200, A300 -244A, Bethyl Laboratories) o γH2Ax S139 (1: 200, 05-636, Millipore) a 37 ° C. Después de dos lavados con tampón de incubación, las muestras se incubaron durante 45 minutos a 37 ° C con anti-conejo de pollo conjugado con Alexa Fluor 594 o anti-ratón de conejo conjugado con 488 (Thermo Fisher Scientific). El porcentaje de células positivas se determinó utilizando el software CellQuest (Becton Dickinson).

El ensayo de formación de ssDNA se realizó como se informó anteriormente (25) con algunas modificaciones. Brevemente, las células HeLa, 24 h después de la transfección con los ARNip indicados, se marcaron por pulsos durante 24 h adicionales con BrdU 10 μM y se trataron con CPT 1 μM durante 2 h. Para cuantificar la cantidad de ssDNA resecado, trabajamos en condiciones no desnaturalizantes. Las células se recolectaron mediante tripsinización. Después de lavar con PBS1X, se fijaron 1 x 106 células para cada punto experimental en PBS 1 x + paraformaldehído al 4% durante 15 min a TA seguido de permeabilización con PBS 1 x que contenía Triton X-100 al 0,1% durante 30 min a TA. Las células se lavaron en PBS 1 x dos veces y se resuspendieron en 100 μl de tampón de incubación (PBS 1 x + 0,5% de saponina) con el anticuerpo anti-BrdU (1: 100, clon B44, 347580, BD Biosciences) durante 1 ha TA. o simplemente tampón de incubación como control. Las células se lavaron con tampón de incubación y se resuspendieron con 100 µl de anti-ratón de conejo conjugado con 488 (Thermo Fisher Scientific) durante 45 min a TA. El porcentaje de células positivas para BrdU se determinó utilizando el software CellQuest (Becton Dickinson). El nivel umbral que identifica la positividad de FITC se estableció después de la comparación con las células incubadas solo con el anticuerpo secundario.

Preparación de extracto nuclear

Los extractos nucleares se prepararon como se informó anteriormente (26). La fracción nuclear se dializó durante la noche a 4 ° C en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, glicerol al 10%, NP-40 al 0,01%.

INTELIGENTE

SMART (análisis de una sola molécula de pistas de resección) se llevó a cabo como lo describió anteriormente Cruz-García et al. (27). El mismo número de células de control y silenciadas con HNRNPD se colocó en los portaobjetos, por lo que, presumiblemente, el mismo contenido de ADN se adjuntó a los portaobjetos, aunque no hemos evaluado esto. Sin embargo, se utilizó la técnica SMART para obtener una evaluación visual instantánea del efecto del silenciamiento de HNRNPD sobre la cantidad de ssDNA en masa sobre CPT.

Ensayo de resección ER-AsiSI

La extracción y preparación del ADN genómico para la medición de la resección en células de mamíferos se realizó como se describió anteriormente (28) con algunas modificaciones. Brevemente, las células HeLa, que expresan de manera estable el sistema ER-AsiSI (obsequio de Gaelle Legube CBI-Centre de Biologie Integrative-Toulouse), se trataron con o sin 300 nM de 4-OHT (Sigma Aldrich) durante 4 h. A continuación, las células se tripsinizaron y se resuspendieron en agarosa de baja gelificación al 0,6% (Sigma Aldrich) a una concentración de 6 x 106 células / ml. Se colocaron cincuenta microlitros de células en un trozo de Parafilm para producir una bola sólida de agar, que luego se resuspendió en 1 ml de tampón ESP (0,5 M EDTA, 2% norte-lauroilsarcosina, 1 mg / ml de proteinasa-K, CaCl 1 mM2, pH 8,0) durante 20 ha 16 ° C con rotación seguida de tratamiento con 1 ml de tampón HS (NaCl 1,85 M, KCl 0,15 M, MgCl 5 mM2, EDTA 2 mM, Tris 4 mM, Triton X-100 al 0,5%, pH 7,5) durante 20 ha 16 ° C con rotación. Después de 6 lavados de 10 min cada uno con PBS1X enfriado con hielo (Na 8 mM2HPO4, 1,5 mM KH2correos4, KCl 133 mM, MgCl 0,8 mM2, pH 7,4) a 4 ° C, la bola de agar se fundió a 70 ° C durante 15 min y luego se diluyó 15 veces con 70 ° C de ddH2O. El ADN se diluyó con un volumen igual de tampón 2X NEB 3.1. Se digirieron veinte microlitros de ADN genómico o se digirieron simuladamente con 20 unidades de BamHI-HF (NEB) durante la noche a 37 ° C. Se utilizaron cuatro microlitros como molde para la reacción de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) con los cebadores indicados utilizando la mezcla maestra en tiempo real SYBR Green (Thermo Fisher Scientific). Todas las reacciones de qRT-PCR se realizaron en un 7900HT fast-RealTimePCR (Applied Biosystem). El valor de ΔCt se calculó restando el valor de Ct de la muestra digerida de forma simulada del valor de Ct de la muestra digerida. El% ssDNA = 1 / (2 (ΔCt-1) +0,5) × 100 (28). Las secuencias de cebadores utilizados se enumeran en la Tabla complementaria S1.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

ChIP se llevó a cabo según lo informado por Lee et al. (29) con algunas modificaciones. Las células HeLa que expresan ER-AsiSI se trataron de forma simulada o se trataron con 300 nM de 4-OHT durante 1 h. Las células se reticularon con formaldehído al 1% durante 10 min a 37ºC seguido de inactivación con glicina 0,125 M. Las células se lavaron dos veces con PBS helado 1X para cada condición 1 x 106 células se resuspendieron en tampón de lisis ChIP (Tris-HCl 50 mM pH 8, EDTA 10 mM pH 8, SDS 0,1% e inhibidores de proteasa) y se incubaron 10 min en hielo seguido de sonicación (20 s-on / 10 s-off doce veces al 90% de amplitud usando Sonics Vibra-Cell Sonics, Newtown, CT, EE. UU.). El lisado se clarificó durante 30 min a 14 000 rpm a 4 ° C y se diluyó diez veces con el tampón de dilución (Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, SDS al 0,1% e inhibidores de proteasa). Se usó anticuerpo FLAG M2 (Sigma Aldrich) para inmunoprecipitar el peso de HNRNPD p45-FLAG o SAF-A-FLAG durante la noche a 4ºC. Para aislar los inmunocomplejos, se agregaron 20 μl de proteína G más agarosa (Thermo Fisher Scientific) a cada muestra y se incubaron, en balanceo, 45 min a 4 ° C. Los sedimentos se lavaron secuencialmente con tampón bajo en sal (SDS al 0,1%, Triton X-100 al 1%, EDTA 2 mM pH8, Tris-HCl 20 mM pH8, NaCl 50 mM), tampón con alto contenido de sal (SDS al 0,1%, Triton X al 1% -100, EDTA 2 mM pH 8, Tris-HCl 20 mM pH 8, NaCl 500 mM), tampón LiCl (LiCl 0,25 M, NP40 al 1%, EDTA 1 mM pH 8, ácido desoxicolato al 1%, pH Tris-HCl 10 mM 8) y tampón TE dos veces (Tris-HCl ph8 10 mM y EDTA 1 mM) seguido de reversión de enlace cruzado en tampón de elución (SDS al 1% y NaHCO 0,1 M3) con NaCl 270 mM a 65 ° C durante 4 h. La digestión de proteínas se llevó a cabo mediante la adición de EDTA 12 mM pH 8, Tris-HCl 54 mM pH 8 y 30 μg de proteinasa K durante 1 ha 45 ° C. El ADN se recuperó mediante extracción con fenol / cloroformo y se analizó, con los cebadores indicados, utilizando una mezcla maestra en tiempo real SYBR Green (Thermo Fisher Scientific). Todas las reacciones de qRT-PCR se realizaron en un 7900HT fast-RealTimePCR (Applied Biosystems). Las secuencias de cebadores utilizadas como qRT-PCR se enumeran en la Tabla complementaria S1 (28). Los datos se expresan como media ± desviación estándar. de tres experimentos independientes. La eficiencia de IP se calculó como% de ADN de entrada inmunoprecipitado.

Perfil del ciclo celular

Para el análisis del contenido de ADN, las células se fijaron en etanol al 70% helado a –20 ° C. Se analizaron al menos 10000 células mediante FACS (Becton Dickinson) tras la tinción con 5 mg / ml de yoduro de propidio y 0,25 mg / ml de tratamiento con ARNasa A (Sigma-Aldrich). Los datos se analizaron mediante el software CellQuest (Becton Dickinson).

PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN total se extrajo usando Trizol (Life Technologies) y se trató con TurboDNase (Life Technologies). Se retro-transcribió 1 µg de ARN utilizando el kit de síntesis de ADNc Superscript VILO (Life Technologies). Las muestras de ADNc se amplificaron mediante PCR con transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) con los cebadores enumerados en la Tabla complementaria S1. Los niveles de expresión se normalizaron a los del gen de la β-actina. HNRNPD, MRE11, CTIP y EXOI Los niveles de expresión en las células siHNRNPD se calcularon mediante el método 2 –ΔΔCt en relación con las células de control siCTR.

Ensayo de formación de colonias

Para los ensayos clonogénicos, se sembraron 300 células en placas de 24 pocillos y no se trataron o se trataron con las dosis indicadas de CPT u olaparib (Selleckem) y se incubaron durante 10 días. Las colonias se contaron después de la fijación con metanol y la tinción con violeta cristal.

Ensayo de resección terminal de ADN in vitro

Las proteínas nucleares de HeLa wt y HNRNPD KO cl10 se purificaron como se describe anteriormente para la preparación del extracto nuclear, seguido de diálisis durante la noche a 4 ° C en Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 50 mM, MgCl 2 mM2, DTT 1 mM y BSA 0,1 mg / ml. Se digirió un vector de plásmido de ADN con KpnI (salientes 5 '), HindIII (salientes 3') o EcoRV (extremos romos) seguido de purificación en columna (Qiagen, Germantown, MD, EE. UU.).Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 20 μl con 5 μg de proteínas nucleares, por condición, y 300 ng de vector de ADN linealizado para los tiempos indicados seguido de incubación en EDTA 10 mM, SDS al 0,25% y 100 μg / ml. proteinasa K durante 10 min a 37°C. Los productos de ADN separados en agarosa al 0,8% se tiñeron con bromuro de etidio.

