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¿Cuáles son los mecanismos que vinculan el código de histonas con el empalme alternativo?

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Hay algunas consideraciones bioinformáticas que muestran que existe una correlación significativa entre el código de histonas y el empalme alternativo; pero ¿cuáles son las hipótesis sobre los mecanismos subyacentes? ¿Existe alguna percepción experimental del problema?


Según la literatura, las marcas de histonas parecen afectar el empalme tanto directa como indirectamente.

La regulación indirecta parece deberse a un obstáculo biofísico, donde una determinada estructura de cromatina causaría una desaceleración de Pol-II, permitiendo que la maquinaria de empalme haga su trabajo.

La regulación directa parece depender esencialmente de H3K36me3 y H3K4me1, marcas que son reconocidas por MRG15, que a su vez recluta la proteína de unión al tracto de polipirimidina reguladora de empalme en los sitios de empalme.

Ref: Luco, R. F. et al. Regulación del empalme alternativo mediante modificaciones de histonas. Science 4 de febrero de 2010


La ciencia moderna refuta la teoría evolutiva

Con base en los coeficientes de correlación de Pearson, se dedujeron las relaciones casuales de las modificaciones de histonas en el proceso de empalme de ARN mediante la construcción de sus redes bayesianas. Los resultados indican que la inclusión o exclusión de exones está influenciada por patrones combinatorios de modificaciones de histonas. Algunas de las modificaciones de las histonas contribuyen directamente al empalme del ARN (p. Ej., H3K36me3 y H3K79me1), mientras que otras modificaciones de las histonas contribuyen indirectamente al empalme del ARN.

El resultado de que H3K36me3 y H3K79me1 pueden afectar el corte y empalme de ARN es consistente con estudios previos que han demostrado que H3K36me3 y H3K79me1 están enriquecidos en exones incluidos. El H3K36me3 puede regular el empalme alternativo al interactuar con la proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB). Al interactuar con el dominio Tudor de TP53BP1, también se informó que el H3K79me1 interactúa con el que interactúa con snRNP.

Al relajar la estructura de la cromatina, también se informó que la acetilación de H3 y H4 regulaba la inclusión o exclusión del exón de omisión. Además de las modificaciones de histonas ubicadas en regiones de exón, las modificaciones de histonas ubicadas en regiones intragénicas también pueden influir en el corte y empalme del ARN regulando las tasas de elongación de RNAPII, o al unirse directamente a factores de corte y empalme y, por lo tanto, mediar su unión al pre-ARNm ".

Mi comentario: el código de histonas es una base de datos compleja que puede almacenar información epigenética que afecta en gran medida la transcripción del ADN, el empalme previo al ARNm y las modificaciones postranscripcionales del ARNm. Está claro que el código de las histonas regula las características del organismo. Mediante el uso de marcadores epigenéticos de histonas, las células pueden convertir información digital (marcadora) en información analógica. El código de histonas es una indicación del Código de vida inteligente, información biológica compleja diseñada por nuestro Creador. Los escritores, lectores y borradores mantienen el código de la histona, lo que apunta al diseño inteligente. Sin embargo, no existe un mecanismo para la evolución, porque los mecanismos epigenéticos solo regulan la información biológica preexistente. No te pierdas.


El aprendizaje profundo del código genético de empalme (epi) revela un mecanismo candidato novedoso que vincula las modificaciones de histonas con la decisión del destino de ESC

El empalme alternativo (AS) es un procesamiento de pre-ARNm regulado genética y epigenéticamente para aumentar la diversidad de transcriptomas y proteomas. La decodificación integral de estos mecanismos reguladores es prometedora para obtener conocimientos más profundos en una variedad de contextos biológicos relacionados con la EA, como el desarrollo y las enfermedades. Ensamblamos código genético de empalme (epi), DeepCode, para la diferenciación de células madre embrionarias humanas (hESC) mediante la integración de características heterogéneas de secuencias genómicas, 16 modificaciones de histonas con una red neuronal profunda de múltiples etiquetas. Con las ventajas de las características epigenéticas, DeepCode mejora significativamente el rendimiento en la predicción de los patrones de empalme y sus cambios durante la diferenciación de hESC. Mientras tanto, DeepCode revela la superioridad de las características epigenómicas y sus roles dominantes en la decodificación de patrones AS, destacando la necesidad de incluir las propiedades epigenéticas al ensamblar un código de empalme más completo. Además, DeepCode permite predicciones sólidas a través de linajes celulares y conjuntos de datos. Especialmente, identificamos un supuesto evento de AS regulado por H3K36me3 que conduce a una desintegración de ARNm mediada sin sentido de BARD1. La expresión reducida de BARD1 da como resultado la atenuación de las actividades de señalización ATM / ATR y además la diferenciación de hESC. Estos resultados sugieren un mecanismo candidato novedoso que vincula las modificaciones de las histonas con la decisión del destino de hESC. Además, cuando se capacita en diferentes contextos, DeepCode se puede expandir a una variedad de campos biológicos y biomédicos.

