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Anomalía en el crecimiento de hongos en el caldo de patata dextrosa ... no se ve turbidez en un matraz

Anomalía en el crecimiento de hongos en el caldo de patata dextrosa ... no se ve turbidez en un matraz


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He inoculado seis frascos de 200 ml de caldo de patata dextrosa, uno de los cuales no muestra turbidez y el medio es transparente con un disco de hongos en él.

Todos fueron inoculados al mismo tiempo y del mismo cultivo de hongos puros.

¿Cuál podría ser la razón de esta anomalía?


Son concebibles varias explicaciones. Saber con qué tipo de hongo está trabajando y cómo procedió exactamente a inocular los cultivos podría ayudar a reducir las posibilidades.

Aquí hay algunas posibles explicaciones:

  • Dado que inoculó seis cultivos líquidos del mismo cultivo madre, es posible que el proceso haya sido demasiado largo. Dejame explicar. La mayoría de los hongos son estrictamente aerobios y no toleran bien ni siquiera una pequeña falta de oxígeno. Entonces, como puedo adivinar, mientras inoculaba los caldos de dextrosa uno tras otro, el cultivo de reserva permaneció sin aire en su banco. Dado que pueden tardar unas decenas de minutos en preparar todo y proceder a las inoculaciones, es posible que mientras lo hacías, el estado fisiológico de los hongos simplemente se fue deteriorando, a tal punto que una de las últimas inoculaciones lo hizo. no contienen suficientes células viables para iniciar un crecimiento en el caldo.
  • Es posible que haya olvidado agitar el cultivo madre justo antes de tomar la muestra utilizada para inocular el caldo. Por lo tanto, es posible que toda la biomasa en el cultivo madre se haya sedimentado y usted simplemente inoculó su caldo con el sobrenadante.
  • Además, un error clásico es mezclar algunos de tus caldos. Usted piensa que ha inoculado los seis caldos con el cultivo madre, pero tal vez sin querer esquivó uno, o tal vez inoculó el mismo caldo dos veces.

Anomalía en el crecimiento de hongos en caldo de patata dextrosa ... no se ve turbidez en un matraz - Biología

Este estudio tiene como objetivo describir la caracterización de Paenibacillus polymyxa GBR-1 (GBR-1) con respecto a sus efectos positivos y negativos en las plantas.

Métodos

Las características morfológicas de GBR-1 se identificaron con microscopía y se sometieron a análisis biológico para su identificación. La población bacteriana y la optimización de los medios se determinaron mediante una curva de crecimiento. Se evaluó el potencial de GBR-1 como agente promotor del crecimiento, para tener actividad antagonista y para tener actividad hidrolítica a diferentes temperaturas. Se evaluó la coinoculación de GBR-1 con otros microorganismos y su patogenicidad en varias plantas almacenadas, incluido el ginseng.

Resultados

La morfología de las colonias, las células portadoras de endosporas y la división celular de GBR-1 se identificaron mediante microscopía. La identificación se realizó utilizando el sistema Biolog, cromatografía de gases de ésteres metílicos de ácidos grasos (GC-FAME). GBR-1 mostró la actividad antagonista más fuerte contra patógenos fúngicos y bacterianos. El número de células GBR-1 fue relativamente mayor cuando las células se cultivaron en medio de infusión cerebro-corazón (BHI) en comparación con otros medios. Además, la actividad hidrolítica del almidón fue influenciada por GBR-1 a temperaturas más altas en comparación con temperaturas bajas. GBR-1 fue patógeno para algunas de las plantas de almacenamiento. La coinoculación de GBR-1 con otros patógenos causa diferencias en la pudrición de las raíces de ginseng. Se observó una promoción significativa del crecimiento en plántulas de tabaco tratadas con suspensiones de GBR-1 bajo in vitro condiciones, lo que sugiere que sus compuestos orgánicos volátiles (COV) podrían desempeñar un papel en la promoción del crecimiento.

Conclusión

Los resultados de este estudio indican que GBR-1 tiene efectos tanto positivos como negativos sobre la raíz de ginseng y otras plantas almacenadas como potencial agente de control biológico y provocador in vitro promoción del crecimiento.


In vitro crecimiento y conidiación de microciclos de Idriella bolleyi, un agente de biocontrol de patógenos de cereales

Los requisitos mínimos de nutrientes para el crecimiento de Idriella (= Microdoquio) bolleyi en cultivo líquido agitado se encontraron sales minerales, nitrógeno nitrato, glucosa y tiamina. La cinética típica del cultivo por lotes se mostró en este medio y se evaluó mediante la turbidez del cultivo cuando se utilizó alginato de sodio para inducir el crecimiento mediante micelios dispersos. Los conidios se produjeron durante el crecimiento exponencial y alcanzaron números máximos (California 6 × 10 7 ml −1) por la desaceleración o fase estacionaria temprana. Aplicando la ecuación de Monod a los parámetros de cultivo a diferentes concentraciones de glucosa, el tiempo mínimo de duplicación en medio glucosa-nitrato-tiamina a 25 ° C se calculó entre 5 · 25 y 6 · 1 h, y Ks (concentración de sustrato limitante a la mitad de la tasa máxima de crecimiento específico) estaba entre 0,049 y 0,077% de glucosa.

La germinación de los conidios dependió del oxígeno pero no requirió nutrientes. En agar agua o agar glucosa al 0,1%, la mayoría de las esporas germinaron mediante tubos germinativos, pero hasta un 15% de las esporas se hincharon y produjeron más conidios (2–5) de uno o ambos polos de la espora madre. Esta conidiación de microciclo se suprimió a niveles de glucosa más altos. Los hallazgos se discuten en relación con la producción de inóculos de control biológico y la eficiencia de I. bolleyi en biocontrol de raíces.

Dirección actual: Instituto Fitopatológico Benaki, Ekalis 2, 145 61 Kiphissia, Atenas, Grecia.


Abstracto

El presente estudio prevé la producción biológica de nanopartículas de plata utilizando Fusarium oxysporum y in-silico identificación de la actividad antibacteriana de las nanopartículas mediante estudios de interacción proteína-ligando. La morfología de las nanopartículas fue variable, la mayoría de ellas esféricas en el rango de tamaño de 1 a 50 nm. Para in-silico estudios, dos microorganismos, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa fueron seleccionados y el acoplamiento metálico se llevó a cabo utilizando el software con licencia SYBYL X 1.1.1. El ligando se acopló profundamente en los bolsillos de unión de las proteínas de la membrana externa (OMP) de ambos E. coli y P. aeruginosa. Los resultados mostraron que la plata puede resultar un fuerte agente antibacteriano contra ambos patógenos, siendo mayor la acción antibacteriana de la plata en el caso de P. aeruginosa. Los resultados obtenidos mediante in-silico Los estudios fueron validados por in vitro enfoques en medios sólidos y líquidos para confirmar los resultados obtenidos por in-silico análisis. La corroboración de in-silico y in vitro Los resultados demuestran ampliamente el inmenso potencial antibacteriano de las nanopartículas de plata contra los patógenos seleccionados.


Detección de bacterias productoras de floculantes de alto rendimiento y optimización de las condiciones para la floculación de las aguas residuales de la destilería de trigo

Este estudio tuvo como objetivo analizar las bacterias productoras de floculantes de alto rendimiento para la floculación de la materia en suspensión en las aguas residuales de la destilería de trigo. Después del cribado preliminar y secundario, se cribó una cepa de bacterias productoras de floculantes de alto rendimiento del lodo activado de las aguas residuales de la destilería de trigo. Se utilizaron experimentos ortogonales y de factor único para optimizar el cultivo y las condiciones de floculación de las bacterias productoras de floculante. Una cepa superior de Klebsiella M1 se examinó e identificó mediante rDNA 16S. El grado de floculación inicial fue de hasta 72%. Con base en pruebas de factor único, las condiciones óptimas de floculación fueron un tiempo de reposo de 30 min, una dosis de medio de cultivo al 8% (v / v) y CaCl2 al 3% (v / v). Las condiciones óptimas de cultivo fueron una temperatura de incubación de 30 ° C durante 48 ha pH 4,5 y una velocidad de rotación de 150 rpm. En las condiciones óptimas, el grado de floculación fue de hasta 82%. Los mejores componentes del medio de fermentación fueron 15 g / L de glucosa, 2 g / L de peptona, 1 g / L de KH2PO4 y 2,5 g / L de K2HPO4. También se logró un alto grado de floculación con el medio de bajo costo. La cepa de bacterias Klebsiella M1 se puede utilizar como una buena bacteria producida por biofloculantes para las aguas residuales de las destilerías de trigo.

Articulo completo

Detección de bacterias productoras de floculantes de alto rendimiento y optimización de las condiciones para la floculación de aguas residuales de destilería de trigo

Huan Diao, a, b Lvmu Li, a, c, * Jun Liang, ay Xiaoling Ding c

Este estudio tuvo como objetivo analizar las bacterias productoras de floculantes de alto rendimiento para la floculación de la materia suspendida en las aguas residuales de la destilería de trigo. Después del cribado preliminar y secundario, se cribó una cepa de bacterias productoras de floculantes de alto rendimiento del lodo activado de las aguas residuales de la destilería de trigo. Se utilizaron experimentos ortogonales y de factor único para optimizar el cultivo y las condiciones de floculación de las bacterias productoras de floculante. Una cepa superior de Klebsiella M1 se examinó e identificó mediante rDNA 16S. El grado de floculación inicial fue de hasta 72%. Según las pruebas de un solo factor, las condiciones óptimas de floculación fueron un tiempo de reposo de 30 min, una dosis de medio de cultivo al 8% (v / v) y CaCl al 3% (v / v).2. Las condiciones óptimas de cultivo fueron una temperatura de incubación de 30 ° C durante 48 ha pH 4,5 y una velocidad de rotación de 150 rpm. En las condiciones óptimas, el grado de floculación fue de hasta 82%. Los mejores componentes del medio de fermentación fueron 15 g / L de glucosa, 2 g / L de peptona, 1 g / L de KH2correos4y 2,5 g / L K2HPO4. También se logró un alto grado de floculación con el medio de bajo costo. los Klebsiella La cepa de bacterias M1 se puede utilizar como una buena bacteria producida por biofloculantes para aguas residuales de destilería de trigo.