Inmunoprecipitación de ADN-ARN (DRIP)

La inmunoprecipitación de ADN-ARN se llevó a cabo según lo informado por Li et al. (15) con algunas modificaciones. Se transfectaron HeLa ER-AsiSI con siCTR o siHNRNPD durante 48 h seguido de tratamiento con 4-OHT 300 nM durante 4 h. Para cada condición, se resuspendieron 5 x 106 células en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 + EDTA 0,5 mM) + SDS al 0,5% + proteinasa K a 300 μg / ml a 37 ° C durante la noche con agitación. Al final de la incubación, los híbridos de ADN: ARN se extrajeron con el protocolo de fenol / cloroformo, el precipitado se lavó con EtOH al 70% y se secó al aire. El sedimento se resuspendió en 100 μl de H2O y digeridos durante la noche con 50 U de cada una de las siguientes enzimas de restricción (BsaI, BstXI, NdeI, EcoRI, EcoRV) en tampón de restricción 1X. Los híbridos de ADN: ARN se purificaron a través de fenol / cloroformo. El sedimento se resuspendió en 50 µl de agua y se trató o se trató de forma simulada con 15 U de ARNasa H (18021071, Thermo Fischer Scientific) en un volumen final de 100 µl y se incubó durante la noche a 37 ° C. Los híbridos de ADN: ARN se purificaron mediante fenol / cloroformo y se resuspendieron en 50 μl de H2Se incubaron 5 μg de ADN digerido con 10 μg de anticuerpo S9.6 (ENH001, Kerafast) en tampón de unión (Tris-HCl 10 mM ph 7.5, EDTA 1 mM, NaPO 10 mM4, NaCl 140 mM, Triton X-100 al 0,05%) durante la noche a 4 ° C. Al final de la incubación, agregamos 20 μl de proteína G más agarosa (22851, Thermo Fischer Scientific) durante 2 ha 4 ° C en balanceo, lavado tres veces con tampón de unión y elución de inmunocomplejos con cinco veces de volumen de proteína G con 50 Tris-HCl mM pH 7,5, EDTA 10 mM, SDS al 0,5%, proteinasa K 500 μg / ml durante 45 min a 55 ° C. Los híbridos de ADN: ARN se purificaron con el protocolo de fenol / cloroformo y se resuspendieron en 50 μl de H2O.Se utilizaron cuatro microlitros como molde para la reacción de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) con cebadores que amplifican una región que está a ∼600 bp del sitio DSB inducido por AsiSI (enumerado en la Tabla complementaria S1 DSB-F / R ChIP y DRIP) utilizando la mezcla maestra en tiempo real SYBR Green (Thermo Fisher Scientific).

Clonación y purificación del complejo RPA

La clonación molecular del complejo wt RPA se realizó en el vector pET-duet con los cebadores enumerados en la Tabla complementaria S1. La purificación de wt RPA se realizó como se informó anteriormente (30). Brevemente, wt RPA se transformó en BL21 DE3 (Rosetta) seguido de inducción con IPTG 300 µM durante 4 h. El sedimento bacteriano se resuspendió en tampón de lisis (NaH 50 mM2correos4 pH 7, NaCl 300 mM, imidazol 15 mM y glicerol al 10% seguido de sonicación). La resina Ni-NTA se usó para purificación por afinidad durante 2 ha 4 ° C. Al final del tiempo de incubación, la resina se lavó seis veces con Tris-HCl 10 mM pH 8, NaCl 300 mM y una concentración escalar de imidazol de 10 mM a 60 mM. El complejo RPA se eluyó con Tris-HCl 10 mM pH 8, NaCl 300 mM e imidazol 300 mM. La diálisis se realizó durante la noche a 4 ° C con NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.5, glicerol al 10% y NP40 al 0.01%.

Ensayo indicador de recombinación homóloga

Se transfectaron células HeLa estables que expresaban el plásmido informador pDR-GFP con el plásmido pDR-GFP (20) (obsequio de Maria Jasin, plásmido Addgene nº 26475) y se seleccionaron con puromicina. Las líneas celulares HeLa pDRGFP se cotransfectaron con el plásmido codificante de la endonucleasa I-SceI (pCBA SceI, un regalo de Maria Jasin, plásmido Addgene nº 26477 (19) y el siCTR, siHNRNPD o siMRE11 (L-009271, Dharmacon). Después de 48 h de incubación, analizamos los valores de GFP (como una lectura de la frecuencia de FC) a través del análisis FACS.

Identificación por LC – MS / MS

La secuenciación de péptidos se realizó en una nanoescala mediante LC-ESI / MS-MS (31). El sistema LC – MS consta de PHOENIX 40 (ThermoQuest Ltd., Hemel Hempstead, Reino Unido) conectado al espectrómetro de masas LCQ DECA Ion-Trap (Finnigan, San José, CA, EE. UU.). Se inyectaron veinte microlitros de soluciones digeridas con tripsina en una válvula de seis puertos y se atraparon en una columna de captura C18 (20 mm × 100 μm DI × 360 μm OD, Nano-separaciones, Nieuwkoop, NL) utilizando agua de grado HPLC al 100% + Ácido fórmico al 0,1% v / v (disolvente A) a un caudal de 5 μl / min durante 10 min. Un limitador divisor de precolumna permitió establecer la velocidad de flujo en 100-125 nl / min en una columna analítica C18 (30 cm × 50 μm ID × 360 μm OD, nano-separaciones). La separación analítica se realizó usando un gradiente lineal de hasta 60% de acetonitrilo + 0,1% (v / v) de ácido fórmico (disolvente B) durante 60 min. Al final de la separación, las columnas de captura y analíticas se lavaron durante 10 min en disolvente B al 100% y se equilibraron durante 10 min en disolvente A al 100%. Una aguja ESI, compuesta de sílice fundida recubierta de oro (5 cm × 25 μm DI × 360 μm OD, nano-separaciones), se calentó a 195 ° C y se aplicó 2 kV para una operación de pulverización estable. El software Xcalibur ™ 1.2 (Thermo) gestionó la bomba LC y el registro espectral automático. La búsqueda de iones MS / MS se realizó en las bases de datos Swiss-Prot / UniprotKB utilizando MASCOT. Nosotros definimos Homo sapiens como taxonomía, carga del precursor del péptido a 2+ o 3+, tolerancia de masa a ± 1,2 Da para el péptido precursor y ± 0,6 Da para péptidos de fragmentos, solo un sitio de escisión perdido como aceptable, carbamidometilación de cisteína como modificación fija y oxidación de metionina como posible modificación. Los péptidos con puntuaciones de iones individuales de –10 * log [P] se consideraron significativos. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios de PRIDE (32) con el identificador de conjunto de datos PXD012045 y 10.6019 / PXD012045.

Análisis estadístico y reproducibilidad

Estudiante emparejado de dos caras t La prueba se utilizó para comparar las medias de dos grupos emparejados. PAG & lt 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los experimentos representativos se muestran a partir de al menos dos independientes información detallada (número de experimentos independientes, PAG-valores) se enumeran en las leyendas de las figuras individuales.


RESULTADOS

C6orf203 tiene un dominio de unión de ARN de tipo S4 predicho

El análisis BLAST reveló un dominio de unión a ARN similar a S4 dentro de la proteína C6orf203 humana (Figura 1A). Este dominio recibió su nombre a través de su identificación inicial en la proteína ribosomal integral procariota S4 (RPS4) (14). RPS4 se une al ARNr 16S en la subunidad 30S en maduración del ribosoma bacteriano y promueve el plegamiento correcto del ARNr durante el ensamblaje de la subunidad ribosómica (21), así como también se une a su propio ARNm para reprimir la traducción (22). La proteína RPS4 consta de dos dominios de unión al ARN (Figura 1A), los cuales forman contactos extensos con el ARNr en la subunidad 30S (23). Sin embargo, es el dominio C-terminal de RPS4, denominado dominio de unión de ARN similar a S4, el que demuestra la conservación del dominio C-terminal de C6orf203 (Figura 1A). Comparación del plegamiento predicho del dominio de unión de ARN de tipo S4 de C6orf203 con el dominio de unión de ARN de tipo S4 previamente resuelto de Escherichia coli RPS4 (PDB: 3J9Y) sugiere conservación estructural entre los dos dominios (Figura 1B y C), caracterizada por un paquete α-helicoidal empacado contra láminas β antiparalelas (23).