© The Author (s) 2017. Publicado por Oxford University Press en nombre de Nucleic Acids Research.

Cifras

Vista esquemática de DeepCode. (…

Vista esquemática de DeepCode. ( A ) Se integran varios datos de alto rendimiento en ...

DeepCode mejora el rendimiento en ...

DeepCode mejora el rendimiento en la decodificación de patrones de empalme. ( A ) Características epigenómicas ...

DeepCode revela diferentes aspectos de ...

DeepCode revela diferentes aspectos de las contribuciones de las características genómicas (epi). ( A )…

Principales funciones importantes y DeepCode ...

Principales características importantes y ensamblaje de DeepCode. ( A ) Las actuaciones predictivas de ...

El DeepCode ensamblado muestra un alto ...

El DeepCode ensamblado muestra altas correlaciones con el código genético de empalme ensamblado previamente ...

DeepCode permite la predicción de ...

DeepCode permite la predicción de patrones de AS a través de linajes de desarrollo y conjuntos de datos. (…

BARD1 se empalma alternativamente en ...

BARD1 se empalma alternativamente tras la diferenciación de hESC y vincula H3K36me3 con el destino celular ...


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DISCUSIÓN

AS juega un papel crítico durante el desarrollo de tejidos y la diferenciación celular (2, 38). Estudios anteriores revelan varios mecanismos reguladores para AS, incluida la expresión y el direccionamiento de factores de empalme y el enriquecimiento de hPTM (38). En este estudio, buscamos investigar exhaustivamente las observaciones previas de la relación entre hPTM y AS durante el desarrollo de tejido mediante la integración de datos de ChIP-seq y RNA-seq de siete tejidos embrionarios de ratón diferentes en seis puntos de tiempo de desarrollo. Identificamos dos categorías diferentes de exones AS (omitidos): exones omitidos asociados con el desarrollo y exones omitidos asociados con la selección de isoformas. Los análisis ontológicos encontraron que los genes de estas dos categorías están enriquecidos en diferentes funciones. Los genes AS asociados con la categoría de ganancia / pérdida del desarrollo en el prosencéfalo tenían más probabilidades de estar enriquecidos en categorías funcionales relacionadas con las neuronas, como la proyección de neuronas, la densidad postsináptica y el citoesqueleto. Esto es consistente con el análisis de ontología genética anterior para exones empalmados diferencialmente en la corteza cerebral en desarrollo, que muestra que los genes del citoesqueleto están sobrerrepresentados en ratones y humanos (41). Por otro lado, los genes AS que pertenecen a la categoría alta / baja seleccionada por isoformas están sobrerrepresentados en distintas categorías ontológicas importantes para mantener la función celular o la identidad tisular, como el ciclo celular, el transporte de proteínas y la unión del ARN.

Los modelos computacionales construidos en base a la señal de ChIP-seq en las regiones flanqueantes de los exones omitidos mostraron que las hPTM se asociaron con ambas categorías de exones omitidos. De acuerdo con estudios previos, encontramos que H3K36me3 es más predictivo para grupos de exones omitidos (37, 41). Específicamente, el enriquecimiento de H3K36me3 en la región flanqueante del sitio de empalme 5 'aguas abajo y el sitio de empalme 3' aguas arriba del exón omitido fue el principal predictor en todos los tejidos. Este resultado también fue cierto cuando estratificamos los exones por nivel de expresión génica. Si bien las contribuciones de los hPTM variaron según la categoría de expresión génica, H3K36me3 fue consistentemente las principales características predictivas en todos los tejidos y puntos de tiempo (Figura 5, Figura complementaria S68-S71). Este resultado se ha informado anteriormente en otros sistemas. En primer lugar, un análisis computacional de exones omitidos basado en 3 líneas celulares humanas muestra que el enriquecimiento de H3K36me3 en el exón y aguas abajo del sitio de empalme 3 'se correlaciona significativamente con la inclusión del exón omitido (43). En segundo lugar, el análisis de los exones humanos y de C. elegans encuentra que H3K36me3 está altamente enriquecido en el extremo 5 'de los exones (47). Finalmente, nuestro análisis previo del núcleo accumbens de ratón revela que H3K36me3 tiene el mayor enriquecimiento en isoformas alternativas en relación con otras hPTM (48). Nuestro enfoque es una mejora con respecto a los enfoques anteriores basados ​​en la agrupación (49) al cuantificar las asociaciones globales entre las hPTM y el empalme de exones y sus contribuciones. Junto con nuestros hallazgos, estos informes anteriores indican un posible regulador por el cual el enriquecimiento de H3K36me3 contribuye a la selección de exones alternativos en AS.