Palabras clave: Biofloculantes Biorecursos Aguas residuales de destilería de trigo Klebsiella spp. Optimización de cribado

Información de contacto: a: Escuela de Vida y Ciencias, Universidad Agrícola de Anhui, Hefei, Anhui, 230036, China b: Facultad de Farmacia, Universidad Anhui Xinhua, Hefei Anhui, 230088, China c: Escuela de Ciencias y Tecnología Animal, Universidad Agrícola de Anhui , Hefei, Anhui, 230036, China

* Autor para correspondencia: [email protected]

INTRODUCCIÓN

Ltd de la comida de Anhui Ruifuxiang es la empresa más grande de China que produce alcohol del trigo. La producción diaria de aguas residuales es de aproximadamente 3.000 toneladas. La concentración de la demanda química de oxígeno en las aguas residuales es de hasta 50.000 mg / L. El contenido de sólidos en suspensión (SS) es de casi 10,000 mg / L y la concentración total de nitrógeno es de aproximadamente 1,000 mg / L. Los componentes principales de SS son 6% a 7% de sólidos suspendidos totales, aproximadamente 3% de proteína, 1,5% a 2,5% de pentosano y 2% a 3% de levadura, a un pH de 3,2 a 4. Algunas características de las aguas residuales son: alta temperatura, alta acidez, alta concentración, alta viscosidad y pequeña cantidad de partículas en suspensión. Actualmente, esta empresa utiliza principalmente floculantes químicos, como la poliacrilamida (PAM), que se combinan con la flotación por aire y la fermentación anaeróbica para tratar las aguas residuales. La cantidad de PAM utilizada es de aproximadamente 10 ppm a 15 ppm y el costo del tratamiento con floculante es de aproximadamente 0,2 yuanes / tonelada de aguas residuales. El efecto del tratamiento PAM es más eficaz que otros floculantes químicos. Sin embargo, el monómero de acrilamida residual es una neurotoxina, que puede causar neurotoxicidad y los individuos afectados por cáncer pueden mostrar síntomas de debilidad y ataxia (Yokoi et al. 1997 Rudén 2004). Por lo tanto, es necesario desarrollar un floculante verde seguro y eficiente que no produzca la contaminación secundaria. Debido a la inocuidad, la alta eficiencia y la naturaleza ecológica y ecológica de los floculantes microbianos (biofloculantes), han estado atrayendo un gran interés de la comunidad de investigación científica (Liu et al. 2013). Los biofloculantes, que se obtienen por fermentación con bacterias u hongos en condiciones únicas de cultivo, extracción y refinamiento, es un producto metabólico producido por microorganismos o sus secreciones. Un biofloculante consiste en polímeros que poseen actividad floculante que pueden combinarse con contaminantes en las aguas residuales y luego generar sedimentos para ser filtrados (Vijayalakshmi y Raichur 2003). La mayoría de los estudios han demostrado que los componentes principales del biofloculante son polisacáridos y proteínas (Liu et al. 2009). La mayoría de ellos son polisacáridos (Luo et al. 2014). Los biofloculantes se han utilizado para tratar muchos tipos de aguas residuales, como alimentos, impresión y teñido, minerales y leche (Wang et al. 2007 Okaiyeto et al. 2015). Sin embargo, no se ha realizado el estudio de bacterias floculantes microbianas en aguas residuales de destilería de trigo que floculan. Debido a que la capacidad floculante de las bacterias puede mostrar una fuerte especificidad para diferentes tipos de aguas residuales, es necesario considerar varias bacterias productoras de floculantes. (Agunbiade et al. 2017 Li et al. 2017). Se seleccionaron cepas bacterianas productoras de floculantes de alto rendimiento para producir biofloculante a partir de las aguas residuales de la destilería de trigo, que se seleccionó como materia prima, y ​​se optimizaron las condiciones de floculación y cultivo para desarrollar un proceso de purificación verde altamente eficiente para las aguas residuales de la destilería de trigo.

Muchos factores influyen en la producción y actividad floculante de los biofloculantes, como la composición del medio de cultivo, las condiciones de cultivo de bacterias y las condiciones de floculación (Luo et al. 2014). La optimización de las condiciones anteriores es beneficiosa para el efecto floculante del biofloculante. Kurane et al. (1986) informaron que cuando la temperatura de cultivo óptima era de 30 ℃, la cantidad de biofloculantes y el crecimiento celular eran dos veces mayores que a 25 ℃ y 37 ℃. Cuando el valor de pH inicial era 9.5, la tasa de crecimiento celular era mayor que a un pH de 7. Zhao y Liu (2008) mostraron que en condiciones óptimas de cultivo (pH = 12, temperatura de cultivo = 30 ℃, velocidad de rotación = 150 rpm, y tiempo de incubación = 74 h), la cantidad de biofloculante fue la más alta, hasta 95,0%, que fue superior a la del grupo control). Yang et al. (2009) mostró que la cantidad de biofloculante agregado, pH, coagulante coagulante (CaCl2) y la velocidad de mezcla tienen una influencia sustancial en el grado de floculación. El carbono, el nitrógeno y las sales inorgánicas son factores clave para determinar el costo del medio de cultivo. Obtener las fuentes óptimas de carbono y nitrógeno y la mejor proporción de fosfato en un cultivo de bacterias floculantes afecta el crecimiento celular, la producción de biofloculante y conduce a un menor costo del medio de cultivo (Chen et al. 2013 Murthy y Praveen 2013 Zhao et al. 2013b).

Este estudio optimizó las condiciones de cultivo convencionales, fuente de carbono, fuente de nitrógeno y proporción de fosfato. La fuente de carbono óptima se determinó utilizando glucosa, sacarosa, lactosa, maltosa y almidón. La fuente de nitrógeno óptima se determinó usando combinaciones de nitrógeno simples o múltiples de extracto de carne, nitrato de sodio, urea, sulfato de amonio y peptona. La dosis óptima de fosfato inorgánico se obtuvo determinando la mejor proporción de dihidrogenofosfato de potasio (KH2correos4) e hidrogenofosfato de potasio (K2HPO4).

EXPERMENTAL

Fuente de aislamiento de la cepa y medios de cultivo

Anhui Ruifuxiang Food Co. Ltd (ciudad de HeFei, provincia de Anhui, China) proporcionó el residuo de la destilería de alcohol y el lodo activado, que se utilizaron para los materiales de cribado.

El medio de fermentación estaba compuesto por 20 g de glucosa (Aladdin Industrial Corporation, Shanghai, China), 0.5 g de extracto de levadura (Beijing AOBOX Biotechnology Corporation, Beijing, China), 5.0 g de K2HPO4 (Xilong Scientific Corporation, Guangdong, China), 2,0 g de KH2correos4 (Xilong Scientific Corporation, Guangdong, China), 0,2 g de MgSO4 (Aladdin Industrial Corporation, Shanghai, China), 0,1 g de NaCl (Hangzhou Microbial Reagent Co., LTD, Hangzhou, China), 0,1 g de sulfato de amonio (Aladdin Industrial Corporation, Shanghai, China) y 0,5 g de urea (Xilong Scientific Corporation, Guangdong, China).

El medio de cultivo bacteriano (medio de cultivo de bacterias del ácido láctico: MRS) contenía 10,0 g de peptona (Aladdin Industrial Corporation, Shanghai, China), 10,0 g de extracto de carne (Hangzhou Microbial Reagent Co., LTD, Hangzhou, China), 5,0 g de extracto de levadura (Beijing AOBOX Biotechnology Corporation, Beijing, China), 2,0 g de hidrógeno diamónico de ácido cítrico (Xilong Scientific Corporation, Guangdong, China), 20,0 g de glucosa (Aladdin Industrial Corporation, Shanghai, China), 1,0 ml de Tween 80 ( Tianjin Zhiyuan Chemical Reagents Co., Ltd., monooleato de polioxietileno (20) sorbitán), 5,0 g de acetato de sodio (Xilong Scientific Corporation, Guangdong, China), 2,0 g de K2HPO4· 3H2O (Xilong Scientific Corporation, Guangdong, China), 0,58 g de MgSO4· 7H2O (Xilong Scientific Corporation, Guangdong, China), 0,25 g de MnSO4· H2O (Xilong Scientific Corporation, Guangdong, China) y 18,0 g de agar (Hangzhou Microbial Reagent Co., LTD, Hangzhou, China). El pH osciló entre 6,2 y 6,6.

El medio de cultivo bacteriano (Nutrient Broth: NB) contenía 5 g de extracto de carne (Hangzhou Microbial Reagent Co., LTD, Hangzhou, China), 5 g de cloruro de sodio (Xilong Scientific Corporation, Guangdong, China) y 10 g de peptona. (Aladdin Industrial Corporation, Shanghai, China) y tenía un pH neutro.

El medio de cultivo de hongos (Potato Dextrose Agar Medium: PDA) estaba compuesto por 200 g de papa (Supermarket, Hefei, China), 20 g de glucosa (Aladdin Industrial Corporation, Shanghai, China) y aproximadamente de 15 ga 20 g de agar. (Hangzhou Microbial Reagent Co., LTD, Hangzhou, China) y tenía un pH neutro.

Detección de bacterias productoras de floculantes

El cribado preliminar: se tomaron muestras de 1 g de lodo activado y 1 g de residuo de destilería de alcohol de la empresa de producción de alcohol de trigo y luego se agregaron a agua destilada aséptica con varias perlas de vidrio esterilizadas para dispersar las microcélulas bacterianas en células individuales. Se añadió 1 mL de suspensión unicelular al medio de cultivo de enriquecimiento de 99 mL del líquido MRS, NB y PDA y se incubó a 30 ºC y 37 ºC, respectivamente, rotado a 150 rpm durante 48 h. Los medios líquidos se diluyeron con agua destilada. Las placas de Petri con medio de agar de separación de hongos y bacterias se recubrieron con 0,1 mL de líquido diluido. Los medios de separación se cultivaron durante 48 h y se observaron las características de la colonia. Se seleccionaron y purificaron colonias lisas, grandes y pegajosas mediante la técnica de placa de rayas (Guo 2013). Las cepas cribadas se almacenaron en un frigorífico a 4 ° C.

El cribado secundario: las cepas obtenidas del cribado primario se inocularon en 100 mL de medio de fermentación estándar y se cultivaron a la temperatura de cribado correspondiente y velocidad de rotación de 150 rpm durante 24 h. El rendimiento floculante se midió probando el grado de floculación de las aguas residuales de la destilería de trigo (Yang et al. 2015), y luego se seleccionaron las cepas productoras de floculantes microbianos de alta eficiencia.

Identificación de especies por biología molecular

Las cepas bacterianas seleccionadas se secuenciaron mediante rDNA 16S. El trabajo de secuenciación y síntesis de cebadores fue completado por Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). De acuerdo con los resultados secuenciados del rDNA 16S, la secuencia de nucleótidos se alineó por BLAST con la base de datos NCBI, y se identificó la especie seleccionada. La secuencia del gen 16S rDNA de algunas de las cepas se extrajo de Genbank y el árbol filogenético de la cepa se extrajo utilizando el método NJ en el software MEGA 4 (Center of Evolutionary Functional Genomics Biodesign Institute, Arizona State University, Tempe, AZ, EE. UU.) .

Se llenaron de cinco a seis ramas con 6 ml de medio fresco para formar un cultivo en pendiente, y se recubrieron tantas cepas como fue posible en toda la pendiente para las cepas de cosecha. Las bacterias empaquetadas se enviaron por correo al Centro de Recolección de Cultivos Tipo de China (Wuhan, China) para su conservación.

Determinación de la curva de crecimiento de la cepa.

La cepa purificada se inoculó en 150 mL de medio de cultivo y el valor de absorbancia a 600 nm (OD600) fue medido. El pH, la biomasa y la DO del caldo de cultivo600 Los valores se determinaron a la temperatura de cribado de 37 ° C y a una velocidad de rotación constante de 150 rpm. Las muestras se recolectaron cada 6 h. Se utilizó un medio no inoculado como grupo de control. La curva de crecimiento se trazó con el tiempo de cultivo como la abscisa y la DO.600 valor como la ordenada (Xing et al. 2010).

Determinación del grado de floculación.