C6orf203 contiene un dominio de unión a ARN similar a S4 (A). Arquitectura de dominio de una selección diversa de proteínas que contienen dominios de unión a ARN similares a S4, que incluyen Homo sapiens C6orf203 (Q9P0P8), Escherichia coli Proteína ribosómica 30S S4 (RPS4) (P0A7V8), Clostridium sporogenes NJ4 rRNA metiltransferasa (A0A2P8MJ46), E. coli tirosil-tRNA sintetasa (P0AGJ9) y Saccharomyces cerevisiae proteína bifuncional RIB2 pseudouridina sintetasa (Q12362). Las proteínas se alinean con respecto a su dominio similar a S4 (azul) con dominios funcionales caracterizados adicionales indicados para cada proteína. Dominios funcionales adicionales: NS4 / S9 - dominio de unión de ARN N-terminal S4 / S9 FtsJ, sintetizador de ARNt de metiltransferasa similar a FtsJ, dominio de ARNt sintetasa de clase I (W e Y), pseudoU sintet, ARN pseudouridilato sintetasa. (B) Estructura previamente resuelta de E. coli proteína ribosómica S4 (PDB: 3J9Y). El dominio de unión al ARN de tipo S4 C-terminal se agranda y se resalta en amarillo. (C) Predicción estructural del dominio de unión a ARN de tipo S4 de C6orf203 humano. La predicción se generó en SWISS-MODEL (38) utilizando los residuos de secuencia primaria 143-216 de C6orf203 humano (Q9P0P8), y se modeló en USCF Chimera (39). (D) Alineación de múltiples secuencias de proteínas del dominio de unión al ARN de tipo S4 de varias proteínas miembros de la familia, que incluyen H. sapiens C6orf203. La alineación de la secuencia de proteínas se construyó utilizando Clustal Omega (40). Las posiciones conservadas están sombreadas utilizando la regla de consenso del 80%. Las clases de aminoácidos utilizadas en la construcción del consenso fueron las siguientes: rojo, residuos polares verdes, residuos hidrófobos recuadros grises, residuos pequeños. Los nombres de las proteínas son los asignados en UniProt: RPS4_E. coli: proteína ribosomal S4, Escherichia coli (P0A7V8) RS4 (cloroplasto) _M. palacea: proteína ribosomal de cloroplasto S4, Marchantia paleacea (P06358) RPS9_H. sapiens: Proteína ribosómica 40S S9, Homo sapiens (P46781) rRNA metilasa_C. sporogenes: ARNr metiltransferasa, Clostridium sporogenes (A0A2P8MJ46) TyrS_E. coli: Tirosil-tRNA sintetasa, Escherichia coli (P0AGJ9) RIB2_S. cerevisiae: RIB2, Saccharomyces cerevisiae (Q12362). (mi) Ensayo de cambio de movilidad electroforética de ARN (EMSA) que indica la preferencia de C6orf203 para la unión de ARN bicatenario. Se incubó C6orf203 humano recombinante con ARN marcados con fluoresceína (100 nM). Las secuencias de molde de ARN utilizadas fueron las indicadas (posición nt en el ADNmt). Las concentraciones de proteína utilizadas fueron 0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.36, 0.64, 1.28, 2.56 μM, respectivamente. (F) Cuantificación de la proporción de ligando de ARN no unido en relación con la no adición de proteína C6orf203, como en la Figura 1E. Constante de disociación (KD) del ligando de ARN con C6orf203 está indicado para experimentos en los que podría determinarse.

C6orf203 contiene un dominio de unión a ARN similar a S4 (A). Arquitectura de dominio de una selección diversa de proteínas que contienen dominios de unión a ARN similares a S4, que incluyen Homo sapiens C6orf203 (Q9P0P8), Escherichia coli Proteína ribosómica 30S S4 (RPS4) (P0A7V8), Clostridium sporogenes NJ4 rRNA metiltransferasa (A0A2P8MJ46), E. coli tirosil-tRNA sintetasa (P0AGJ9) y Saccharomyces cerevisiae proteína bifuncional RIB2 pseudouridina sintetasa (Q12362). Las proteínas se alinean con respecto a su dominio similar a S4 (azul) con dominios funcionales caracterizados adicionales indicados para cada proteína. Dominios funcionales adicionales: NS4 / S9 - dominio de unión de ARN N-terminal S4 / S9 FtsJ, sintetizador de ARNt de metiltransferasa similar a FtsJ, dominio de ARNt sintetasa de clase I (W e Y), pseudoU sintet, ARN pseudouridilato sintetasa. (B) Estructura previamente resuelta de E. coli proteína ribosómica S4 (PDB: 3J9Y). El dominio de unión al ARN de tipo S4 C-terminal se agranda y se resalta en amarillo. (C) Predicción estructural del dominio de unión a ARN de tipo S4 de C6orf203 humano. La predicción se generó en SWISS-MODEL (38) utilizando los residuos de la secuencia primaria 143-216 de C6orf203 humano (Q9P0P8), y se modeló en USCF Chimera (39). (D) Alineación de múltiples secuencias de proteínas del dominio de unión a ARN de tipo S4 de varias proteínas miembros de la familia, que incluyen H. sapiens C6orf203. La alineación de la secuencia de proteínas se construyó utilizando Clustal Omega (40). Las posiciones conservadas están sombreadas utilizando la regla de consenso del 80%. Las clases de aminoácidos utilizadas en la construcción del consenso fueron las siguientes: rojo, residuos polares verdes, residuos hidrófobos recuadros grises, residuos pequeños. Los nombres de las proteínas son los asignados en UniProt: RPS4_E. coli: proteína ribosómica S4, Escherichia coli (P0A7V8) RS4 (cloroplasto) _M. palacea: proteína ribosomal de cloroplasto S4, Marchantia paleacea (P06358) RPS9_H. sapiens: Proteína ribosómica 40S S9, Homo sapiens (P46781) rRNA metilasa_C. sporogenes: ARNr metiltransferasa, Clostridium sporogenes (A0A2P8MJ46) TyrS_E. coli: Tirosil-tRNA sintetasa, Escherichia coli (P0AGJ9) RIB2_S. cerevisiae: RIB2, Saccharomyces cerevisiae (Q12362). (mi) Ensayo de cambio de movilidad electroforética de ARN (EMSA) que indica la preferencia de C6orf203 para la unión de ARN bicatenario. Se incubó C6orf203 humano recombinante con ARN marcados con fluoresceína (100 nM). Las secuencias de molde de ARN utilizadas fueron las indicadas (posición nt en el ADNmt). Las concentraciones de proteína utilizadas fueron 0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.36, 0.64, 1.28, 2.56 μM, respectivamente. (F) Cuantificación de la proporción de ligando de ARN no unido en relación con la no adición de proteína C6orf203, como en la Figura 1E. Constante de disociación (KD) del ligando de ARN con C6orf203 está indicado para experimentos en los que podría determinarse.

El dominio de unión de ARN de tipo S4 consta de 60 a 65 aminoácidos, con residuos clave conservados que coordinan la unión de ARN (Figura 1D). El dominio similar a S4 se ha encontrado en una amplia gama de proteínas que interactúan con el ARN en diferentes especies. La ubicación exacta del dominio similar a S4 puede variar dentro de la secuencia de proteínas y, a menudo, se encuentra en combinación con dominios de proteínas funcionales adicionales, incluidos aquellos que confieren actividad enzimática (Figura 1A). Se realizó la alineación de secuencias primarias de proteínas a lo largo de la filogenia para demostrar la diversidad de proteínas que contienen dominios similares a S4: H. sapiens proteína ribosomal S9, E. coli tirosil-tRNA sintetasa, Marchantia paleacea proteína ribosomal del cloroplasto S4, C. sporogenes ARNr metiltransferasa, S. cerevisiae proteína bifuncional RIB2 pseudouridilato sintasa (Figura 1A y D). El dominio similar a S4 proporciona la capacidad de unión de ARN a estas proteínas, colocando los dominios funcionales en sus ARN afines (14). Si bien el papel biológico de estos dominios adicionales se ha caracterizado en muchas de estas proteínas (Figura 1A), nuestros intentos de predecir dominios funcionales previamente caracterizados en C6orf203, además del dominio similar a S4, mediante la búsqueda BLAST o la predicción iTASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement (24)), no tuvieron éxito.

Con evidencia que sugiere que C6orf203 contiene un dominio de unión de ARN funcional similar a S4, buscamos determinar si el C6orf203 humano recombinante posee la capacidad de unirse a ARN in vitro mediante la realización de ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA). EMSA no indicó afinidad de C6orf203 a una plantilla de ARN monocatenario (ss) marcado con fluoresceína (una porción de ARNm de ATP6, ADNmt nt. 8657-8685) (Figura 1E y F). Por el contrario, cuando se incubó con moldes de ARN bicatenario (ds), ya sea porciones de ARNmt 16S (ADNmt nt. 1919-1985) o ARNmt Pro (ADNmt 15956-16023), C6orf203 demostró afinidad de unión (Figura 1E y F), con KD valores de 0,23 y 0,29 μM, respectivamente. Además, repetimos nuestro EMSA C6orf203 con mt-tRNA Pro dsRNA marcado con fluoresceína en presencia de ssRNA sin marcar o moléculas de dsRNA estructuradas a una concentración 100 veces mayor que el mt-tRNA Pro marcado (Figura complementaria S1B). Si bien el mt-tRNA Pro dsRNA sin marcar tuvo éxito en competir con el RNA marcado, evitando la unión de C6orf203, no se observó tal competencia para la plantilla de ssRNA sin marcar, lo que respalda la noción de que C6orf203 se une preferentemente al ARN estructurado sobre las plantillas lineales. Juntos, estos datos sugieren que C6orf203 posee capacidad de unión a ARN, con especificidad para la unión a ds y / o ARN altamente estructurado.

C6orf203 se localiza en la matriz mitocondrial

A continuación, buscamos caracterizar la localización subcelular de C6orf203. Según el inventario de MitoCarta 2.0, se predice que C6orf203 se localizará en las mitocondrias en humanos (13). Para confirmar la predicción, realizamos inmunocitoquímica (ICC) de células de osteosarcoma 143B humano (HOS) transfectadas transitoriamente con ADNc de C6orf203 marcado con una etiqueta de epítopo FLAG C-terminal (C6orf203 :: FLAG). Las imágenes ICC resultantes indicaron una fuerte colocalización de C6orf203 :: FLAG con MitoTracker Red CMXRos (Figura 2A), lo que indica una localización predominantemente mitocondrial de la proteína C6orf203 :: FLAG recombinante.

C6orf203 se localiza en la matriz mitocondrial de las células humanas. (A) Localización intracelular de C6orf203 mediante inmunocitoquímica. C6orf203 :: BANDERA El ADNc se transfectó transitoriamente en células HOS. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). El producto proteico C6orf203 :: FLAG se detectó mediante un anticuerpo anti-FLAG y se visualizó usando un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (verde). Las mitocondrias se visualizaron usando MitoTracker Red CMXRos (rojo). Una imagen fusionada digitalmente de las señales DAPI, Alexa Fluor 488 y MitoTracker revela la colocalización de C6orf203 :: FLAG con la barra de escala de la red mitocondrial = 10 μm. (B) Fraccionamiento subcelular de células HEK293T que expresan la proteína C6orf203 :: FLAG. Los lisados ​​de células HEK293T se fraccionaron en fracciones citosólicas y mitocondriales. Además, se trataron alícuotas de las fracciones mitocondriales con 25 μg / ml de Proteinasa K con o sin tratamiento con Triton X-100 al 1%. Las fracciones (40 μg) se analizaron mediante transferencia Western y se evaluó la localización de C6orf203 :: FLAG en comparación con la de los marcadores proteicos del citosol (proteína ribosómica citosólica uL1), la membrana mitocondrial externa (TOM20) y la matriz mitocondrial (ribosoma mitocondrial proteína uL3m y uS15m). T, lisado celular total D, detritos C, fracción citosólica.