Utilizando el modelo de bosque aleatorio iterativo, identificamos aún más interacciones entre varios hPTM que se asociaron con la selección de exones omitidos. La interacción entre H3K36me3 y H3K4me1 en las regiones flanqueantes del exón fue la característica principal tanto en la ganancia / pérdida del desarrollo como en el grupo alto / bajo seleccionado por isoformas. Otras interacciones, como H3K27me3 y H3K36me3, H3K27ac y H3K36me3, y H3K36me3 y H3K9me3, indicaron que los hPTM predictivos relativamente más débiles solo pueden ser funcionales cuando se combinan con los altamente predictivos. El concepto de interacción hPTM no es nuevo. Varios estudios han encontrado el efecto combinatorio de las modificaciones de histonas y su asociación con la transcripción y diferenciación de genes. Por ejemplo Han et al. descifra las relaciones de interacción de modificación de histonas en exones basándose en la red bayesiana (23). Curiosamente, encontramos muchas interacciones que ocurren entre las diferentes regiones flanqueantes de las mismas o diferentes modificaciones de histonas, como las interacciones entre H3K36me3 5 ′ aguas arriba y H3K36me3 3 ′ aguas arriba y entre H3K36me3 5 ′ aguas abajo y H3K4me1 3 ′ aguas arriba. Estos resultados sugirieron que las hPTM ubicadas en diferentes posiciones en la región flanqueante del exón pueden contribuir de manera diferente a la selección del exón omitido. Esto es consistente con el resultado de un estudio anterior que encuentra que las hPTM se correlacionan con la inclusión de exones omitidos a través de patrones específicos a lo largo de la región flanqueante de esos exones (25). En particular, H3K36me3 muestra una correlación significativa entre aguas arriba y aguas abajo de las regiones flanqueantes del exón para la tasa de inclusión del exón, lo que es consistente con nuestro hallazgo.

Además, observamos la aparición de algunas hPTM en varios exones omitidos encontrados en tejidos de desarrollo neuronal de un estudio anterior (38), lo que sugiere una posible conexión mecanicista entre esas modificaciones y el desarrollo de tejido impulsado por AS (Tabla complementaria S4). Análisis de secuencia de ARN de Zhang et al. muestra que el exón N está incluido en la corteza cerebral y el cerebelo, pero excluido de los tejidos no neurales. Esto es consistente con nuestro hallazgo de que el nivel de inclusión de FLNA exonN aumenta significativamente en el prosencéfalo durante el tiempo de desarrollo, pero no en el hígado, el corazón y las extremidades. Curiosamente, un estudio anterior encuentra que las mutaciones que interrumpen el sitio de unión de la proteína de unión del tracto de polipirimidina (PTBP1) del exonN de FLNA en las células progenitoras neurales provocan una malformación específica del cerebro en humanos, lo que sugiere el papel regulador potencial entre la inclusión de PTBP1 y el exónN (41). En este estudio, observamos que la señal de H3K36me3 en las regiones flanqueantes se correlacionó significativamente con la inclusión de exonN de FLNA en el prosencéfalo (Figura 7A, B), lo que sugiere un vínculo entre las modificaciones de histonas, los factores de empalme y la inclusión de exón (Figura 7C). Esta noción se ve reforzada por hallazgos previos de Luco et al., que H3K36me3 puede interactuar directamente con los componentes del espliceosoma para regular la expresión de exones alternativos en líneas celulares humanas (50). Finalmente, el análisis de enriquecimiento de motivos en las regiones flanqueantes de los exones de ganancia / pérdida del desarrollo identificó motivos que estaban sobrerrepresentados en los exones empalmados alternativamente entre diferentes tejidos, incluida PTBP1 en tejidos relacionados con el cerebro, lo que indica aún más el vínculo potencial entre hPTM y los motivos de empalme en regulación del exón empalmado alternativo (Figura complementaria S72).