La actividad floculante se determinó midiendo el grado de floculación de las aguas residuales de la destilería de trigo. El método para determinar el grado de floculación: se agregaron 5 mL de caldo de cultivo a matraces triangulares con 100 mL de agua residual de destilería de trigo para mezclar a temperatura ambiente. El matraz triangular se hizo oscilar rápidamente durante 3 min (120 rpm), se hizo oscilar lentamente durante 2 min (50 rpm) y luego se dejó en reposo durante 10 min. Finalmente, se recogió el sobrenadante para medir el valor de absorbancia (DO780). Se utilizó agua destilada como grupo de control en lugar del caldo de cultivo. El grado de floculación de las aguas residuales se calculó con la siguiente ecuación (Li et al. 2017),

Figura 2. Curvas de crecimiento y pH de la cepa M1

Optimización de factor único de las condiciones de floculación

Los resultados de la prueba de factor único mostraron que había un mayor grado de floculación con tiempos de reposo más prolongados. Sin embargo, el grado de floculación no se modificó notablemente para un tiempo de reposo inferior a 30 min. Según la eficacia de la prueba, se determinó que el tiempo de reposo óptimo era de 30 min. Los resultados se muestran en la Fig. 3. Los resultados de la prueba del tiempo de reposo mostraron que el grado de floculación aumentó con la extensión del tiempo de reposo, debido a que el tiempo de reposo prolongado brinda múltiples oportunidades para que las partículas en la suspensión de aguas residuales se agreguen y aumente el grado de floculación ( Al-Shamrani et al. 2002).

Figura 6. Distribución de los principios activos floculantes en la cepa M1. Los valores representan las medias y las desviaciones estándar, norte= 3 Los valores en una columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (p & lt0.01).

Optimización de las condiciones de cultivo

Optimización de un solo factor de las condiciones de cultivo

Con un aumento en el tiempo de cultivo, el grado de floculación de las bacterias M1 aumentó gradualmente.

Figura 7. Efecto del tiempo de cultivo sobre el grado de floculación. Los valores representan las medias y las desviaciones estándar, norte=3.

Cuando el tiempo de incubación alcanzó las 48 h, el grado de floculación de la solución de cultivo con las aguas residuales de la destilería de trigo fue de hasta 74,6%. Este resultado se muestra en la Fig. 7. Los resultados indicaron que el biofloculante era un producto de la biosíntesis de M1, no de la autólisis celular (Lu et al. 2005). Una vez que la actividad floculante alcanzó el máximo, la actividad floculante presentó una tendencia a la baja. Esto puede estar asociado con la descomposición del floculante en el caldo de fermentación o la falta de nutrientes necesarios para los microorganismos posteriores (Li et al. 2007).

Puede verse en la Fig. 8 que el grado de floculación aumentó en el primer paso de aumento de temperatura (25 ° C a 30 ° C), y luego tendió a disminuir a medida que la temperatura aumentaba más. El grado de floculación de las aguas residuales de la destilería de trigo fue relativamente alto, cercano al 75,5%, a 30 ° C. El grado de floculación disminuyó cuando la temperatura del cultivo fue superior a 37 ° C. La temperatura del cultivo no solo afecta el crecimiento y el metabolismo microbianos, sino que también afecta la actividad enzimática en las células microbianas (Zhang et al. 2002). La alta temperatura conduce a la disminución o incluso a la pérdida de la actividad de la enzima en la cepa, lo que afecta el crecimiento y metabolismo de las cepas y provoca un bajo grado de floculación del líquido de fermentación de la cepa M1. La baja temperatura provoca una ralentización del crecimiento de una cepa y una actividad reducida de una enzima. en vivo, e incluso da como resultado una reducción de los floculantes y otros metabolitos. De este modo se prolonga el tiempo de síntesis y acumulación del material de floculación.

Figura 8. Efecto de la temperatura de cultivo sobre el grado de floculación. Los valores representan las medias y las desviaciones estándar, norte=3.

Resultados de optimización del experimento ortogonal de las condiciones de cultivo.

Según el rango de valores que se muestra en la Tabla 5, el orden de los factores con mayor influencia en el grado de floculación fue el siguiente: A & gt D & gt B & gt C. Las condiciones óptimas de cultivo fueron A2, B2, C1y D2, es decir., tiempo de cultivo 48 h, temperatura de cultivo 30 ° C, pH de fermentación 5 y velocidad de rotación 150 rpm. De acuerdo con estas condiciones, el grado de floculación fue de hasta 82,0% y el resultado de la prueba de verificación ortogonal más alta fue de aproximadamente 81,8%. Los resultados del experimento ortogonal mostraron que la influencia de la temperatura de cultivo sobre el grado de floculación fue mayor.

Resultados de la optimización media

Experimento de optimización de un solo factor

La fuente de carbono juega un papel importante en el crecimiento celular y la síntesis de metabolitos. Las diferentes fuentes de carbono tienen diferentes influencias en el grado de floculación de las bacterias. La Figura 11 muestra que las influencias de la lactosa, maltosa y almidón como fuentes de carbono en la producción de la bacteria M1 tuvieron el mismo grado, mientras que la sacarosa y la glucosa tuvieron efectos más significativos que las otras fuentes de carbono. El grado de floculación del grupo de glucosa fue el más alto seguido por el grupo de sacarosa. La fuente de carbono es la fuente de nutrientes más importante para los microorganismos y un elemento importante para la formación del citoesqueleto. La fuente de carbono es un componente importante del medio. Las fuentes de carbono baratas pueden reducir los costos de manera efectiva. Bajo el mismo efecto, la fuente de carbono de menor costo es la mejor. En este experimento, la glucosa y la sacarosa tenían un precio similar, y se eligió la glucosa para experimentos posteriores porque mantenía un grado de biofloculación ligeramente más alto. Por lo tanto, se consideró que la glucosa era la mejor fuente de carbono para la cepa M1.

Cuadro 7. Tabla de análisis de varianza de las pruebas ortogonales de la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno y la relación de fosfato en el medio de cultivo M1

CONCLUSIONES

  1. Una bacteria productora de floculantes altamente efectiva, Klebsiella M1, se tamizó a partir de lodos activados y podría usarse como una bacteria productora de biofloculantes de alto rendimiento para las aguas residuales de las destilerías de trigo. El grado de floculación inicial fue de hasta 72,1%. La cepa se conservó en el Centro de China para la recogida de cultivos típicos, y el número fue CCTCCM 2018098. El gen de rDNA 16S se había registrado en GenBank y su número de inicio de sesión era MG987011.
  2. Según el experimento de factor único, las condiciones óptimas de floculación fueron un tiempo de reposo de 30 min, una dosis de medio de cultivo al 8% y CaCl al 3%.2.
  3. Las condiciones óptimas de cultivo para las bacterias M1 fueron tiempo de cultivo 48 h, temperatura de cultivo 30 ° C, pH inicial 4.5 y velocidad de rotación 150 rpm. Después de la prueba de verificación, el grado de floculación alcanzó el 82,0%. Los resultados de la optimización ortogonal indicaron que el medio de cultivo óptimo de las bacterias M1 contenía glucosa como fuente de carbono (15 g / L), peptona como única fuente de nitrógeno (2 g / L) y una proporción de dosificación de fosfato de 1 g / L. KH2correos4 hasta 2,5 g / L K2HPO4. Se logró un alto grado de floculación con un medio de bajo costo.
  4. Estos experimentos demostraron que la cepa M1 podría usarse como una buena cepa producida con biofloculante para aguas residuales de destilería de trigo. Se desarrolló un nuevo método para purificar las aguas residuales de la destilería de trigo con biofloculantes.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Este estudio fue apoyado por una subvención del Programa de Investigación y Desarrollo de Anhui (1704a07020064).

REFERENCIAS CITADAS

Agunbiade, M. O., Van Heerden, E., Pohl, C. H. y Ashafa, A. T. (2017). “Rendimiento floculante de un biofloculante producido por Arthrobacter humicola en el tratamiento de aguas residuales " BMC Biotechnol. 17, 51. DOI: 10.1186 / s12896-017-0375-0

Al-Shamrani, A.A., James, A. y Xiao, H. (2002). “Desestabilización de emulsiones aceite-agua y separación por flotación por aire disuelto”, Agua Res. 36, 1503-1512. DOI: 10.1016 / S0043-1354 (01) 00347

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Artículo enviado: 7 de mayo de 2018 Revisión por pares completada: 17 de julio de 2018 Versión revisada recibida: 15 de agosto de 2018 Aceptado: 16 de agosto de 2018 Publicado: 27 de agosto de 2018.


Anomalía en el crecimiento de hongos en caldo de patata dextrosa ... no se ve turbidez en un matraz - Biología

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA MICROORGANISMOS

Preparación y almacenamiento de medios de cultivo

Precauciones: medios deshidratados
Luz
Humedad
Temperatura y tiempo

Preparación de medios deshidratados
Reconstitución de medios deshidratados
Esterilización de medios de cultivo.
Controles de esterilización
Efectos de sobrecalentamiento
Tabla de fallas y posibles causas en la esterilización de medios

Preparación de medios esterilizados

Almacenamiento de medios preparados

Precauciones en el uso y eliminación de medios preparados

Precauciones: medios deshidratados

Pruebas de control de calidad de laboratorio de usuario en medios preparados

Los medios de cultivo deben almacenarse a la temperatura especificada, en condiciones especificadas y no más que los períodos de vida útil apropiados para cada producto. Las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad de cada producto se muestran en las etiquetas o prospectos del producto, pero las siguientes reglas generales ayudarán a garantizar que se mantengan en un entorno óptimo. Al almacenar productos, anote las fechas de caducidad de la vida útil en las etiquetas y utilice los productos en orden de lote / número de lote.

Todos los medios de cultivo preparados y sus componentes deben almacenarse lejos de la luz y debe evitarse en todo momento la exposición a la luz solar directa.

Los recipientes de vidrio y plástico sellados no se ven afectados por la humedad normal del laboratorio. Los contenedores abiertos de polvos deshidratados se verán afectados por la alta humedad. Las salas de preparación de medios calientes y humeantes no son entornos adecuados para almacenar recipientes de medios de cultivo, en particular recipientes que se abren y cierran con frecuencia. Un cuarto frío adyacente o un armario de almacenamiento adecuado son áreas de almacenamiento preferibles.

Las condiciones de temperatura de almacenamiento de los medios de cultivo y sus componentes varían ampliamente. Las siguientes agrupaciones de productos ayudarán a diferenciar los distintos requisitos.

Medios de cultivo: Los recipientes sellados y sin abrir deben almacenarse a temperatura ambiente entre 15 y 20 ° C. Los recipientes abiertos deben tener la tapa o la tapa reemplazados con cuidado y de forma segura. Es importante que los envases abiertos se almacenen en una atmósfera seca a temperatura ambiente. Periodo de validez de 1 a 5 años.

Medio de caldo preparado: Almacenar a 2-8 ° C. No permita que los productos se congelen. Periodo de validez de 6 meses a 2 años.

Placas preparadas de medios de cultivo: las placas vertidas de medios de agar son especialmente vulnerables a la infección, la deshidratación y la degradación química. La preparación y el almacenamiento asépticos son esenciales para proteger las placas de la infección microbiana. Las pérdidas de agua durante el almacenamiento se pueden minimizar mediante envoltorios impermeables y / o almacenamiento a 2-8 ° C. Degradación química, p. Ej. oxidación o pérdida antimicrobiana, puede retardarse mediante la protección contra la luz, el calor y la deshidratación.

Sin embargo, es importante controlar el almacenamiento de las placas preparadas mediante pruebas de control de calidad para que se pueda detectar cualquier deterioro y determinar con precisión el período de almacenamiento. Las pruebas de pesaje simples de placas frescas y almacenadas determinarán la tasa de pérdida de humedad. La pérdida de peso superior al 5% indicará una pérdida significativa de agua.