C6orf203 se localiza en la matriz mitocondrial de las células humanas. (A) Localización intracelular de C6orf203 mediante inmunocitoquímica. C6orf203 :: BANDERA El ADNc se transfectó transitoriamente en células HOS. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). El producto proteico C6orf203 :: FLAG se detectó mediante un anticuerpo anti-FLAG y se visualizó usando un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (verde). Las mitocondrias se visualizaron usando MitoTracker Red CMXRos (rojo). Una imagen fusionada digitalmente de las señales DAPI, Alexa Fluor 488 y MitoTracker revela la colocalización de C6orf203 :: FLAG con la barra de escala de la red mitocondrial = 10 μm. (B) Fraccionamiento subcelular de células HEK293T que expresan la proteína C6orf203 :: FLAG. Los lisados ​​de células HEK293T se fraccionaron en fracciones citosólicas y mitocondriales. Además, se trataron alícuotas de las fracciones mitocondriales con 25 μg / ml de Proteinasa K con o sin tratamiento con Triton X-100 al 1%. Se analizaron fracciones (40 μg) mediante transferencia Western y se evaluó la localización de C6orf203 :: FLAG en comparación con la de los marcadores proteicos del citosol (proteína ribosómica citosólica uL1), la membrana mitocondrial externa (TOM20) y la matriz mitocondrial (ribosoma mitocondrial proteína uL3m y uS15m).T, lisado celular total D, detritos C, fracción citosólica.

A continuación, generamos una línea celular HEK293T, que permitió la sobreexpresión inducible de C6orf203 :: FLAG a través del sistema Flp-In TREx (Invitrogen). El fraccionamiento subcelular de células HEK293T que sobreexpresan C6orf203 :: FLAG apoyó aún más nuestros hallazgos de ICC de que C6orf203 se localiza en mitocondrias humanas (Figura 2B). Aunque la señal FLAG para C6orf203 :: FLAG era demasiado débil para detectarla en el lisado total (T), C6orf203 :: FLAG era evidente en la fracción mitocondrial, lo que indica una localización enriquecida de la proteína en las mitocondrias (Figura 2B). Después del tratamiento con proteinasa K de mitocondrias aisladas, C6orf203 :: FLAG permanece intacto, similar al comportamiento de las proteínas de la subunidad del mitoribosoma uL3m y uS15m, mientras que la proteína ribosómica citosólica uL1 y la proteína de la membrana mitocondrial externa TOM20 son degradadas por el tratamiento con proteinasa K (Figura 2B). Esto indica que la proteína C6orf203 :: FLAG permanece protegida de la proteólisis dentro de las mitocondrias. Juntos, estos resultados confirman que C6orf203 se localiza en las mitocondrias en células cultivadas humanas.

La expresión del gen mitocondrial se altera en ausencia de C6orf203

Como los resultados de EMSA han sugerido que C6orf203 puede tener capacidad de unión a ARN (Figura 1E), buscamos explorar el papel de C6orf203 en la expresión del gen mitocondrial. Para investigar esto, se produjeron varias líneas celulares HEK293T knockout (KO) utilizando tecnología CRISPR / Cas9 (15) y se confirmó el knockout mediante transferencia Western (Figura 3A) y análisis de PCR (Figura complementaria S2B). Se eligieron KO 1 y KO 4 para análisis futuros.

La expresión del gen mitocondrial se altera en ausencia de C6orf203. (A) Western blot para confirmar la eliminación de C6orf203 en las líneas HEK293T KO 1, KO 2, KO 4 y KO 6. El lisado total de los clones WT y KO se resolvió mediante SDS-PAGE, se realizó la inmunotransferencia y se sondaron las membranas con anticuerpo anti-C6orf203 y anti-GAPDH como control de carga. (B) Curva de crecimiento de las células WT HEK293T y C6orf203 KO en DMEM que contiene 0,9 g / l de galactosa (se realizaron tres réplicas biológicas y se indica el número medio de células promedio en cada punto de tiempo, barras de error = 1 DE). (C) Western blot de subunidades OXPHOS en líneas C6orf203 KO. El lisado total de WT HEK293T y C6orf203 KO 1 y KO 4 se resolvió mediante SDS-PAGE Se realizó una transferencia Western y se sondaron las membranas con anticuerpos contra C6orf203 y tanto codificados por ADNmt (COX1, COX2) como codificados por el núcleo (NDUFB8, SDHA, ATP5a ) Subunidades OXPHOS. Se usó anticuerpo anti-VDAC1 como control de carga. (D) Se realizó una transferencia de Western en el control HEK293T (WT), células C6orf203 KO 1 y células KO 1 que expresan C6orf203 :: FLAG (KO 1 + C6 :: F) que se usaron para Oxygraph en (E). Se realizó la tinción de anticuerpos contra C6orf203 para confirmar la desactivación de C6orf203 y la reexpresión de la proteína C6orf203 :: FLAG. Se utilizó α-tubulina como control de carga. (mi) Relación de respiración mitocondrial máxima y basal (cada una expresada en pmol de flujo de oxígeno / mg de proteína) medida por oxígrafo de Oroboros. La respiración máxima se midió después de la permeabilización de las células (con Digitonin), la inhibición del complejo V (con Oligomicina) y el tratamiento con el protonóforo (CCCP) (norte = 3, * PAG-valor = 0.0308). (F) BN-PAGE y actividades en gel de las actividades del complejo I, complejo II, complejo IV y complejo V en extractos de proteínas mitocondriales de clones WT, C6orf203 KO y células KO 1 que expresan C6orf203 :: FLAG (KO 1 + C6 :: F) . Se muestra que la tinción de Coomassie del gel indica una carga igual. El asterisco indica F acumulada1-que contiene subcomplejos del complejo V.

La expresión del gen mitocondrial se altera en ausencia de C6orf203. (A) Western blot para confirmar la eliminación de C6orf203 en las líneas HEK293T KO 1, KO 2, KO 4 y KO 6. El lisado total de los clones WT y KO se resolvió mediante SDS-PAGE, se realizó la inmunotransferencia y se sondaron las membranas con anticuerpo anti-C6orf203 y anti-GAPDH como control de carga. (B) Curva de crecimiento de las células WT HEK293T y C6orf203 KO en DMEM que contiene 0,9 g / l de galactosa (se realizaron tres réplicas biológicas y se indica el número medio de células promedio en cada punto de tiempo, barras de error = 1 DE). (C) Western blot de subunidades OXPHOS en líneas C6orf203 KO. El lisado total de WT HEK293T y C6orf203 KO 1 y KO 4 se resolvió mediante SDS-PAGE Se realizó una transferencia Western y se sondaron las membranas con anticuerpos contra C6orf203 y tanto codificados por mtDNA (COX1, COX2) como codificados por el núcleo (NDUFB8, SDHA, ATP5a ) Subunidades OXPHOS. Se usó anticuerpo anti-VDAC1 como control de carga. (D) Se realizó una transferencia de Western en el control HEK293T (WT), células C6orf203 KO 1 y células KO 1 que expresan C6orf203 :: FLAG (KO 1 + C6 :: F) que se usaron para Oxygraph en (E). Se realizó la tinción de anticuerpos contra C6orf203 para confirmar la desactivación de C6orf203 y la reexpresión de la proteína C6orf203 :: FLAG. Se utilizó α-tubulina como control de carga. (mi) Relación de respiración mitocondrial máxima y basal (cada una expresada en pmol de flujo de oxígeno / mg de proteína) medida por oxígrafo de Oroboros. La respiración máxima se midió después de la permeabilización de las células (con Digitonin), la inhibición del complejo V (con Oligomicina) y el tratamiento con el protonóforo (CCCP) (norte = 3, * PAG-valor = 0.0308). (F) BN-PAGE y actividades en gel de las actividades del complejo I, complejo II, complejo IV y complejo V en extractos de proteínas mitocondriales de clones WT, C6orf203 KO y células KO 1 que expresan C6orf203 :: FLAG (KO 1 + C6 :: F) . Se muestra que la tinción de Coomassie del gel indica una carga igual. El asterisco indica F acumulada1-que contiene subcomplejos del complejo V.

Para evaluar la función mitocondrial en las líneas de eliminación de C6orf203, los clones se cultivaron en medios que contenían galactosa como única fuente de carbono, lo que obliga a las células a depender casi por completo de las mitocondrias para la producción de ATP. Se observó una capacidad reducida de los clones KO para proliferar en medio de galactosa en relación con el crecimiento de la población de la línea celular HEK293T de tipo salvaje (WT) (Figura 3B), lo que sugiere una disfunción mitocondrial.

Para investigar más a fondo esta observación, se realizó una transferencia de Western de las subunidades de OXPHOS, lo que indica una reducción leve en los niveles de estado estacionario de los componentes del complejo I (NDUFB8) y IV (COX1 y COX2) (Figura 3C), lo que sugiere que el knockout de C6orf203 interfiere con expresión de genes mitocondriales.

Para confirmar que la deficiencia de OXPHOS observada se debió a la pérdida de la proteína C6orf203, complementamos el clon KO 1 a través del sistema Flp-In T-Rex para permitir la expresión inducible del ADNc de C6orf203 :: FLAG de tipo salvaje (Figura 3D). A continuación, medimos las tasas de consumo de oxígeno en líneas celulares knockout y complementadas. La relación entre la respiración máxima y la respiración basal se redujo modestamente en ausencia de C6orf203 (Figura 3E), que estaba en línea con la disminución moderada de los niveles de estado estable de los componentes de los complejos OXPHOS. Esta leve disminución se rescató mediante la reexpresión de la proteína C6orf203 :: FLAG, lo que también confirma que la proteína etiquetada con FLAG puede sustituir funcionalmente al C6orf203 endógeno.