Posible conexión mecanicista entre las modificaciones de histonas y el desarrollo de tejidos. (A) La vista del navegador del genoma muestra el enriquecimiento de H3K36me3 y la inclusión de exonN en el prosencéfalo, el corazón, el hígado y las extremidades. (B) El nivel de inclusión de exonN en el gen FLNA se correlacionó significativamente con el enriquecimiento de H3K36me3. (C) El esquema representa un mecanismo potencial por el cual H3K36me3 regula la inclusión de exonN. H3K36me3 puede reclutar factor de corte y empalme PTBP1, que reprimirá aún más la inclusión de exónN.

Posible conexión mecanicista entre las modificaciones de histonas y el desarrollo de tejidos. (A) La vista del navegador del genoma muestra el enriquecimiento de H3K36me3 y la inclusión de exonN en el prosencéfalo, el corazón, el hígado y las extremidades. (B) El nivel de inclusión de exonN en el gen FLNA se correlacionó significativamente con el enriquecimiento de H3K36me3. (C) El esquema representa un mecanismo potencial por el cual H3K36me3 regula la inclusión de exonN. H3K36me3 puede reclutar factor de corte y empalme PTBP1, que reprimirá aún más la inclusión de exónN.

En los últimos años, los modelos de aprendizaje profundo también se han aplicado para identificar factores epigenéticos asociados con el empalme alternativo y la expresión génica (51, 52). Los métodos de aprendizaje profundo son especialmente útiles con una gran cantidad de características y ejemplos, y las técnicas que utilizan perturbación o retropropagación (retroceso) (53) pueden ayudar en la interpretación del modelo. Los enfoques basados ​​en perturbaciones pueden capturar mejor el espacio de entradas que pueden cambiar una salida, pero son computacionalmente costosos, mientras que los métodos basados ​​en retropropagación son eficientes pero potencialmente más limitados en su capacidad para definir un conjunto completo de características relacionadas con una salida (53). En resumen, estos métodos son predictores poderosos, pero pueden no ser los métodos más adecuados cuando el objetivo es comprender por qué una entrada está vinculada con una salida. Aquí, teníamos relativamente pocas características, por lo que estudiamos el vínculo entre hPTM y el empalme con, regresión logística y modelos forestales aleatorios iterativos, que se alinearon con nuestros objetivos científicos. Los estudios futuros, en particular los que se centran principalmente en la creación de modelos predictivos a partir de características de nivel de secuencia sin procesar, podrían beneficiarse del aprendizaje profundo.

Aunque nuestro modelo identificó vínculos potenciales entre hPTM y empalme de exón, todavía tiene ciertas limitaciones. En primer lugar, sin la información de entrada, el recuento de lecturas de ChIP podría verse influido no solo por el enriquecimiento de hPTM en los datos de ChIP-seq, sino por otros factores como el contexto de GC y la accesibilidad de la cromatina de la región. Sin embargo, hay otros estudios que han señalado que corregir el efecto usando la entrada de ChIP-seq y la ocupación de nucleosomas tiene poca influencia en el resultado original y los principales hallazgos aún se mantienen (54). Además, en la actualidad, nos centramos en el enriquecimiento de hPTM en la región flanqueante del exón, que es el área con más probabilidades de ser relevante en un modelo de reclutamiento directo. Sin embargo, el enriquecimiento de hPTM más allá de los exones, en el promotor, de diferentes exones o en todo el gen, probablemente también contribuya al empalme. Los análisis adicionales incorporarán estas asociaciones distales, lo que requerirá parámetros adicionales para controlar el ruido y la incertidumbre introducidos en el modelo. En general, hemos realizado un análisis exhaustivo para investigar los eventos de empalme alternativo mediados por cromatina durante el desarrollo del tejido. Usando modelos computacionales, encontramos que las modificaciones de histonas específicas, H3K36me3 y H3K4me1, tienen las asociaciones más fuertes en la selección de exón omitido entre todos los tejidos y puntos de tiempo de desarrollo examinados. También identificamos interacciones de dos o más hPTM que predicen en gran medida la EA. Por ejemplo, la interacción entre H3K36me3 y H3K4me1 en la región flanqueante del exón fue la característica principal en ambas categorías de exones omitidos. Estos hallazgos aumentaron la complejidad de definir la regulación de AS, lo que informará más estudios experimentales sobre la relevancia funcional de estas modificaciones para el empalme alternativo.