Kits de generación de gas: Almacenar a 2-8 ° C en un lugar seco. No almacene estos kits a temperaturas más altas durante períodos prolongados. Periodo de validez 3 años.

Reactivos estériles: Almacenar a 2-8 ° C, excepto que el suero de caballo se almacena entre -20 a + 8 ° C.

Discos de susceptibilidad: Almacenar a -20 ° C pero mantener el stock de trabajo a 2-8 ° C. Periodo de validez de 1 a 2 años.

Preparación de medios deshidratados

Los medios deshidratados son higroscópicos y sensibles a la humedad, el calor y la luz. Se ven afectados negativamente por cambios drásticos de temperatura, p. Ej. temperaturas cíclicas de frío / calor que pueden ocurrir entre las temperaturas de laboratorio diurnas y nocturnas en invierno.

Las condiciones de almacenamiento generalmente se indican en la etiqueta del producto y deben seguirse.

1 & # 9 Escriba en la etiqueta la fecha de recepción en el laboratorio.

2 & # 9 Almacene como se indica en la etiqueta generalmente por debajo de 25 ° C en un área seca, lejos de la luz solar directa, autoclaves, hornos de secado u otras fuentes de calor.

3 & # 9 Compruebe la fecha de caducidad en la etiqueta, algunos medios tienen una vida útil significativamente más corta que otros.

4 & # 9 Utilice stock en orden de lote / número de lote. No abra una botella nueva hasta que se haya vaciado la botella anterior. Anote en la etiqueta la fecha en que se abrió el envase por primera vez. Después de su uso, asegúrese de que el recipiente esté bien cerrado y devuélvalo al área de almacenamiento designada.

5 & ​​# 9 Solicite el medio en un recipiente de tamaño adecuado y en una cantidad que se ajuste a los requisitos de uso normal. Un medio en un recipiente grande que se ha abierto muchas veces se deteriorará durante el almacenamiento. Deseche el medio si el polvo no fluye libremente, si el color ha cambiado o si parece anormal de alguna manera.

Reconstitución de medios deshidratados

Las instrucciones completas para la preparación de los medios de cultivo se encuentran en la etiqueta de cada frasco. Como regla general, es aconsejable preparar solo el requisito de una semana.

1 & # 9 Utilice siempre agua destilada o desionizada recién preparada. Use agua tibia (50 ° C) para acelerar la solución del medio. Enjuague todo el material de vidrio con agua destilada / desionizada y asegúrese de que los recipientes estén limpios y libres de productos químicos tóxicos que puedan absorberse en la superficie del vidrio, p. sales biliares, telurito, selenito, etc.

2 & # 9 Prepare el medio en un recipiente aproximadamente el doble del volumen final del medio para permitir una mezcla adecuada. Siga las instrucciones dadas en la etiqueta de cada producto.

3 & # 9 Abra el recipiente del medio de cultivo lejos de corrientes de aire y humedad. Evite inhalar el polvo y el contacto prolongado con la piel. Pese el polvo de forma rápida, precisa y sin crear "nubes de polvo". Vuelva a cerrar el recipiente lo antes posible. Vierta la mitad del volumen requerido de agua destilada en el recipiente, luego la cantidad pesada de medio y agite enérgicamente durante unos minutos. Vierta el resto del agua destilada por los lados del recipiente para lavar cualquier medio adherente de nuevo en la solución. Este es un paso importante porque los medios de cultivo secos en polvo por encima del nivel del agua pueden no esterilizarse en el autoclave y pueden ser una fuente de contaminación.

Los medios sin agar generalmente se disuelven con una agitación suave. Los medios que contienen agar deben calentarse para disolver el agar antes de esterilizarlos en autoclave. Lleve el medio a ebullición sin quemar ni quemar. La mayoría de los medios de cultivo requerirán una esterilización final en un autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.

El fabricante ha ajustado el pH del medio deshidratado para que el pH final del medio preparado cumpla con la especificación de la etiqueta cuando el medio se haya enfriado a 25 ° C. No ajuste el pH de los medios deshidratados antes de la esterilización.

Esterilización de medios de cultivo.

Aunque la esterilización de los medios de cultivo se lleva a cabo mejor en un autoclave de vapor a temperaturas entre 121-134 ° C, debe reconocerse que el proceso de calentamiento provoca daños en el medio.

El tratamiento térmico de medios de cultivo complejos que contienen péptidos, azúcares, minerales y metales da como resultado la destrucción de nutrientes, ya sea por degradación térmica directa o por reacción entre los componentes del medio.

También se pueden formar productos tóxicos causados ​​por la quimiooxidación durante el tratamiento térmico. Por lo tanto, es importante optimizar el proceso de calentamiento de modo que un medio sea estéril después del calentamiento pero que se cause un daño mínimo a los ingredientes del medio. Como regla general, se acepta que los procesos de corta duración y alta temperatura son más letales para los organismos y menos dañinos químicamente que los procesos más largos y de baja temperatura, p. Es preferible 3 minutos a 134 ° C a 20 minutos a 115 ° C.

En cada etiqueta se proporcionan instrucciones generales para esterilizar los medios de cultivo en volúmenes de hasta un litro a 121 ° C durante 20 minutos. Sin embargo, los autoclaves varían en rendimiento y se deben realizar pruebas de termopar utilizando diferentes volúmenes de medio para determinar los tiempos de "calentamiento y enfriamiento". Será fundamental hacer esto cuando se preparen volúmenes de medios superiores a dos litros. Para evitar el sobrecalentamiento de unidades de medio de gran volumen, los períodos de 'calentamiento' y 'enfriamiento' se integran normalmente en el tiempo de mantenimiento de 121 ° C.

El ciclo de esterilización se puede dividir en sus cuatro etapas:

Etapa 1 20 -121 C Tiempo de calentamiento de la cámara

El tiempo de calentamiento de la cámara depende de la eficiencia del autoclave (descarga de aire / entrada de vapor) y del tamaño de la carga en la cámara. El tiempo requerido para esta etapa se mide con una sonda registradora ubicada en la válvula de descarga de aire ubicada en la base de la cámara.

Etapa 2 & lt100 -121 C Tiempo de penetración de calor del recipiente medio

El tiempo de penetración del calor depende principalmente del volumen de los contenedores individuales, aunque la forma y las propiedades de transferencia de calor de los contenedores pueden afectar esta etapa. El tiempo necesario para que el volumen medio alcance los 121 ° C se mide con termopares colocados en el centro del recipiente más interno.

Volumen (ml) en botellas de vidrio y # 9 Tiempo (min)

Estos tiempos suponen que los medios de agar se han disuelto antes de esterilizarlos en autoclave. También se supone que es posible una exposición máxima al vapor. Por lo tanto, aunque la botella única de 100 ml requirió 12 minutos para alcanzar los 121 ° C, cuando se colocó en una caja con otras botellas requirió 19 minutos y cuando se colocó en el centro de las cajas apiladas requirió 30 minutos.

Etapa 3 121 -121 C Tiempo de mantenimiento a la temperatura prescrita

El tiempo de retención a 121 ° C depende de (i) el número de organismos originalmente presentes en el medio (ii) el número fraccional de un organismo que se presume presente después del calentamiento, p. Ej. N = 0,001 equivalente a que una botella de cada 1000 botellas calentadas se contaminen (iii) la constante de tasa de muerte térmica del presunto organismo presente a 121 ° C.

Los tiempos de espera recomendados son:

Temperatura (° C) & # 9121 & # 9126 & # 9134

Etapa 4 121 ° C - 80 ° C Tiempo de enfriamiento para que la cámara alcance los 80 ° C

El tiempo de enfriamiento depende del tamaño de la carga en la cámara y la tasa de pérdida de calor del autoclave. Los aerosoles de agua se utilizan para acelerar el enfriamiento en los esterilizadores comerciales, pero se requiere un control muy cuidadoso para evitar la fractura de la botella y la entrada del aerosol de enfriamiento en el medio esterilizado. El último problema se produce cuando el vacío formado en el espacio superior durante el enfriamiento succiona fluido refrigerante contaminado por la rosca del tapón y hacia el interior de la botella.

Los autoclaves de medios de cultivo no deben estar etiquetados y deben tener una capacidad de cámara moderada. Los cierres térmicos de las puertas deben evitar que se abran cuando la temperatura de la cámara sea superior a 8 ° C, pero incluso en estas circunstancias se debe tener cuidado para evitar un choque térmico repentino al retirar las botellas de vidrio de líquido caliente del autoclave. Cuando se colocan recipientes con tapón de rosca en un autoclave, los tapones deben tener media vuelta libre para permitir el escape del aire caliente. Cuando se retiren del autoclave, los contenedores deben dejarse enfriar en un gabinete de flujo de aire laminar. Alternativamente, los recipientes con tapón de rosca se pueden esterilizar en un frasco que está cubierto por un trozo de fieltro que protege eficazmente los recipientes de la infección por microorganismos transportados por el aire. Los tapones se enroscan firmemente después de que el contenido se haya enfriado a temperatura ambiente.

Todos los autoclaves deben revisarse en períodos de tiempo fijos para asegurarse de que funcionan de manera eficiente. Se deben realizar mediciones físicas en las lecturas de temperatura y presión, se debe verificar la calidad del vapor, se debe determinar la eficiencia de las trampas de aire 'cercanas al vapor' en la base del autoclave y se deben verificar las válvulas de seguridad. Las inspecciones obligatorias de los autoclaves como recipientes a presión normalmente se llevan a cabo anualmente por especialistas bajo las instrucciones de las aseguradoras de dichos aparatos. Con autoclaves de laboratorio pequeños, esta inspección no es obligatoria.

Los indicadores químicos mostrarán la temperatura alcanzada o excedida y algunos indicarán el tiempo mantenido a la temperatura especificada. La esterilización en autoclave suele ser evidente porque la falta de destrucción de todas las esporas bacterianas presentes de forma natural en los medios deshidratados (la "carga biológica") permitirá que se produzca el crecimiento en el medio almacenado o incubado. Siempre se debe sospechar el fracaso de la esterilización cuando se produce la contaminación de los medios preparados con organismos que se esparcen. Los indicadores biológicos de esterilización demostrarán la capacidad del autoclave para destruir las esporas bacterianas.

El sobrecalentamiento es una causa común de variación del pH, oscurecimiento, precipitación, poca fuerza del gel y rendimiento bacteriológico reducido. Estos efectos también se pueden producir si se calienta un 'grupo' concentrado de ingredientes en el fondo del recipiente. Todos los medios de cultivo deben estar en solución antes de la esterilización. Esto reducirá la aparición de reacciones de tipo Maillard (pardeamiento no enzimático) que tienen lugar en el medio.

Se producirán efectos de sobrecalentamiento si se permite que los medios de agar gelifiquen en botellas y luego se cuecen al vapor para derretir el agar. También ocurrirán si los medios fundidos se mantienen a 50 ° C durante más de 3 horas antes de su uso. Los medios de agar con valores de pH iguales o inferiores a 5,0 son muy sensibles al sobrecalentamiento en cualquier forma porque el agar se hidroliza y la resistencia del gel falla. Se recomienda esterilizar el agar de los medios de un pH inferior a 5,0 por separado.