Además, la actividad en gel de los complejos de OXPHOS se analizó tanto para las líneas knockout como para las complementadas (Figura 3F). La actividad de los complejos I, II y IV no cambió o se vio levemente afectada para los clones de KO ensayados (Figura 3F). Sin embargo, al teñir la actividad en gel del complejo V, observamos la actividad derivada de los complejos de masa molecular reducida en relación con la F1F0 holoenzima (Figura 3F). Debido a la presencia de hidrólisis de ATP, es probable que se formen debido a F1-que contienen subcomplejos. Esto sugiere que se está produciendo un defecto de ensamblaje leve en el complejo V en ausencia de C6orf203, que se rescata tras la reexpresión de C6orf203 :: BANDERA ADNc (Figura 3F). Juntos, estos resultados apoyan que C6orf203 contribuye a la integridad eficiente de OXPHOS dentro de las mitocondrias, debido al fenotipo leve presente en la ablación de C6orf203.

A la luz de la localización de C6orf203 en las mitocondrias, buscamos determinar si el fenotipo leve de OXPHOS en C6orf203 KO era directamente atribuible a un defecto en la expresión del mtDNA. El etiquetado metabólico de los productos de traducción mitocondrial indicó un fuerte defecto de traducción general en los clones de KO independientes (aproximadamente el 50% en comparación con el control, norte = 3), que fue restaurado tras la expresión de C6orf203 :: BANDERA ADNc en KO 1 (Figura 4A). Como nuestros hallazgos anteriores (Figuras 1E y 2) sugieren que C6orf203 puede funcionar como una proteína de unión a ARN mitocondrial, a continuación investigamos si la alteración del transcriptoma mitocondrial era un factor subyacente al defecto de traducción mitocondrial observado en C6orf203 KO. Sin embargo, la transferencia Northern de todos los ARNm, ARNr y ARNt codificados por ADNmt (Figura 4B, C y D) no indicó ningún cambio en los niveles de estado estacionario, ni alteración en el procesamiento del ARN, que explicaría el defecto de traducción mitocondrial general severo observado. .

La eliminación de C6orf203 conduce a una menor traducción mitocondrial sin afectar los niveles de estado estacionario de los ARN mitocondriales. (A) Traducción mitocondrial en líneas celulares C6orf203 KO. Tras la inhibición de la traducción citosólica, los productos de la traducción mitocondrial se marcaron con [35 S] -metionina en clones WT, C6orf203 KO y células KO 1 que expresan C6orf203 :: FLAG (KO 1 + C6 :: F, los números indican los clones 1 y 2) . Las proteínas mitocondriales se separaron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante autorradiografía. Se proporciona tinción con azul brillante de Coomassie (CBB) para confirmar la carga de proteína igual. Se utilizó inmunotransferencia para mostrar la expresión de C6orf203. (B) Northern blot de mRNA mt (B), mt-rRNA (C) y mt-tRNA (D) para clones WT y C6orf203 KO. Se usó ARNr 28S y 18S codificado nuclearmente como control de carga para ARNm de mt y ARNm de mt, y se usó ARNt citosólico (Triptófano) como control de carga para transferencias de ARNtmt.

La eliminación de C6orf203 conduce a una menor traducción mitocondrial sin afectar los niveles de estado estable de los ARN mitocondriales. (A) Traducción mitocondrial en líneas celulares C6orf203 KO. Tras la inhibición de la traducción citosólica, los productos de la traducción mitocondrial se marcaron con [35 S] -metionina en clones WT, C6orf203 KO y células KO 1 que expresan C6orf203 :: FLAG (KO 1 + C6 :: F, los números indican los clones 1 y 2) . Las proteínas mitocondriales se separaron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante autorradiografía. Se proporciona tinción con azul brillante de Coomassie (CBB) para confirmar la carga de proteína igual. Se utilizó inmunotransferencia para mostrar la expresión de C6orf203. (B) Northern blot de mt-mRNAs (B), mt-rRNAs (C) y mt-tRNA (D) para clones WT y C6orf203 KO. Se usó ARNr 28S y 18S codificado nuclearmente como control de carga para ARNm de mt y ARNm de mt, y se usó ARNt citosólico (Triptófano) como control de carga para transferencias de ARNtmt.

C6orf203 interactúa con la subunidad grande ribosomal mitocondrial

Como no se observó ningún cambio en el nivel de estado estable de ninguna de las transcripciones mitocondriales, a continuación buscamos identificar interacciones específicas de C6orf203, ya que esto puede proporcionar más información sobre el mecanismo subyacente del defecto de traducción mitocondrial observado. Después de la inducción de C6orf203 :: FLAG en nuestra línea HEK293T que sobreexpresa, se realizó la inmunoprecipitación (IP) de FLAG sin reticulación. Para controlar la unión no específica, se expresó luciferasa dirigida mitocondrialmente marcada con FLAG en HEK293T y se inmunoprecipitó mediante el mismo procedimiento (Figura complementaria S3B). La transferencia Western del eluato reveló un enriquecimiento específico de proteínas de la mt-LSU (mL37 y uL3m) en el pulldown C6orf203, mientras que las subunidades de proteínas de la mt-SSU no estaban enriquecidas (Figura 5A). Además, encontramos que la interacción observada con las subunidades de mt-LSU era dependiente de ARN, ya que el tratamiento con ARNasa A condujo a una pérdida de interacción de C6orf203 con mL37 y uL3m (Figura complementaria S3C).

C6orf203 interactúa con el mt-LSU. (A) Inmunotransferencia de C6orf203 :: FLAG pulldown. Los lisados ​​mitocondriales de entrada y eluidos de FLAG-IP de HEK293T que expresaban C6orf203 :: FLAG y el control HEK293T sin expresión de la proteína FLAG (WT) se resolvieron mediante SDS-PAGE. Se realizó una transferencia western y las membranas posteriores se sondaron con anticuerpos contra FLAG y para proteínas de cualquiera de los dos. las proteínas mt-LSU (mL37, uL3m) o proteínas mt-SSU (bS16m, uS15m). (B) Análisis de espectrometría de masas de proteínas que interactúan con C6orf203 :: FLAG. Después de la inmunoprecipitación con FLAG, los eluidos se analizaron mediante espectrometría de masas cuantitativa sin marcaje (LFQ) (norte = 3). El gráfico de volcán indica solo las proteínas que se encuentran en la base de datos Mitocarta 2.0. Las proteínas con cambio de pliegue & gt2.5 están marcadas. Recuadro: Diagrama de caja que muestra la comparación del logFC (cambio de pliegue logarítmico) de proteínas (como en el principal B) de la mt-LSU o mt-SSU en comparación con las proteínas globales. Fijado PAG-Los valores indican la importancia por pares de la diferencia en el logFC entre las proteínas globales, las proteínas 39S mt-LSU o las proteínas 28 mt-SSU según se determina mediante las variaciones desiguales de Welch t-prueba. (C) PCR cuantitativa en tiempo real para evaluar el enriquecimiento de mt-RNA en C6orf203 :: FLAG pulldown. La inmunoprecipitación anti-FLAG se realizó en lisado mitocondrial de células HEK293 y células HEK293T que sobreexpresan C6orf203 :: FLAG. Se extrajo ARN tanto de lisados ​​mitocondriales como de fracciones de elución, se sometió a transcripción inversa y se realizó qPCR utilizando pares de cebadores y sondas para transcripciones codificadas de ADN mitocondrial. Se calculó el cambio relativo de la abundancia de la transcripción en los eluidos inmunoprecipitados de C6orf203 :: FLAG frente a los eluidos de HEK293 en relación con la abundancia de la transcripción en sus respectivos lisados ​​mitocondriales de entrada y se muestran aquí. El gráfico representa la combinación de tres barras de error de experimentos biológicos replicados = S.E.M.

C6orf203 interactúa con el mt-LSU. (A) Inmunotransferencia de C6orf203 :: FLAG pulldown. Los lisados ​​mitocondriales de entrada y eluidos de FLAG-IP de HEK293T que expresaban C6orf203 :: FLAG y el control HEK293T sin expresión de la proteína FLAG (WT) se resolvieron mediante SDS-PAGE. Se realizó una transferencia western y las membranas posteriores se sondaron con anticuerpos contra FLAG y para proteínas de cualquiera de los dos. las proteínas mt-LSU (mL37, uL3m) o proteínas mt-SSU (bS16m, uS15m). (B) Análisis de espectrometría de masas de proteínas que interactúan con C6orf203 :: FLAG. Después de la inmunoprecipitación de FLAG, los eluidos se analizaron mediante espectrometría de masas cuantitativa sin marcaje (LFQ) (norte = 3). El gráfico de volcán indica solo las proteínas que se encuentran en la base de datos Mitocarta 2.0. Las proteínas con cambio de pliegue & gt2.5 están marcadas. Recuadro: Diagrama de caja que muestra la comparación del logFC (cambio de pliegue logarítmico) de las proteínas (como en el principal B) de la mt-LSU o mt-SSU en comparación con las proteínas globales. Fijado PAG-Los valores indican la importancia por pares de la diferencia en el logFC entre las proteínas globales, las proteínas 39S mt-LSU o las proteínas 28 mt-SSU según se determina mediante las variaciones desiguales de Welch t-prueba. (C) PCR cuantitativa en tiempo real para evaluar el enriquecimiento de mt-RNA en C6orf203 :: FLAG pulldown. La inmunoprecipitación anti-FLAG se realizó en lisado mitocondrial de células HEK293 y células HEK293T que sobreexpresan C6orf203 :: FLAG. Se extrajo ARN tanto de lisados ​​mitocondriales como de fracciones de elución, se sometió a transcripción inversa y se realizó qPCR utilizando pares de cebadores y sondas para transcripciones codificadas de ADN mitocondrial. Se calculó el cambio relativo de la abundancia de la transcripción en los eluidos inmunoprecipitados de C6orf203 :: FLAG frente a los eluidos de HEK293 en relación con la abundancia de la transcripción en sus respectivos lisados ​​mitocondriales de entrada y se muestran aquí. El gráfico representa la combinación de tres barras de error de experimentos biológicos replicados = S.E.M.