RESULTADOS

Una variante de empalme de mUHRF1 muestra una localización subnuclear alterada y un reclutamiento de H3K9me3

Estudios anteriores informaron resultados contradictorios con respecto a los mecanismos de reclutamiento de UHRF1 a la cromatina y el requisito de diferentes dominios UHRF1 para la metilación de mantenimiento del ADN. Por ejemplo, aunque varios estudios muestran que se requieren dominios TTD y / o PHD funcionales para la unión de cromatina, la localización nuclear focal y la función de metilación de mantenimiento del ADN del UHRF1 humano y de ratón (7, 28, 30), todavía está en debate. qué ligando de cromatina está realmente involucrado en el reclutamiento de UHRF1: H3K9me2 / 3, TOP2A, LIG1 u otros (7, 8, 31, 58). Además, los resultados obtenidos de otros estudios sugieren que el dominio SRA y el ADN hemimetilado son los principales determinantes para la localización de la cromatina UHRF1 y la metilación de mantenimiento del ADN (12, 20, 59-61). Otro informe implicaba que la unión del ADN por el dominio SRA es importante para la localización de la cromatina, pero su capacidad para reconocer específicamente el ADN hemimetilado no lo es (22). Dos estudios recientes encontraron que no se requiere un TTD funcional para el mantenimiento de la metilación del ADN en ratones (61) o células cancerosas humanas (62). Estos resultados contradictorios podrían deberse en parte a que las proteínas UHRF1 murina (mUHRF1) y UHRF1 humana (hUHRF1) se consideran intercambiables y se están estudiando en varios sistemas celulares donde las especies no siempre coincidían (7, 12, 20, 28, 30, 31, 59). Descubrimos que, en el ratón, el corte y empalme alternativo del exón ocho da lugar a dos variantes diferentes de mUHRF1 que solo difieren en la región mLinker 2 entre los dominios del lector de modificación de histonas mTTD y mPHD. Según la nomenclatura del NCBI, nos referimos a mUHRF1 V1 como la variante que, hasta donde sabemos, ha sido utilizada por todos los estudios anteriores. mLinker 2 V1 tiene una inserción de nueve aminoácidos en su centro en comparación con la variante 2 (V2). mLinker 2 V2 es, por el contrario, muy similar a hLinker 2 (Figura 1A).

En ausencia de anticuerpos que pudieran distinguir las dos proteínas mUHRF1, analizamos los datos de ARN-seq de diferentes etapas de desarrollo del ratón, así como diferentes tejidos adultos (ratones de 8 semanas de edad) para determinar la expresión de cuatro especies de ARNm correspondientes a las dos variantes de proteínas. Ambas variantes se expresan como dos ARNm, cada uno de los cuales difiere en su 5'UTR (mUHRF1 V1: Uhrf1–201 y -204, mUHRF1 V2: Uhrf1–202 y 203).Encontramos que mUHRF1 V1 es la isoforma predominantemente expresada, tanto durante el desarrollo embrionario como en tejidos adultos (Figura complementaria S1). Como se esperaba de su papel en la metilación del ADN de mantenimiento, la expresión de mUHRF1 es más alta en tejidos con células que se dividen activa y rápidamente: el intestino, los compartimentos del sistema inmunológico (timo, médula ósea, bazo), así como las gónadas y los órganos reproductores (glándula mamaria, placenta). El estómago y el duodeno son los únicos órganos que muestran una mayor expresión de mUHRF1 V2 en comparación con V1. Las células terminalmente diferenciadas (cerebro, células musculares, riñón, hígado) muestran niveles de ARNm de bajos a indetectables para ambas variantes de mUHRF1. De manera consistente, todos los tejidos en desarrollo embrionario temprano (E11.5, E14) expresan altos niveles de mUHRF1, que disminuye con la maduración del embrión y sus órganos (E14, E14.5, E18) (Figura complementaria S1).