La mayoría de las dificultades en la esterilización de medios de cultivo ocurren cuando se deben procesar grandes volúmenes unitarios de medio (& gt2 litros). La mejor solución a este problema es el uso de un preparador de medio de cultivo. Estos procesadores semiautomáticos, fabricados por New Brunswick y otros fabricantes, superan el problema de la mala penetración del calor en el agar mediante una agitación o agitación continua del medio durante la fase de calentamiento. Dichos preparadores reducirán significativamente el tiempo requerido para la esterilización a 121 ° C o en algunos modelos a 134 ° C. Se recomiendan encarecidamente debido a su alta eficacia y al mínimo daño a los medios de cultivo.

Tabla de fallas y posibles causas en la esterilización de medios

Prueba de pH realizada por encima de 25 ° C. Sobrecalentamiento por esterilización prolongada, refundición o un período demasiado largo a 50 ° C. Solución incompleta de medio. Agua o recipientes de mala calidad. Medio deshidratado almacenado incorrectamente o más allá de la vida útil indicada.

Agua o recipientes de mala calidad. Sobrecalentamiento o almacenamiento prolongado a 50 ° C. Valor de pH incorrecto. Solución incompleta.

Sobrecalentamiento, solución incompleta o desviación del pH. Presencia de fosfato además de glucosa u otros azúcares y agar.

Agar no en solución, mal mezclado, almacenamiento prolongado a 50 ° C. Sobrecalentamiento a valores de pH bajos. Error en el pesaje o sobredilución con inóculo o suplementos de medios. pH demasiado bajo para agar.

Calentamiento prolongado y excesivo, solución incompleta. Sustancias inhibidoras en agua o recipientes. Oscurecimiento y deriva del pH.

Preparación de medios esterilizados

Los medios líquidos esterilizados en sus envases finales deben enfriarse a temperatura ambiente lo más rápido posible. A continuación, se deben apretar los tapones de rosca.

Los recipientes de medio de agar esterilizados deben colocarse en un baño de agua a 50 ° C y dispensarse el medio tan pronto como alcance esta temperatura, o en un plazo máximo de 3 horas en el baño. El medio debe mezclarse completamente, sin formación de burbujas, y dispensarse asépticamente en recipientes estériles. No exponga las placas con medio de agar a la luz solar, ya que provoca una condensación excesiva en las tapas y puede provocar la formación de sustancias inhibidoras por fotooxidación.

Los suplementos termolábiles deben agregarse al medio después de que se haya enfriado a 50 ° C. Deje que el suplemento estéril alcance la temperatura ambiente antes de agregarlo al medio de agar. Los líquidos muy fríos pueden hacer que el agar gelifique o forme escamas transparentes que se pueden ver fácilmente, p. Ej. en agar enriquecido con sangre. Mezcle todos los suplementos en el medio de manera suave y completa, luego distribúyalos en los recipientes finales lo más rápido posible.

La sangre utilizada para la preparación de agar sangre debe estar lo más fresca posible y debe haberse almacenado a 2-8 ° C (la sangre no debe congelarse). Caliente la sangre en una incubadora a 35 ° C antes de agregarla a la base de agar fundido estéril, que se ha enfriado a 40-45 ° C. Una mezcla adecuada en un vaso grande con espacio de cabeza es esencial para asegurar la aireación de la sangre. Las placas de sangre mal oxigenadas son de color violáceo, mientras que el agar sangre adecuadamente aireado es de color rojo cereza. Se recomienda usar sangre desfibrinada en lugar de sangre que contenga un anticoagulante.

Almacenamiento de medios preparados

La vida útil recomendada de los medios de cultivo preparados varía considerablemente. Los frascos con tapón de rosca de caldo nutritivo y agar se pueden almacenar durante 6 meses a baja temperatura ambiente (12 a 16 ° C). Es importante almacenar todos los medios lejos de la luz. Las placas de agar deben almacenarse a 2-8 ° C en recipientes sellados para evitar la pérdida de humedad. NO CONGELAR.

Los medios frescos son mejores que los medios almacenados, por lo tanto, evite tiempos de almacenamiento prolongados. Algunos agentes selectivos de betalactámicos muy lábiles tienen una vida activa muy corta y los medios que contienen dichas sustancias deben usarse a los pocos días de su preparación.

Es una buena práctica de laboratorio establecer la vida útil de todos los medios preparados y sellar la fecha en los envases o soportes según corresponda.

La pérdida de humedad de las placas de agar es una causa común de desempeño bacteriológico deficiente. No preincube todas las placas durante la noche como control de esterilidad. Solo las placas obviamente húmedas requieren un secado previo a la inoculación.

Asegúrese de que todas las placas se incuben en un ambiente húmedo.

Examine los medios preparados antes de la inoculación. Busque evidencia de contaminación, relleno desigual o burbujas en la superficie del agar, cambios de color, hemólisis y signos de deshidratación como encogimiento, agrietamiento y pérdida de volumen. Deseche las placas o tubos defectuosos.

Precauciones en el uso y eliminación de medios preparados

Debe reconocerse que la inoculación de bacterias en los medios de cultivo, deliberada o accidentalmente, conduce a la producción de un gran número de organismos. Las concentraciones elevadas de cualquier organismo son potencialmente peligrosas y deben eliminarse de forma segura mediante métodos aprobados.

Todas las muestras infectadas y los medios de cultivo inoculados deben ser manipulados únicamente por personal calificado que haya sido capacitado en procedimientos microbiológicos. Dicho personal debe asegurarse de que todas las muestras y cultivos bajo su cuidado se manipulen adecuadamente y finalmente se esterilicen en autoclave antes de su eliminación. Cualquier aparato utilizado y contaminado debe desinfectarse o esterilizarse de forma segura, lo que es particularmente importante cuando dicho aparato debe ser reparado o sacado del laboratorio.

También debe tenerse en cuenta el entorno en el que se manipulan los cultivos microbiológicos. La mayoría de los países tienen categorías de organismos que se dividen en aquellos que pueden manipularse en el laboratorio microbiológico general, aquellos que requieren condiciones especiales de laboratorio y para los organismos más peligrosos se requiere un ambiente totalmente contenido y altamente protegido. Puede ser un delito no observar estas reglas y regulaciones. Cuando utilice medios de cultivo, siempre etiquete o identifique el recipiente con los detalles de la muestra antes de la inoculación.

Inocular el medio mediante técnicas asépticas e incubar en las condiciones adecuadas.

Examine el medio después de la incubación en busca de evidencia de crecimiento microbiano y lleve a cabo los procedimientos apropiados de aislamiento e identificación.

Precauciones: medios deshidratados

La mayoría de los productos suministrados no presentan riesgos conocidos, excepto los asociados habitualmente a los polvos finos. Sin embargo, para evitar el riesgo de inhalar polvo fino, se recomienda el uso de máscaras mientras se manipulan medios deshidratados. La mascarilla elegida debe funcionar al nivel del Estándar Británico No. 6016. El tipo de mascarilla fabricado por 3M Corporation sería adecuado para este propósito.

Las hojas de datos de peligro están disponibles para productos individuales.

Los medios de cultivo deshidratados suministrados en forma de polvo, gránulos o tabletas no deben ingerirse.Los polvos no deben inhalarse porque puede producirse irritación del tracto respiratorio superior, especialmente con productos de sales biliares. Para evitar erupciones cutáneas leves, evite el contacto prolongado con el polvo. Los productos en polvo, si se derraman, se pueden barrer y eliminar de la forma habitual. Cualquier residuo debe lavarse con abundante agua fría.

Hay algunos productos que contienen sustancias tóxicas y deben tratarse con cuidado.

1 & # 9Medios que contienen sales de talio. Estos productos están etiquetados como VENENO.

Las sales de talio son muy tóxicas por inhalación o por ingestión y existe el peligro de efectos acumulativos. Los productos que contienen sales de talio deben mantenerse alejados de alimentos, bebidas y piensos. Utilice siempre una máscara y guantes cuando manipule el polvo.

2 & # 9 Medios que contienen azida sódica

Estos productos contienen menos del 1% de azida sódica y tienen baja toxicidad. Algunas personas, sin embargo, tienen una mayor sensibilidad a la azida y, por lo tanto, podrían reaccionar ante una exposición accidental al producto. Se deben tomar precauciones para evitar la ingestión o inhalación del polvo. Utilice siempre guantes, mascarilla y protección para los ojos.

La azida de sodio reacciona con muchos metales, especialmente el cobre, para producir azidas metálicas explosivas. Cuando se lavan productos que contienen sumideros de azida, es esencial que se utilice suficiente agua para evitar que el polvo permanezca en contacto con las tuberías y los conductos. La misma precaución se aplica a cualquier solución biológica que contenga azida de sodio como conservante.

3 y # 9 Biselenita de sodio. Este producto está etiquetado como TÓXICO.

Es corrosivo al contacto con la piel y produce efectos tóxicos si se inhala o ingiere. Se han sugerido efectos teratogénicos.

Este compuesto, preparado en viales de suplemento, alcanza una concentración que se considera tóxica y se etiqueta en consecuencia. Sin embargo, cuando se diluye en el medio de cultivo, su concentración cae por debajo del nivel mínimo considerado peligroso. Al reconstituir viales que contienen niveles tóxicos de cicloheximida, es importante asegurarse de que la solución del vial no toque la piel y evitar la creación de aerosoles que permitirían inhalar el compuesto. Se recomiendan guantes protectores y mascarilla al usar estos viales.

Pruebas de control de calidad de laboratorio de usuario en medios preparados

Las pruebas de control de calidad deben ser realizadas por el laboratorio del usuario final para asegurar que las características de desempeño del medio están dentro de las especificaciones y que la metodología de preparación del medio es satisfactoria.

Cada lote / lote de medio preparado debe someterse a un programa de pruebas mínimo que garantizará que sea aceptable y demostrará un comportamiento bacteriano típico.

Valor de pH 1 y # 9: compruebe que el pH del medio preparado, cuando se prueba en su forma final a temperatura ambiente (25 ° C), se encuentre dentro del rango indicado en la etiqueta del producto. El medio debe desecharse si el valor de pH se encuentra fuera del rango especificado.

2 y # 9 Esterilidad: se debe incubar una muestra representativa de cada lote / lote de medio durante 2-5 días a 35-30 ° C y 50-55 ° C. Como regla general, para un lote de 100 unidades o menos, se debe analizar una muestra del 3-5%. Para un lote más grande, se toman 10 placas o tubos al azar. No debe haber evidencia de crecimiento microbiano después de la incubación. Deseche todas las muestras de esterilidad cuando se hayan completado las pruebas.

3 & # 9 Rendimiento del crecimiento: pruebe las propiedades de soporte del crecimiento del producto inoculando el medio con cultivos madre apropiados y / o aislados frescos. Utilice un procedimiento de inoculación estándar y examine los resultados cuantitativos y cualitativos obtenidos. Si está probando nuevos lotes / lotes de medios, inocule los lotes antiguos y nuevos en una prueba y compare el rendimiento de los dos lotes uno al lado del otro.

Estabilidad 4 y 9: realice periódicamente los procedimientos anteriores en los medios preparados almacenados para determinar si las condiciones de almacenamiento darán resultados óptimos.

NOTA: Si un medio no cumple con las expectativas y se han seguido todas las recomendaciones del fabricante, se deben seguir los siguientes pasos: (1) registrar la naturaleza del problema y el método de preparación del medio (2) anotar el lote / número de lote y fecha de recepción (3) llamar al departamento de Servicios Técnicos del proveedor.