A continuación, realizamos espectrometría de masas cuantitativa sin marca en el eluato de C6orf203 :: FLAG IP en relación con un control negativo (HEK293T sin expresión de la proteína FLAG). Esto reveló el enriquecimiento de un gran número de proteínas de la mt-LSU que co-inmunoprecipitaban con C6orf203 :: FLAG (Figura 5B), mientras que sólo se observó una única subunidad de la mt-SSU (uS15m) con un logFC de & gt2. De hecho, cuando los perfiles de enriquecimiento de las proteínas constituyentes de la mt-LSU y la mt-SSU se consideraron por separado, todas las subunidades de mt-LSU mostraron un enriquecimiento constante sobre la distribución global de proteínas, mientras que las proteínas mt-SSU no se enriquecieron con respecto a las de la global. proteínas (Figura 5B, recuadro). También observamos el enriquecimiento de varias proteínas ribosómicas citosólicas. Sin embargo, esta interacción se redujo con el tratamiento con proteinasa K de las mitocondrias antes de la IP, como se probó mediante transferencia Western (Figura complementaria S3A).

Además de los componentes de mt-LSU, varias otras proteínas estaban altamente enriquecidas en C6orf203 :: FLAG IP, incluidos varios factores que se sabe que están involucrados en el ensamblaje de mt-LSU (es decir, GTPBP10, DHX30, MALSU1, RPUSD4, TRMT10C ) (Figura 5B). Como muchos de estos factores de ensamblaje probablemente se excluirían del ribosoma maduro, esto puede indicar que la interacción observada de C6orf203 ocurre dentro de un ensamblaje intermedio de la mt-LSU.

Curiosamente, una de las proteínas más enriquecidas observadas en el pulldown de C6orf203 :: FLAG fue C12orf65, un miembro de una familia de cuatro factores de liberación de péptidos de clase I mitocondriales. Sin embargo, actualmente se desconoce el papel exacto de C12orf65 en la traducción mitocondrial, y se ha encontrado que el miembro de la familia mtRF1a es suficiente para la terminación de la traducción en los 13 marcos de lectura abiertos mitocondriales (25). La interacción de C12orf65 con C6orf203 requiere más investigación para determinar la relevancia funcional.

Como anteriormente hemos caracterizado a C6orf203 por tener afinidad de unión al ARN, buscamos investigar si C6orf203 interactuaba con los ARN mitocondriales y, por lo tanto, repetimos nuestras inmunoprecipitaciones de C6orf203 :: FLAG y extrajimos ARN tanto de entrada como de eluidos para la línea C6orf203 :: FLAG y WT HEK293 control. A través de RT-PCR cuantitativa centrada en mt-mRNA y mt-rRNA, observamos un enriquecimiento específico de 16S mt-rRNA en C6orf203 :: FLAG IP en comparación con el control (Figura 5C). Esta observación apoya aún más nuestros hallazgos proteómicos sobre la interacción de C6orf203 con el intermedio completo o casi ensamblado de mt-LSU.

La ausencia de C6orf203 conduce a la reducción de los mRNA de mt cargados en los mitoribosomas

A la luz de la interacción observada entre C6orf203 y mt-LSU, así como el enriquecimiento de un complemento de factores de ensamblaje mt-LSU conocidos (Figura 5B), a continuación buscamos evaluar la integridad de los mitoribosomas en nuestras líneas C6orf203 KO. La transferencia de Western no reveló una disminución de los niveles en estado estacionario de una serie de proteínas constituyentes de la mt-LSU o de la mt-SSU (Figura 6A), y el fraccionamiento en gradiente de sacarosa indicó que la integridad general tanto de la mt-SSU como de la mt-LSU era retenido en los clones C6orf203 KO (Figura 6B). Esto sugiere que no existe un defecto global en el ensamblaje de ninguna de las subunidades del mitoribosoma en ausencia de C6orf203 (Figura 6B), por lo que es poco probable que C6orf203 desempeñe un papel en las primeras etapas de ensamblaje de la mt-LSU.Esto es consistente con la observación de un complemento casi completo de proteínas mt-LSU en C6orf203 :: FLAG pulldown (Figura 5B), lo que sugiere en cambio que C6orf203 puede actuar en un intermedio de ensamblaje de etapa posterior de mt-LSU o el mt-LSU completo .

La pérdida de C6orf203 afecta el compromiso de los mRNA de mt con los mitoribosomas. (A) Western blot de niveles en estado estacionario de proteínas ribosomales mitocondriales en células WT, C6orf203 KO y KO 1 que expresan C6orf203 :: FLAG (KO 1 + C6 :: F). El lisado celular total de los clones WT HEK293T, C6orf203 KO y las células KO 1 que expresan C6orf203 :: FLAG (KO 1 + C6F) se resolvió mediante SDS-PAGE Se realizó una transferencia de Western y se sondaron las membranas con anticuerpos contra proteínas de mt-LSU o mt-SSU y VDAC1 se utilizó como control de carga. (B) Sedimentación de ribosomas mitocondriales en gradientes de sacarosa isocinética del 10 al 30% para WT HEK293T y C6orf203 KO 1. Las mitocondrias se aislaron de las células y los lisados ​​se cargaron en gradientes. Tras la centrifugación, las fracciones obtenidas se analizaron mediante western blot con anticuerpos frente a proteínas de la mt-LSU (uL3m y mL37), la mt-SSU (uS15m) y C6orf203. (C) Análisis de perfiles de mitoribosomas. Relación relativa de fragmentos protegidos con mitoribosoma (por millón de lecturas mapeadas, RPM) para C6orf203 KO 1 frente a WT HEK293T para cada ORF de mt-mRNA determinado mediante MitoRiboSeq. Los CDS individuales se muestran de acuerdo con su longitud de ORF. Se contaron las lecturas con mapeo de extremos 5 'entre el primer nucleótido del codón de inicio y 30 nt 5' del codón de terminación para cada biblioteca. Las regiones superpuestas para los ORF en las transcripciones bicistrónicas (ATP8 / ATP6 y ND4l / ND4) se excluyeron del análisis. Los resultados representan datos de un único experimento MitoRiboSeq.

La pérdida de C6orf203 afecta el compromiso de los mRNA de mt con los mitoribosomas. (A) Western blot de niveles en estado estacionario de proteínas ribosomales mitocondriales en células WT, C6orf203 KO y KO 1 que expresan C6orf203 :: FLAG (KO 1 + C6 :: F). El lisado celular total de los clones WT HEK293T, C6orf203 KO y las células KO 1 que expresan C6orf203 :: FLAG (KO 1 + C6F) se resolvió mediante SDS-PAGE Se realizó una transferencia de Western y se probaron las membranas con anticuerpos contra proteínas de mt-LSU o mt-SSU y VDAC1 se utilizó como control de carga. (B) Sedimentación de ribosomas mitocondriales en gradientes de sacarosa isocinética del 10 al 30% para WT HEK293T y C6orf203 KO 1. Las mitocondrias se aislaron de las células y los lisados ​​se cargaron en gradientes. Tras la centrifugación, las fracciones obtenidas se analizaron mediante western blot con anticuerpos frente a proteínas de la mt-LSU (uL3m y mL37), la mt-SSU (uS15m) y C6orf203. (C) Análisis de perfiles de mitoribosomas. Relación relativa de fragmentos protegidos con mitoribosoma (por millón de lecturas mapeadas, RPM) para C6orf203 KO 1 frente a WT HEK293T para cada ORF de ARNm de mt determinado mediante MitoRiboSeq. Los CDS individuales se muestran de acuerdo con su longitud de ORF. Se contaron las lecturas con mapeo de extremos 5 'entre el primer nucleótido del codón de inicio y 30 nt 5' del codón de terminación para cada biblioteca. Las regiones superpuestas para los ORF en las transcripciones bicistrónicas (ATP8 / ATP6 y ND4l / ND4) se excluyeron del análisis. Los resultados representan datos de un único experimento de MitoRiboSeq.

Curiosamente, a pesar del defecto de traducción observado en las células KO C6orf203 (Figura 4A), la formación de monosomas mitocondriales no se ve afectada en ausencia de C6orf203 (Figura 6B). Para investigar esta disparidad entre la formación de monosomas mitocondriales y el fuerte defecto de traducción presente en C6orf203 KO, empleamos perfiles de ribosomas mitocondriales (MitoRiboSeq) en una de las líneas C6orf203 KO (KO 1). A través de esto, observamos que la ocupación de todos los ARNm de mt en los monosomas mitocondriales se redujo en gran medida en relación con WT HEK293T (Figura 6C), aunque ningún ARNm de mt específico se vio afectado en mayor medida que otros (Figura 6C). Los resultados de MitoRiboSeq están de acuerdo con el defecto de traducción mitocondrial observado en C6orf203 KO (Figura 4A).

Un análisis más detallado de MitoRiboSeq reveló que, aunque el compromiso de los ARNm con los mitoribosomas disminuye, una vez que se cargan los ARNm y se inicia la traducción, no hay una alteración importante en la eficiencia de elongación, ya que no se observó una diferencia obvia en la pausa de los mitoribosomas entre las células KO y WT. (Figura complementaria S4A y B), ni caída de mitoribosoma a lo largo de las transcripciones traducidas (lo que podría indicar una pérdida espuria del marco de lectura) (Figura complementaria S4C). Además, no observamos ningún aumento en la ocupación de los mitoribosomas en codones específicos en las líneas de eliminación de C6orf203, lo que sugiere que no hay perturbación de la disponibilidad de ningún mt-tRNA aminoacilado individual (Figura complementaria S5). En conjunto, en ausencia de C6orf203, se forman monosomas mitocondriales, pero su función se ve comprometida, lo que resulta en una traducción mitocondrial reducida.