& # 9 (reproducido, con pocos cambios, de The Oxoid Manual, sexta edición, 1990)

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  1. Muestra de prueba
  2. Agar para recuento en placa (PCA) o agar nutriente
  3. Baño de agua caliente a 45 ° C
  4. Placas de Petri estériles
  5. Fuego
  6. Contador de colonias con lupa
  7. Tubos de ensayo con tapón estéril de 16 * 150 mm
  8. Pipetas de varios tamaños (por ejemplo, 01, 1.0 y 2.0 mL)
  1. Prepare la dilución de la muestra de prueba que se espera que contenga entre 30 y 300 UFC / mL. (Siga la técnica de dilución en serie)
  2. Inocular una placa de Petri vacía etiquetada con el ml especificado (0,1 o 1,0 ml) de muestra diluida.

Nota: para obtener una descripción detallada sobre el uso de la pipeta, la inoculación de la muestra, la técnica de dilución, etc., siga la referencia 1.

Verter el agar fundido e incubación.

  1. Recoger una botella de agar fundido estéril. (que contiene 15 mL de Plate Count Agar derretido o cualquier otro medio de cultivo estándar) del baño de agua (45 ° C).
  2. Sostenga el frasco con la mano derecha y retire la tapa con el dedo meñique de la mano izquierda.
  3. Flamear el cuello de la botella.
  4. Levante la tapa de la placa de Petri ligeramente con la mano izquierda y vierta el agar fundido estéril en la placa de Petri y vuelva a colocar la tapa.
  5. Flame el cuello de la botella y vuelva a colocar la tapa.
  6. Gire suavemente la placa sobre la mesa para mezclar bien el cultivo y el medio. Asegúrese de que el medio cubra la placa de manera uniforme y no deslice el agar sobre el borde de la placa de Petri.
  7. Deje que el agar gelifique completamente sin molestarlo, tomará aproximadamente 10 minutos.
  8. Selle e incube la placa en posición invertida a 37 ° C durante 24-48 horas.

Resúmenes

Trichophyton mentagrophytes es un hongo agente causante de dermatofitosis que afecta a los seres humanos en todo el mundo. Esto ha impulsado la búsqueda de productos para el tratamiento de estas infecciones. En consecuencia, el objetivo de este estudio fue investigar la actividad antifúngica del aceite esencial de Cymbopogon winterianus contra T. mentagrophytes. Las pruebas antifúngicas consistieron en un cribado antifúngico, determinación de MIC y MFC, análisis de los efectos del aceite esencial sobre el crecimiento micelial, germinación de esporas fúngicas, viabilidad fúngica, morfogénesis, pared celular (prueba con sorbitol) y membrana celular (prueba de fuga celular) de T. mentagrophytes. Tras la selección, el aceite inhibió todas las cepas, con zonas de inhibición del crecimiento de 24-28 mm de diámetro. La CIM fue de 312 μg / mL y la CFM fue de 2500 μg / mL para casi todas las cepas analizadas. Hubo cambios morfológicos en el grupo de conidios, forma y pigmentación de hifas. La acción antifúngica del producto no afecta a la pared celular y su acción puede afectar a la membrana plasmática de los hongos. Se concluye que el aceite esencial de C. winterianus constituye un producto antifúngico potencial, especialmente para el tratamiento de la dermatofitosis.

Trichophyton mentagrophytes Dermatofitosis Cymbopogon winterianus Dermatofitosis Cymbopogon winterianus Dermatofitos

Trichophyton mentagrophytes é um fungo causador de dermatofitosis, afetando humanos en todo el mundo. Isto direciona a busca de produtos para o tratamento destas infecções. Assim, este estudo teve por objetivo investigar a atividade antifúngica do óleo essencial de Cymbopogon winterianus contra T. mentagrophytes. Os ensaios antifúngicos foram constituídos do screening antifúngico, da determinação CIM e CFM, da análise dos efeitos do óleo essencial no crescimento micelial, na germinação dos esporos, na viabilidade fúngica, na morfogênese, na parede celular (ensaio com sorbitol) e na membrana celular (ensaio de lise celular) de T. mentagrophytes. Sin proyección, o óleo inibiu todas as cepas, com zonas de inibição de crescimento de 24-28 mm de diâmetro. Un CIM foi de 312 μg / mL y un CFM foi de 2500 μg / mL para quase todas las cepas testadas. O óleo essencial inibiu o desenvolvimento micelial, a germinação dos esporos e a viabilidade fúngica. Houve alterações morfológicas no agrupamento dos conídios, na forma e pigmentação das hifas. A ação antifúngica do produto não envolve a parede celular e parece estar envolvida con una membrana celular fúngica. Pode-se concluir que el óleo esencial de C. winterianus se apresenta como um potencial producto antifúngico, especialmente para el tratamiento de las dermatofitosis.

Trichophyton mentagrophytes Cymbopogon winterianus Cymbopogon winterianus Dermatofitosis Dermatófitos

Efectos de Cymbopogon winterianusAceite esencial Jowitt ex Bor sobre el crecimiento y morfogénesis de Trichophyton mentagrophytes

Fillipe de Oliveira PereiraI, * * Correspondencia: F. O. Pereira. Laboratório de Micologia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, 58051-900 Campus Universitário I, Castelo Branco I - João Pessoa - PB, Brasil. Correo electrónico: [email protected] Paulo Alves Wanderley II Fernando Antônio Cavalcanti Viana III Rita Baltazar de Lima IV Frederico Barbosa de Sousa V Sócrates Golzio dos Santos VI Edeltrudes de Oliveira Lima I

I Laboratorio de Micología, Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Centro de Ciencias de la Salud, Universidad Federal de Paraíba

II Instituto Federal de Educación, Ciencia y Tecnología, Departamento de Sousa-PB

III Jardín de Plantas Medicinales, Laboratorio de Tecnología Farmacéutica, Universidad Federal de Paraíba

IV Laboratorio de Botánica, Departamento de Sistemática y Ecología, Centro de Ciencias Matemáticas y Naturaleza, Universidad Federal de Paraíba

V Laboratorio de Microscopía e Imagen Biológica, Centro de Ciencias de la Salud, Universidad Federal de Paraíba

VI Laboratorio de Tecnología Farmacéutica, Universidad Federal de Paraíba

Trichophyton mentagrophytes es un hongo agente causante de la dermatofitosis que afecta a los seres humanos en todo el mundo. Esto ha impulsado la búsqueda de productos para el tratamiento de estas infecciones. En consecuencia, el objetivo de este estudio fue investigar la actividad antifúngica de la Cymbopogon winterianus aceite esencial contra T. mentagrophytes. Las pruebas antifúngicas consistieron en un cribado antifúngico, determinación de MIC y MFC, análisis de los efectos del aceite esencial sobre el crecimiento micelial, germinación de esporas fúngicas, viabilidad fúngica, morfogénesis, pared celular (prueba con sorbitol) y membrana celular (prueba de fuga celular) de T. mentagrophytes. Tras la selección, el aceite inhibió todas las cepas, con zonas de inhibición del crecimiento de 24-28 mm de diámetro. La CIM fue de 312 μg / mL y la CFM fue de 2500 μg / mL para casi todas las cepas analizadas. Hubo cambios morfológicos en el grupo de conidios, forma y pigmentación de hifas. La acción antifúngica del producto no afecta a la pared celular y su acción puede afectar a la membrana plasmática de los hongos. Se concluye que C. winterianus El aceite esencial constituye un producto antifúngico potencial, especialmente para el tratamiento de la dermatofitosis.

Uniterms: Trichophyton mentagrophytes/micología. Dermatofitosis Cymbopogon winterianus /Aceite esencial / actividad antifúngica. Dermatofitos.

Trichophyton mentagrophytes é um fungo causador de dermatofitosis, afetando humanos en todo el mundo. Isto direciona a busca de produtos para o tratamento destas infecções. Assim, este estudo teve por objetivo investigar a atividade antifúngica do óleo essencial de Cymbopogon winterianus contra T. mentagrophytes. Os ensaios antifúngicos foram constituídos do poner en pantalla antifúngico, da determinação CIM e CFM, da análise dos efeitos do óleo essencial no crescimento micelial, na germinação dos esporos, na viabilidade fúngica, na morfogênese, na parede celular (ensaio com sorbitol) e na membrana celular (ensaio de lise celular) de T. mentagrophytes. No poner en pantalla, o óleo inibiu todas as cepas, com zonas de inibição de crescimento de 24-28 mm de diâmetro. Un CIM foi de 312 μg / mL y un CFM foi de 2500 μg / mL para quase todas las cepas testadas. O óleo essencial inibiu o desenvolvimento micelial, a germinação dos esporos e a viabilidade fúngica. Houve alterações morfológicas no agrupamento dos conídios, na forma e pigmentação das hifas. A ação antifúngica do produto não envolve a parede celular e parece estar envolvida con una membrana celular fúngica. Pode-se concluir que oleo essencial de C. winterianus se apresenta como um potencial produto antifúngico, especialmente para o tratamento das dermatofitoses.

Unitermos:Trichophyton mentagrophytes/ micologia. Cymbopogon winterianus/ óleo esencial / atividade antifúngica. Dermatofitosis / tratamento. Dermatófitos.

Los dermatofitos son un grupo de hongos patógenos relacionados especializados en sustratos queratinosos como la piel, el cabello y las uñas de humanos y otros animales que producen dermatofitosis (Weitzman, Summerbell, 1995). La dermatofitosis afecta aproximadamente al 40% de la población mundial y representa el 30% de todas las infecciones cutáneas micóticas. T. mentagrophytes, entre otros dermatofitos, afligen al hombre, otros mamíferos y aves. Se distribuye por todo el mundo, afectando principalmente al cuero cabelludo, pies y manos, uñas y zonas interdigitales humanos. Actualmente, es uno de los dermatofitos más comúnmente encontrados en humanos (Oyeka, 2000).

Desafortunadamente, la cantidad de medicamentos antimicóticos disponibles para combatir la dermatofitosis es limitada. Además, esta infección puede volverse resistente al tratamiento, que en consecuencia se vuelve ineficaz (Favre et al., 2003). La aparición de infecciones fúngicas ha aumentado significativamente en los últimos años y se ha ampliado el uso de agentes antifúngicos, mientras que ha crecido la consiguiente aparición de cepas resistentes. Por lo tanto, las investigaciones destinadas a diseñar nuevos productos antimicóticos se han vuelto esenciales.

En este contexto, ha aumentado el interés por las plantas con propiedades antifúngicas porque representan una fuente prometedora de posibles nuevos productos. Los aceites esenciales de plantas medicinales han sido los más utilizados en el tratamiento de patologías infecciosas en muchas partes del cuerpo incluida la piel (Ríos Recio, 2004). Desde hace mucho tiempo se reconoce que algunos aceites esenciales se utilizan ampliamente para actividades antimicrobianas, especialmente en las industrias farmacéutica, sanitaria, cosmética, agrícola y alimentaria (Bakkali et al., 2008).

Cymbopogon winterianus Jowitt ex Bor (Poaceae), popularmente conocida como "citronela" o "java citronella", es una hierba perenne que forma macizos compactos y fuertes de un metro de altura, de amplio uso en la medicina popular de la costa de Brasil. Se utiliza como antimicótico, acaricida y repelente contra una variedad de insectos (Pandey, Rai, 2003). Este estudio se llevó a cabo para investigar la actividad antifúngica de C. winterianus aceite esencial, analizando sus efectos sobre T. mentagrophytes son.

Hojas de C. winterianus fueron recolectadas en el Centro de Formación de Técnicos de la Universidad Federal de Paraiba (campus IV), ciudad de Bananeiras, estado de Paraiba- Brasil, en febrero de 2007. Se obtuvo la identificación botánica de la planta y se depositó una muestra de comprobante (JPB 41387) en el Herbario Profesor Lauro Pires Xavier, de la Universidad Federal de Paraíba.

Hojas frescas de C. winterianus se cortaron en trozos y se sometieron a destilación de agua utilizando un aparato Clevenger. El aceite esencial obtenido (densidad = 0,8790 g / mL) se mantuvo en un matraz botella ámbar y se mantuvo a temperatura inferior a 4 ° C. La emulsión de aceite utilizada en los ensayos antifúngicos se obtuvo de acuerdo con el siguiente procedimiento: 34 μL de aceite esencial, 10 μL de Tween 80 y c.s.f. Se agregaron 3 mL de agua destilada estéril, a un tubo estéril y se agitó durante 3 minutos utilizando un instrumento de vórtice, obteniendo así una emulsión stock con una concentración final de 10000 μg / mL. Se realizaron diluciones seriadas en proporción de dos para obtener emulsiones de 5000 - 5 μg / mL.

Ocho cepas de T. mentagrophytes se utilizaron en ensayos antifúngicos. Estos dermatofitos se obtuvieron de la colección del Laboratorio de Micología (LM), Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Centro de Ciencias de la Salud, Universidad Federal de Paraiba. Los hongos se mantuvieron en agar papa dextrosa (PDA) - Difco® - a 28 ° C y 4 ° C hasta los procedimientos de prueba.

Inóculos de stock de T. mentagrophytes se prepararon cepas a partir de cultivos de 10 días en PDA a 28 ° C para inducir la esporulación. Las colonias de hongos se cubrieron con 5 ml de solución salina estéril (NaCl al 0,85% p / v), la superficie se raspó suavemente con un asa estéril y la mezcla resultante de unidades de hongos se transfirió luego a un tubo estéril. La turbidez del inóculo final se estandarizó de acuerdo con un tubo de 0,5 de escala McFarland y se ajustó a una población de hongos de 106 unidades formadoras de colonias (UFC). La confirmación de la cuantificación del inóculo se realizó sembrando 0.01 mL de suspensión de inóculo en agar Sabouraud dextrosa (SDA). Las placas se incubaron a 28 ° C y se examinaron diariamente para detectar la presencia de colonias de hongos que se contaron tan pronto como el crecimiento se hizo visible (Santos et al., 2006 Hadacek, Greger, 2000).

Detección de actividad antifúngica

Se empleó el método de difusión en medio sólido utilizando discos de papel de filtro para la detección de la actividad antifúngica (Hadacek, Greger, 2000 Adam et al., 1998). Se preparó agar estéril Sabouraud dextrosa (SDA) - Difco ® - y se distribuyó uniformemente en placas de Petri estériles, donde previamente se inoculó 1 ml de la suspensión fúngica. Posteriormente, se empaparon discos de papel de filtro (diámetro 6 mm) con aceite esencial y se colocaron sobre la superficie del agar inoculado. Los platos se incubaron a 37 ° C durante 8 días. Al final del período de incubación, se midió el diámetro de la zona de inhibición del crecimiento fúngico y se expresó en milímetros. Los resultados se consideraron positivos para la actividad antifúngica cuando los valores medios de la zona de inhibición del crecimiento en dos ensayos independientes fueron mayores o iguales a 10 mm de diámetro.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC)

Los valores de MIC se determinaron para las cepas de hongos que eran sensibles al aceite esencial en el ensayo de difusión en medio sólido. Se utilizó un bioensayo de microdilución en caldo para determinar la CMI del C. winterianus aceite esencial (Moreira et al., 2010 Sahin et al., 2004). Para ello, se utilizaron platos de 96 pocillos (fondo plano) y tapones. Las placas de 96 pocillos se prepararon mediante la dispensación de 100 μL de caldo dextrosa Sabouraud doblemente concentrado (SDB) (Difco®) en cada pocillo. Se colocó un volumen de 100 μl de la emulsión de stock de aceite esencial en los primeros pocillos. Posteriormente, se transfirieron 100 μL de sus diluciones seriadas a pocillos consecutivos, excluyendo el último. El último pocillo contenía 100 μL de caldo inoculado con inóculo fúngico para confirmar la viabilidad celular (control de viabilidad). El control positivo se llevó a cabo de manera similar con un antifúngico estándar usando ketoconazol (Sigma-Aldrich®). En ambos casos, la concentración más alta (5000 μg / mL) se colocó en los primeros pozos y la concentración más baja (5 μg / mL) en los penúltimos pozos. Se llevó a cabo un control de sensibilidad de las cepas ensayadas al Tween 80 sin aceite esencial. Se colocó un volumen de 100 µl de Tween 80 al 5% en caldo en los pocillos y se inocularon 10 µl de suspensiones fúngicas en cada pocillo respectivo. Además, se realizó un control de esterilidad para verificar si el caldo utilizado en el ensayo antifúngico estaba contaminado antes de los procedimientos de prueba. Para ello, se dispensaron 100 μL de caldo en un pozo, sin aceite esencial ni inóculo.

Todas las placas se sellaron asépticamente y luego se mezclaron en un agitador de placas (300 rpm) durante 30 segundos, se incubaron a 28ºC y se leyeron después de 5 días de incubación. Los valores de MIC se determinaron mediante inspección visual de la inhibición del crecimiento de cada pocillo en comparación con la del control (sin fármacos). La MIC se definió como la concentración de aceite esencial más baja capaz de inhibir el crecimiento de hongos en un 100%. La prueba se realizó por duplicado y se calcularon los valores medios geométricos (Santos et al., 2006).

Determinación de la concentración mínima de fungicida (MFC)

La MFC se determinó mediante el método de microdilución para verificar si la inhibición era reversible o permanente (Denning et al., 1992 Rasooli Abyaneh, 2004). Se transfirieron alícuotas de 20 μL de los pocillos que no mostraron crecimiento en el procedimiento de MIC a placas de 96 pocillos previamente preparadas con 100 μL de SDB. Las placas se sellaron asépticamente y luego se mezclaron en un agitador de placas (300 rpm) durante 30 segundos, se incubaron a 28ºC y se leyeron 5 días después de la incubación. La prueba se realizó por duplicado y se calcularon los valores medios geométricos. MFC se definió como la concentración de aceite esencial más baja para la que no se produjo crecimiento visible cuando se subcultivó en las placas de 96 pocillos que contenían caldo sin productos antifúngicos.

Efectos sobre el crecimiento micelial

Análisis de la interferencia del aceite esencial de C. winterianus sobre el crecimiento micelial se realizó determinando el peso micelial seco de T. mentagrophytes LM02 (Rasooli, Abyaneh, 2004 Sharma, Tripathi, 2006). Se inocularon frascos que contenían 2500, 625, 312 y 156 μg / mL de aceite esencial en medio SDB con suspensión de la prueba. T. mentagrophytes cepa. En el control correspondiente, se reemplazó la misma cantidad de aceite esencial por agua destilada. El sistema se incubó a 28 ° C durante 15 días. A partir del sexto día de incubación, se determinó el peso seco del micelio cada 3 días. Los matraces que contenían micelios se filtraron a través de un filtro Whatman nº. 1 (retención de partículas: 11 μm) y luego se lavó con agua destilada. Los micelios se secaron a 60 ° C durante 6 h y luego a 40 ° C durante la noche. Se pesó el papel de filtro que contenía micelio seco de dos ensayos independientes y se obtuvieron los valores medios. El porcentaje de inhibición del crecimiento basado en el peso seco en cada momento de análisis, se calculó de acuerdo con Sharma y Tripathi (2006).

Ensayo de germinación de esporas

Evaluar el poder del aceite esencial de C. winterianus sobre la germinación de esporas de hongos T. mentagrophytes Se utilizó LM02, concentraciones de aceite esencial de 156, 312, 625 y 2500 μg / mL, un control con tween 80 (10% en agua destilada) y otro control con agua destilada. En tubos de ensayo estériles, se mezclaron uniformemente 500 mL de CSD doblemente concentrado más el aceite esencial con 500 mL de suspensión de conidios fúngicos y se incubaron inmediatamente a 28 ° C. Se tomaron muestras de esta mezcla después de 24 h de incubación para su análisis. Todo el experimento se realizó por duplicado, donde se determinó el número de conidios en una cámara de Neubauer y se calculó el porcentaje de inhibición de la germinación de esporas en cada punto de tiempo comparando los resultados obtenidos en los experimentos de prueba con los resultados del experimento de control. El análisis se realizó bajo un microscopio óptico (Zeiss® Primo Star) (Rana et al., 1997 Liu et al., 2007).

Se realizó un estudio de viabilidad fúngica con el aceite esencial de C. winterianus a 156, 312, 625 y 2500 μg / mL, utilizando el método de recuento de estructuras fúngicas viables. Se inoculó un volumen de 4 ml de CSD con 1 ml de la suspensión fúngica. A continuación, se añadió el aceite esencial en la cantidad necesaria para alcanzar las concentraciones informadas anteriormente. Se añadió un volumen de 1 mL de inóculo y luego el aceite esencial en la cantidad necesaria para alcanzar las concentraciones reportadas anteriormente. Todo el sistema se incubó a 28 ° C. A diferentes intervalos de tiempo (3, 6, 9 y 12 días) después de la incubación, se diluyó una alícuota de 0.5 mL de los tubos en agua estéril, se esparció en placas SDA Petri y se incubó a 28 ° C durante 5 días. Se utilizó un control con tween 80 (10% en agua destilada) y otro control sin aceite esencial. El recuento del número de colonias viables se realizó y expresó como logCFU / mL (Rasooli et al., 2004).

Estudio de morfogénesis fúngica

La evaluación de las alteraciones micromorfológicas provocadas por el aceite esencial de C. winterianus en T. mentagrophytes La LM02 se realizó por duplicado mediante la técnica de cultivo en portaobjetos. Primero, se transfirió un bloque de SDA que contenía el aceite esencial (78, 156, 312 μg / mL) al centro de un portaobjetos de vidrio en una placa de Petri con un trozo de papel de filtro. Posteriormente, se tomó una muestra de micelio de la periferia de una colonia de hongos de 10 días cultivada en PDA y se inoculó en el centro de los lados del bloque de medio de agar. Aproximadamente 1,5 mL de agua esterilizada se colocaron en el fondo de la placa de Petri y se incubaron a 28 ºC durante 5 días. Después de la incubación, los portaobjetos con estructuras reproductivas se fijaron en lacto-fenol-azul de algodón y se observaron bajo un microscopio óptico (Olympus® modelo CH-30) a 400x para examinar las anomalías morfológicas. Los cambios estructurales observados en microscopía óptica en los ensayos de prueba se registraron y se compararon con el crecimiento normal encontrado en el experimento de control. El ensayo de control sin aceite esencial se probó de la misma manera (Gunji et al., 1983 helada et al., 1995).

Ensayo de protección con sorbitol

Valores de MIC del C. winterianus El aceite esencial se determinó utilizando T. mentagrophytes cepas mediante el procedimiento de microdilución en caldo descrito anteriormente. Se prepararon platos por duplicado: uno de estos contenía diluciones al doble de aceite esencial mientras que el otro contenía el aceite esencial más sorbitol 0,8 M como soporte osmótico, en cada uno de los pocillos. Los MIC se leyeron a los 5 días (Escalante et al., 2008).