Los promotores divergentes de codificación / no codificación brindan una oportunidad única para comparar ciclos de transcripción de RNAPII entre pares de lncRNA / mRNA

Perfilar la transcripción naciente ha sido particularmente informativo para demostrar que la mayoría de las regiones empobrecidas en nucleosomas inician la transcripción en ambas direcciones (Wei et al. 2011 Scruggs et al. 2015) (Figura 3). Los análisis de expresión génica de análisis de cap (CAGE) demuestran que los ciclos de transcripción en ambas direcciones comienzan promoviendo la misma modificación de 5 & # x02032-cap en la primera base transcrita (Andersson et al. 2014). Sin embargo, los lncRNA divergentes a menudo se dirigen a la degradación mediada por exosomas (Preker et al. 2008), con ARNm de hebra sentido notablemente más estable. Este es incluso el caso de los pares de ARNm / ARNm divergentes que muestran niveles similares de transcripción incipiente (Sigova et al. 2013). Por tanto, la mayoría de los promotores parecen conducir preferentemente la transcripción en la dirección de codificación. No se comprenden bien los mecanismos mediante los cuales se logra la direccionalidad. Las secuencias de escisión, poliadenilación y terminación de transcripciones canónicas están enriquecidas en algunos ARNnc divergentes (Almada et al. 2013). Curiosamente, mientras estos cis Los elementos de ADN conducen a la formación de ARNm estable en la dirección de codificación, la terminación divergente de lncRNA desencadena la degradación de lncRNA mediada por exosomas (Ntini et al. 2013). Los diferentes efectos de la escisión y la poliadenilación. cis-Los elementos de los ARNm y los ARNc concilian las diferencias en la estabilidad de los pares de transcripciones de dichos promotores. Además, la fuerza de la transcripción en cualquier dirección se regula selectivamente en el nivel de la cromatina, ya que la transcripción divergente de lncRNA puede ser suprimida o activada por una serie de factores de remodelación de la cromatina (Churchman y Weissman 2011 Marquardt et al. 2014 Scruggs et al. 2015). Los factores asociados a RNAPII como PAFI, DSIF y Ssu72 también están implicados en el control de la direccionalidad (Tan-Wong et al. 2012 Fischl et al. 2017 Shetty et al. 2017). Curiosamente, existe evidencia que sugiere que el RNAPII CTD está enriquecido para la fosforilación de Tyr1 durante la transcripción divergente no codificante (Descostes et al. 2014 Hsin et al. 2014), revelando aún más las propiedades únicas de la transcripción de lncRNA. Aunque la transcripción de pares codificantes / no codificantes está estrictamente controlada, nuestra comprensión de cómo RNAPII, los factores asociados a RNAPII y los remodeladores de cromatina discriminan entre orientaciones codificantes y no codificantes es rudimentaria. Además, el propósito de la transcripción no codificante de promotores bidireccionales sigue siendo poco conocido. Teniendo en cuenta que la transcripción no codificante divergente generalizada se detecta en muchos organismos, puede resultar una consecuencia inevitable de la estructura del promotor eucariota. Sin embargo, la identificación de los factores necesarios para la activación específica o la represión de la transcripción divergente de ARNnc ilustra una regulación estricta de este proceso, lo que es indicativo de importancia funcional, aunque esa importancia aún no se ha explicado por completo.

Promotores bidireccionales. Aunque la mayoría de los promotores pueden iniciar la transcripción en cualquier dirección, generalmente se favorece la orientación sentido. Varios factores asociados a RNAPII y cambios de cromatina parecen controlar la direccionalidad. Por ejemplo, PAF1, DSIF y Ssu72 parecen estimular la transcripción de RNAPII en la dirección del sentido (Tan-Wong et al. 2012 Fischl et al. 2017 Shetty et al. 2017). Los remodeladores de cromatina también compiten para regular la transcripción divergente. En particular, CAF-I suprime la transcripción divergente al favorecer la incorporación de nucleosomas con H3K56ac, mientras que el complejo SWI / SNF se opone a esta actividad y, por lo tanto, promueve la transcripción divergente (Marquardt et al. 2014). La transcripción divergente de RNAPII también se puede enriquecer para Tyr1P (Y1P) (Descostes et al. 2014 Hsin et al. 2014). Finalmente, muchos lncRNA divergentes se enriquecen para los sitios de poliadenilación proximales al promotor y se dirigen a la terminación temprana y la degradación mediada por exosomas en el núcleo (Preker et al. 2008 Almada et al. 2013 Ntini et al. 2013). Por el contrario, los ARNm maduros estables se transportan al citoplasma para la síntesis de proteínas. H3, histona H3 lncRNA, sitio poli (A) de ARN largo no codificante (PAS), RNAPII, interruptor de ARN polimerasa II / sacarosa no fermentable (SWI / SNF).


Los lncRNA funcionales muestran propiedades transcripcionales similares al mRNA

Como era de esperar, hay excepciones a los patrones dominantes resaltados anteriormente. Los análisis de transcripción naciente también han descubierto lncRNA que exhiben más propiedades transcripcionales similares al mRNA (Ver Figura 2B). Por ejemplo, dos de estas transcripciones detectadas en células HeLa humanas incluyen las transcripciones altamente abundantes NORAD y TINCR (Schlackow et al. 2017). NORAD se localiza en el citoplasma donde controla la expresión génica al interactuar y regular las proteínas de unión al ARN de Pumilio (Lee et al. 2016), mientras TINCR mantiene la diferenciación de las células somáticas al interactuar y estabilizar los ARNm específicos de la diferenciación (Kretz et al. 2013). Dado que los lncRNA generalmente muestran patrones de expresión específicos de tejido más fuertes que los genes que codifican proteínas (Derrien et al. 2012 Kornienko et al. 2016), los análisis de transcripciones nacientes deben expandirse a otros tipos de células humanas para identificar más lncRNA similares a ARNm, ya que es muy probable que esta subclase tenga funciones específicas y discernibles.


Estrategias de proteómica para identificar objetivos SUMO y sitios aceptores: un estudio de la SUMOilación de proteínas que se unen al ARN

La SUMOilación es una modificación postraduccional de una proteína que participa en la regulación de numerosos procesos biológicos dentro de las células. Las proteínas pequeñas modificadoras de tipo ubiquitina (SUMO) son miembros de la familia de proteínas similares a ubiquitina y, de manera similar a la ubiquitina, están unidas covalentemente a un residuo de lisina en una proteína diana a través de una cascada multienzimática. Para evaluar el mecanismo específico desencadenado por SUMOylation, la identificación de los sustratos de la proteína SUMO y del sitio aceptor preciso al que SUMO está unido es de importancia crítica. A pesar de que se han descrito cientos de proteínas de mamíferos como dianas de SUMOylation, la identificación de los sitios aceptores precisos todavía representa un desafío analítico importante debido a la estequiometría relativamente baja in vivo y la naturaleza altamente dinámica de esta modificación. Además, la identificación basada en espectrometría de masas de sitios SUMOylated se ve obstaculizada por el gran resto de péptidos de proteínas SUMO que quedan en el residuo de lisina modificado tras la digestión tríptica. La presente revisión proporciona un estudio de las estrategias que se han explotado para enriquecer, purificar e identificar sustratos de SUMOilación y sitios aceptores en células humanas en un formato a gran escala. El éxito de las estrategias presentadas ayudó a desentrañar las numerosas actividades de esta modificación, como lo demostró el caso ejemplar de la familia de proteínas de unión a ARN, cuya SUMOilación se revisa aquí.

Esta es una vista previa del contenido de la suscripción, acceda a través de su institución.


Discusión

Tres conclusiones principales de nuestro estudio brindan información sobre cómo se regula el empalme alternativo de plantas y cómo afecta las respuestas al estrés abiótico. En primer lugar, nuestro análisis de empalme, los ensayos de unión de ARN y el análisis filogenético muestran que HIN1 es un tipo inesperado y previamente desconocido de proteína de unión de ARN específica de plantas y regulador de empalme. En segundo lugar, la interacción HIN1-HAI1, así como la desfosforilación HAI1 de HIN1, proporciona un vínculo entre la señalización de estrés y el empalme pre-mRNA. En tercer lugar, el cambio hacia una mayor eficiencia de empalme de intrones propensos a IR durante la aclimatación a una gravedad moderada baja ψw indica un efecto específico, y también inesperado, de la aclimatación a la sequía en la RI que aún no se ha explorado. Los genes estaban bajos ψw y 35S: HIN1 conducidos a una mayor eficiencia de empalme se enriquecieron para el estrés abiótico y las funciones relacionadas con la señalización. Junto con el mantenimiento del crecimiento mejorado de 35S: HIN1 durante baja ψw, estos resultados demostraron que HIN1 y la regulación del empalme de pre-ARNm son importantes para la aclimatación a la sequía.