Efectos de fuga celular

El aceite esencial de C. winterianus a 78, 156, 312 μg / mL se añadió a 10 mL de suspensión fúngica de T. mentagrophytes LM02 utilizando tubos estériles. Como compuesto de referencia se utilizó una solución alcohólica de hidróxido de potasio al 25% (diluida con etanol al 70%), que produce una fuga celular del 100%. Se utilizó como control positivo la CMI de anfotericina B (0,60 μg / ml). Las células se incubaron a 28 ° C y se tomaron muestras a intervalos de tiempo (2, 4 y 24 h) y se centrifugaron a 3000 rpm durante 5 min en tubos de centrífuga. Los sobrenadantes se recogieron para el análisis de absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro Varian Cary 50. Los resultados se expresan como la media de los valores porcentuales de fuga celular de dos ensayos independientes (Escalante et al., 2008 Lunde, Kubo, 2000)

Se realizó un análisis estadístico para el estudio de los efectos del aceite esencial sobre el peso del micelio para determinar diferencias estadísticamente significativas (P & lt0.05) empleando análisis de varianza (ANOVA de una vía) utilizando la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba de Dunn post- prueba. Para ello, la implementación del análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism versión 4.03 para Windows, San Diego, California, EE. UU.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Resultados de la actividad antifúngica de C. winterianus aceite esencial en T. mentagrophytes cepas se muestran en la Tabla I. El aceite esencial in natura pudo inhibir todas las cepas probadas con diámetros de zonas de inhibición de 24-28 mm. Los valores de MIC también se resumen en la Tabla I. Como puede verse, la MIC del aceite esencial fue de 312 μg / mL para todas las cepas ensayadas, excepto una. El valor de MIC más bajo fue de 156 μg / mL para T. mentagrophytes LM07. El ketoconazol mostró una CIM más baja que el aceite esencial, donde los valores de la CMI fueron 78, 156 y 312 μg / mL para ketoconazol. Los resultados del control mostraron ausencia de inhibición del crecimiento de hongos por Tween 80, mientras que el crecimiento de hongos en caldo sin adición de fármacos fue detectable (control de esterilidad). El efecto fungicida fue más fuerte para T. mentagrophytes LM07, evidenciado por el valor más bajo de MFC de 1250 μg / mL. Los valores de MFC fueron alrededor de ocho veces más altos que MIC para todas las cepas probadas. Sin embargo, los MFC para ketoconazol fueron aproximadamente dieciséis veces más altos que los valores de MIC (1250-5000 μg / mL).

Desde hace mucho tiempo se reconoce que algunos aceites esenciales tienen propiedades antimicrobianas que posiblemente estén relacionadas con la función de estos compuestos en las plantas (Burt, 2004). Anteriormente, se demostró que este aceite esencial exhibe un efecto antimicrobiano contra diversos microorganismos patógenos para humanos y plantas, siendo útil para el control de enfermedades micóticas en grandes plantaciones, además de su actividad como repelente e insecticida (Simic et al., 2008 De-Blasi et al., 1990).Estudios anteriores informaron que el citronelal y el geraniol mostraron actividad antifúngica contra Aspergillus niger, Fusarium oxysporum y Penicillium digitatum (Moleyar, Narasimham, 2004). Sin embargo, existe escasa información sobre los efectos de C. winterianus aceite esencial contra hongos clásicos importantes implicados en infecciones humanas, incluidas especies de dermatofitos.

Los efectos de C. winterianus aceite esencial sobre el crecimiento micelial se expresan como porcentaje de inhibición en peso micelial seco de T. mentagrophytes LM02 y se muestra en la Figura 1. Este estudio reveló que todas las concentraciones de aceite esencial inhiben el desarrollo del micelio. En cada punto de tiempo separado, todas las concentraciones probadas difirieron (P & lt0.05) de los resultados de 156 μg / mL. Además, a 156 μg / mL, el impedimento del crecimiento micelial aumentó con el tiempo de interacción entre el fármaco y las células fúngicas. Con el resto de concentraciones de aceite esencial, hubo un 100% de inhibición en todos los momentos analizados. Los dermatofitos producen hifas que pueden penetrar la capa más interna de la piel y agravar el daño en el hospedador (Zurita, Hay, 1987). Por lo tanto, algunos investigadores están investigando el potencial de los aceites esenciales para inhibir el crecimiento micelial de hongos patógenos, debido a su importancia en el desarrollo de micosis.

El porcentaje de inhibición de la germinación de conidios de T. mentagrophytes LM 02 causado por diferentes concentraciones de aceite esencial de C. winterianus se muestran en la Figura 2. En general, todas las concentraciones del aceite esencial ejercieron un fuerte efecto inhibidor sobre la germinación de conidios de la cepa probada. A medida que la concentración de aceite esencial aumentó de 156 a 625 μg / mL, el porcentaje de inhibición también aumentó, alcanzando valores cercanos al 100%. Aunque estos resultados son numéricamente relevantes, la ausencia de conidios germinados en el cultivo, lo que indica una inhibición total de la germinación, se observó solo a 2500 μg / mL. Al comparar estos resultados, es notable que el porcentaje de inhibición para 156 y 625, 2500 μg / mL fue significativamente diferente (P & lt0.05), apoyando la idea de que el aumento de la concentración de alguna manera mejora el efecto inhibidor sobre la germinación. Finalmente, se encontró que el tween 80 no afectó la germinación de los conidios. Debido a la importancia de una adecuada germinación de las esporas en la patogénesis de la dermatofitosis, la interferencia en el proceso provocada por el aceite esencial resulta relevante porque este producto demostró ser una herramienta prometedora para la intervención de este proceso infeccioso.

La figura 3 muestra los resultados con respecto a los efectos del aceite esencial. C. winterianus sobre la viabilidad de T. mentagrophytes LM 02. Después del análisis estadístico, se observó que los valores diferían (P & lt0.05) en cada momento de interacción analizada. Estas observaciones pueden verse porque los valores de logCFU / mL de aceite esencial siempre son más bajos que los observados en el experimento de control. El aceite esencial a 312 μg / mL fue capaz de reducir la viabilidad de los hongos durante el período experimental, alcanzando una inhibición de la viabilidad de los hongos del 100% a partir de nueve días de interacción. A 156 μg / mL este efecto también fue evidente, aunque se necesitó un período de interacción aceite-hongos más largo (12 días de exposición). Sin embargo, es notable que a las concentraciones más altas, los hongos no se desarrollaron a partir del tercer día de interacción, lo que hizo que las condiciones fueran completamente impracticables para el crecimiento. Tween 80 no afectó la viabilidad fúngica.

Las curvas de mortalidad fúngica son lo suficientemente sensibles como una prueba diseñada para medir dinámicamente la capacidad de un compuesto para actuar sobre la viabilidad de un microorganismo. La estimación de la mortalidad de las estructuras fúngicas también se puede inferir para una concentración dada de un compuesto antimicrobiano, mostrando la velocidad de un efecto fungicida o la duración de un efecto fungistático (Burt, 2003 Cantón Pemán, 1999). Así, considerando los resultados obtenidos, se confirmó un efecto fungicida para todas las concentraciones de aceite esencial de C. winterianus, difiriendo solo en el tiempo necesario para exhibir este efecto.

Observaciones de T. mentagrophytes LM02 examinado bajo un microscopio óptico a 400 aumentos después de la exposición a C. winterianus El aceite esencial mostró algunas anomalías morfológicas (Figura 4). El aceite esencial indujo alteraciones similares en todas las concentraciones, pero aumentó notablemente cuando se incrementó la concentración de aceite. Aunque la forma de T. mentagrophytes los conidios no cambiaron, su grupo típico estaba muy dañado y se demostró que estaban muy dispersos en todas las concentraciones de aceite esencial utilizado. La gran mayoría de las hifas eran a menudo más anchas que las hifas normales, con grandes pérdidas de pigmentación y presencia de vacuolas ampliamente distribuidas dentro de ellas (Figura 4 C, D). El examen microscópico del micelio de control (célula no tratada) mostró una estructura celular regular con citoplasma homogéneo, conidiación abundante, hifas septadas claras y largas, con microconidios muy redondeados agrupados en conidióforos ramificados. Algunas macroconidias estaban presentes en forma de cigarro, con paredes delgadas y uniones estrechas a las hifas (Figura 4 A, B). Los resultados de este informe impactan directamente en la patogenia de la enfermedad, ya que la dermatofitosis depende de la capacidad morfogénesis normal de los hongos y su crecimiento en el locus de infección.

Estas modificaciones en la morfogénesis de los hongos pueden estar relacionadas con la interferencia del aceite esencial con las enzimas responsables de la síntesis o del mantenimiento de la pared celular de los hongos, como han citado anteriormente otros investigadores, lo que perjudica el crecimiento normal y la morfogénesis celular (Debillerbeck et al. 2001 Gunji et al., 1983).

Teniendo en cuenta una posible interferencia del aceite esencial en la pared celular de los hongos, el aceite se probó en el ensayo de protección de sorbitol de células enteras. En esta prueba, las células protegidas con sorbitol pueden crecer en presencia de productos inhibidores de la pared celular del hongo, mientras que su crecimiento se inhibe en ausencia de sorbitol. Este efecto se detecta por un aumento en el valor de MIC obtenido con sorbitol en comparación con los valores de MIC sin sorbitol (Svetaz et al., 2007). Los valores de MIC en ambos experimentos fueron idénticos, lo que sugiere que C. winterianus El aceite esencial no actúa inhibiendo la síntesis o el ensamblaje de la pared celular de los hongos.

Una característica importante de C. winterianus El aceite esencial y sus fitoquímicos (por ejemplo, mono-terpenos) es su hidrofobicidad y, en consecuencia, pueden interactuar con la membrana fúngica, interfiriendo en su integridad. Este daño irreversible se puede detectar midiendo materiales absorbentes de 260 nm liberados al medio, que representan principalmente nucleótidos, de los cuales los compuestos que contienen uracilo exhibieron la mayor absorbancia en diferentes intervalos de tiempo (2, 4 y 24 h). Se usó anfotericina B como control positivo porque puede formar complejos con ergosterol en las membranas de los hongos, comprometiendo así su función de barrera hasta el punto de causar fugas de contenido celular (Odds et al., 2003). Los resultados mostraron que el aceite esencial y la anfotericina B produjeron una fuga celular del 100% a las 4 h de interacción, como se muestra en la Tabla II. Aunque el resultado obtenido para la CMI del aceite esencial había sido superior a la CMI del control positivo en 2 horas, ambos fueron estadísticamente similares.

Estos resultados confirman que la actividad antifúngica de C. winterianus El aceite esencial está relacionado con la interferencia con la integridad y funcionalidad de T. mentagrophytes membrana celular. Debido al carácter lipofílico de los aceites esenciales, pueden dividir las membranas de los hongos en lípidos haciéndolos más permeables, dañando su integridad y finalmente causando la muerte micelial (Sikkema et al., 1995 Cox et al., 2000 Burt et al., 2004). Por lo tanto, los resultados encontrados en este estudio pueden considerarse relevantes y prometedores. En conclusión, estos resultados apoyan el uso racional de C. winterianus aceite esencial para la inhibición del crecimiento de dermatofitos. Es más, C. winterianus El aceite esencial podría conducir a desarrollos futuros que involucren su posible uso racional para el tratamiento de la dermatofitosis.

Los autores desean agradecer al CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - Brasil) por las subvenciones y becas.


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