El efecto de HIN1 sobre el IR y su unión a un motivo que contiene GAA enriquecido en regiones flanqueantes de intrones indicó que HIN1 puede ser funcionalmente similar a las proteínas inhibidoras y potenciadoras de empalme que se han caracterizado mejor en metazoos pero que no se comprenden completamente en ningún organismo. Aunque no podemos descartar otras posibilidades, nuestros datos sugieren que HIN1 actúa como un inhibidor de empalme. La unión de HIN1 a elementos similares a ESE puede actuar para reclutar proteínas relacionadas con el corte y empalme que interactúan con HIN1 y también puede bloquear la unión de ARN de otras proteínas asociadas con el corte y empalme que se asocian con el mismo motivo de ARN o similar (Fig. 6). Se cree que varios tipos de proteínas SR de plantas, incluidas las proteínas RSZ22 SC35, SRP30 y SRP34 colocalizadas con HIN1 y que interactúan con HIN1, se unen a elementos cis que regulan el empalme (18). Se ha demostrado que RSZ22 interactúa con componentes del SNRP U1 y puede reclutarlo en el sitio de empalme 5 '(18, 48). Curiosamente, RSZ22 se une preferentemente a un motivo de ARN diferente al de HIN1 (49), quizás estas proteínas se colocalizan e interactúan cuando se unen a sitios de ARN adyacentes o cuando uno o ambos no están unidos al ARN. La proteína SCL30 relacionada con SC35 (y quizás la propia SC35) se unió a un motivo de ARN que contenía GAA enriquecido en secuencias dentro de 100 bases de intrones regulados por SC35 / SCL30 (43). Además, un motivo similar al motivo que contiene GAA que identificamos se enriqueció en las regiones flanqueantes de intrones de las transcripciones asociadas a SR45, incluidos ABA y genes relacionados con el estrés (20). Las líneas mutantes y de sobreexpresión de SR45 habían alterado la sensibilidad de ABA. Dichos resultados, junto con los resultados presentados aquí, apuntan a una interacción compleja y competencia entre proteínas que se unen a elementos similares a ESE que contienen GAA e indican que dicha interacción / competencia es importante para el estrés abiótico y las respuestas ABA (Fig.6). Tales interacciones pueden explicar por qué la pérdida de la función de HIN1 o la expresión ectópica de HIN1 podrían conducir a una mayor eficiencia de empalme en plantas no estresadas. Es posible que la expresión ectópica de HIN1 secuestra otros factores de corte y empalme o que niveles más altos de expresión de HIN1 conduzcan a una modificación postraduccional diferente (como la fosforilación) que determina la función de HIN1. Tales interacciones y regulación de HIN1 por modificación postraduccional también pueden explicar la localización más prominente de HIN1 en motas nucleares durante el estrés y podrían explicar la observación de que 35S: HIN1 casi no tuvo ningún efecto adicional en el empalme durante baja ψw estrés. No se sabe si la HIN1 localizada con motas está activa o si las motas son sitios donde se secuestra HIN1, como se cree que es el caso de otros factores de empalme.

Posibles mecanismos de la función HAI1-HIN1 en la regulación del empalme. La desfosforilación de HIN1 por HAI1 (y otras PP2C del clado A) puede afectar la interacción de HIN1 con otras proteínas relacionadas con el empalme. La unión de HIN1 a las regiones del exón cerca de las uniones intrón-exón también puede afectar el reclutamiento o la exclusión de otros factores de corte y empalme, incluidos los que se unen a secuencias de elementos cis de ARN similares a las de HIN1. Una hipótesis alternativa, y no mutuamente excluyente, es que HIN1 recluta HAI1 (y quizás otras PP2C del clado A) en sitios específicos para facilitar la desfosforilación de otras proteínas diana, como RSZ22 y otras proteínas relacionadas con el empalme identificadas por análisis fosfoproteómico de hai1-2 (24). Uno o una combinación de estos mecanismos subyacen a la capacidad de HIN1 para afectar el corte y empalme de intrones específicos propensos a IR.

La mayor prevalencia de motas nucleares HIN1 en el hai1-2 fondo y disminución de la RI de los genes afectados por HIN1 en hai1-2 indican que HAI1 afecta la función de HIN1. Sin embargo, es poco probable que esto ocurra a través de los efectos sobre la unión del ARN de HIN1, ya que esto ocurrió en la región N-terminal, mientras que HAI1 interactuó y desfosforiló la parte C-terminal de HIN1. En cambio, la regulación de HAI1 de la fosforilación de HIN1 podría afectar la interacción con otras proteínas relacionadas con el empalme. Otra posibilidad, que no se excluye mutuamente, es que el reclutamiento por parte de HIN1 lleve a HAI1 a la ubicación adecuada para desfosforilar factores de empalme como RSZ22 u otros (Fig. 6). Se sabe que RSZ22 se ve afectado por la fosforilación, ya que los inhibidores de la fosfatasa y la quinasa alteran su movilidad y distribución en las motas nucleares (50 ⇓ -52). De manera más general, se sabe que la fosforilación del factor de empalme se ve afectada por el estrés abiótico (32, 53, 54), y nuestros datos indican que la interacción HAI1-HIN1 es parte de un mecanismo previamente desconocido que conecta la señalización del estrés con los factores de empalme.

De los genes relacionados con HIN1 en Arabidopsis, solo se ha caracterizado LIMYB. Se informó que LIMYB interactúa con la proteína ribosómica L10 y regula a la baja la expresión de los genes de la proteína ribosómica, lo que conduce a una regulación a la baja general de la traducción para defenderse de la replicación viral (33). Interpretaron la función de LIMYB como la de un factor de transcripción y encontraron enriquecimiento de LIMYB en promotores de genes ribosomales en ensayos de inmunoprecipitación de cromatina. Sin embargo, no probaron si LIMYB se unía directamente al ADN o era parte de un complejo de proteínas más grande asociado con genes ribosomales, tal vez incluidas proteínas involucradas en el procesamiento cotranscripcional de ARN ribosómico. Independientemente de si LIMYB es también una proteína de unión de ARN, su función parece divergente de la de HIN1 como limib no afectó el crecimiento, y LIMYB solo interactuó débilmente con HAI1. Además, los 2 sitios de fosforilación observados experimentalmente en el dominio C-terminal de HIN1, que son probablemente objetivos de la desfosforilación de HAI1, no se conservan en LIMYB (Apéndice SI, Fig. S4). También debe tenerse en cuenta que el peso fresco y el peso seco de hin1 mutantes se redujo en casi un cuarto incluso en el control sin estrés. Se desconoce si este crecimiento reducido fue causado únicamente por efectos sobre el empalme.Si bien nuestros datos establecen un papel para HIN1 en la regulación del empalme, no descartamos la posibilidad de que HIN1 tenga funciones adicionales que puedan afectar los fenotipos fisiológicos de hin1 mutantes o 35S: HIN1 plantas.

Hasta donde sabemos, otros estudios de cambios inducidos por estrés en los patrones de empalme no han observado el cambio hacia una mayor eficiencia de empalme de los intrones propensos a IR que observamos. De hecho, se ha informado que el estrés salino a corto plazo o el estrés por calor aumentaron la prevalencia de la RI (9, 55). Una diferencia clave entre nuestro estudio y otros es que expusimos las plantas a una gravedad moderada baja ψw más de 96 h para dar tiempo a la aclimatación al estrés. Genes donde HIN1 y bajo ψw conducidos a una mayor eficiencia de empalme se enriquecieron para el estrés y los términos de GO relacionados con la señalización. Algunos de estos fueron Respuesta temprana a la desecación (ERD) genes incluidos ERD6, 7, 10, 13, y 14 (Conjuntos de datos S9 y S15), así como otros genes que se sabe que son inducidos transcripcionalmente por el estrés o que participan en la señalización del estrés (por ejemplo, MAP Quinasa 3 y muchos genes relacionados con la señalización del calcio). El nivel de transcripción total de estos genes generalmente se mantuvo sin cambios en nuestro nivel bajo a largo plazo ψw tratamiento o por 35S: HIN1. Para genes como los ERD, la implicación es que estos genes fueron regulados transcripcionalmente en la fase aguda temprana de la respuesta al estrés, mientras que la regulación del corte y empalme de estos genes se inicia más tarde, o persiste durante más tiempo, durante la baja ψw aclimatación. En el control no estresado, un alto nivel de IR que conduce a la producción de transcripciones inestables o transcripciones que no codifican una proteína activa puede ser un medio para asegurar que se apague la producción de proteínas asociadas al estrés. Una mayor eficiencia de empalme durante el estrés amplificaría la activación transcripcional o prolongaría la duración del aumento de la producción de proteínas a partir de estos genes durante la aclimatación a la sequía.

Inspección manual de estrés y 35S: HIN1-transcripciones afectadas encontraron que casi todas las transcripciones de IR tenían codones de parada prematuros, de acuerdo con otros estudios de empalme alternativo de plantas (10). Si la transcripción es estable y se transcribe, es probable que la proteína truncada producida no sea funcional. Sin embargo, en algunos casos, se puede producir una proteína de función alterada. Por ejemplo, IR del último intrón de NTL6 / NAC062 (AT3G49530 Fig.4C) produce una transcripción que codifica una proteína truncada que carece del dominio de unión a la membrana. Esta proteína truncada ya no necesitaría ser liberada de la membrana plasmática por escisión inducida por estrés o por ABA para ingresar al núcleo y regular la expresión génica (56, 57). Curiosamente, la retención de intrones que conduce a un truncamiento C-terminal similar de un factor de transcripción NAC ortólogo se ha observado en el maíz (58), lo que sugiere que el empalme alternativo puede ser un mecanismo conservado para regular la función del factor de transcripción NAC. El efecto de HIN1 sobre el crecimiento a bajas ψw puede representar un efecto acumulativo de función alterada o abundancia alterada de señalización y proteínas relacionadas con el estrés, como NAC062, codificada por genes con cambios regulados por HIN1 en IR. Se requiere la caracterización caso por caso para determinar cuál de las transcripciones de IR que observamos conducen a una disminución del nivel de proteína y cuál conduce a la producción de isoformas funcionalmente distintas. Como se indicó anteriormente, no descartamos la posibilidad de que otros aspectos de la función molecular de HIN1 también puedan contribuir a sus fenotipos fisiológicos.

Nuestros datos también muestran que HAI1 puede interactuar con varios factores de empalme. Esto es consistente con el análisis fosfoproteómico de hai1-2 que identificaron supuestos objetivos de desfosforilación de HAI1 relacionados con el empalme y el procesamiento de ARN (23). La caracterización de estas proteínas reguladas por HAI1 adicionales será un enfoque prometedor para revelar más conexiones de la señalización de estrés con el empalme de pre-ARNm. Esto podría incluir la regulación de los eventos de RI y cambios en el sitio de empalme donante-aceptor afectados por el estrés pero no afectados por HIN1. Esto, a su vez, conducirá a una mejor comprensión general de cómo y por qué el estrés abiótico tiene un efecto tan pronunciado en el empalme alternativo, una cuestión que sigue siendo más prominente en la biología del estrés de las plantas.