Debido a las diferencias observadas en los perfiles de expresión de las variantes de empalme de mUHRF1, razonamos que podrían tener distintas propiedades biológicas. Primero analizamos la localización subnuclear de las dos variantes de UHRF1 murino y la proteína humana, con la hipótesis de que esto podría revelar funcionalidades divergentes. Expresamos transitoriamente hUHRF1, mUHRF1 V1, V2 o LacI etiquetados con mCherry en diferentes líneas celulares humanas y murinas. Se examinó la co-localización de las proteínas etiquetadas con mCherry con regiones densas en DAPI y H3K9me3 en el núcleo de estas células mediante microscopía confocal y análisis posterior a través de gráficos de intensidad de Fiji (Figura 1B, Figura complementaria S2A). Para excluir los efectos de la expresión diferente en las variaciones observadas en la distribución subnuclear, verificamos concentraciones de proteínas comparables en el nivel de conjuntos de cultivo celular mediante transferencia Western (Figura complementaria S2B) y en células individuales mediante análisis de citometría de flujo (Figuras complementarias S3 y S4). Independientemente de las diferencias en la eficiencia de transfección y los niveles de expresión global de las tres proteínas en diferentes sistemas celulares, encontramos un patrón reproducible en todas las líneas celulares investigadas (Figura 1B, C). En el osteosarcoma U2OS humano, el cáncer de mama MCF7 humano, la glándula mamaria C127 de ratón y las células de fibroblastos NIH-3T3 de ratón, una fracción significativamente más pequeña mostró co-localización de mCherry-hUHRF1 (13%, 34%, 19% y 13%, respectivamente) y mCherry -mUHRF1 V2 (10%, 21%, 23% y 17%, respectivamente) con H3K9me3 en comparación con mCherry-mUHRF1 V1 (35%, 71%, 53% y 36%, respectivamente). Basándonos en estas observaciones, llegamos a la conclusión de que la asociación de cromatina de las dos proteínas UHRF1 murina y humana única es distinta.

Estudios anteriores sugirieron que los TTD y PHD conectados (módulo TTD-PHD) regulan la localización subnuclear y la actividad de ubiquitilación de UHRF1. Sin embargo, la importancia del dominio TTD en el direccionamiento de cromatina de UHRF1 todavía está en debate (7, 59, 61, 62). Dado que encontramos diferencias significativas en la localización subnuclear con respecto a H3K9me3, mutamos la jaula aromática en el dominio mTTD (mTTD *: Y184A / Y187A) y sobreexpresamos EGFP-mUHRF1 V1 y V2 WT y TTD * en células C127 y NIH-3T3 ( Figura 1D, Figura complementaria S5A). Utilizando microscopía confocal, analizamos la co-localización de EGFP con H3K9me3 y encontramos que la mutación del mTTD disminuyó la co-localización de mUHRF1 V1 con H3K9me3 al nivel de mUHRF1 V2 (Figura 1E, Figura complementaria S5B). mUHRF1 V2 TTD * mostró una co-localización incluso menor con H3K9me3 en ambas líneas celulares. Estos resultados indicaron que un dominio mTTD funcional es esencial para la localización subnuclear de mUHRF1.

El reconocimiento de H3K9me3 de las variantes de mUHRF1 depende del comportamiento distinto del mTTD

Para obtener más información sobre el mecanismo detrás de las diferencias funcionales entre mUHRF1 V1, V2 y hUHRF1, realizamos experimentos de extracción de histonas y péptidos utilizando lisados ​​celulares de células que expresan mCherry-mUHRF1 V1, V2 y -hUHRF1 (U2OS y MCF7). Comparamos la recuperación de proteínas UHRF1 en tres péptidos modificados de forma diferente correspondientes a los residuos 1-20 de la cola H3. Basándonos en otras (6, 7, 9, 61, 63-66) y nuestras (28) observaciones previas, racionalizamos que el péptido no modificado H3 recupera solo la interacción dependiente de PHD, H3K9me3 se une a TTD y PHD ya sea de forma independiente o bivalente con o sin sinergismo, y H3R2me2sK9me3 impide, pero no bloquea completamente, la unión de PHD, mientras que permite el reconocimiento de péptidos específicos de metilación dependiente de TTD. Encontramos hUHRF1 y mUHRF1 V1 preferentemente enriquecidos en el péptido H3K9me3. En contraste, mUHRF1 V2 mostró menor preferencia por este péptido sobre H3 sin modificar y H3R2me2sK9me3 (Figura 2A, B).

El reconocimiento de H3K9me3 depende de la disponibilidad del TTD. (A) Experimento de extracción de histona-péptido representativo utilizando extractos de mCherry-hUHRF1 o -mUHRF1 que expresan células U2OS y MCF7. El material recuperado en péptidos inmovilizados se analizó mediante transferencia Western. HP1β sirve como control para De buena fe Proteína de unión a H3K9me3. (B) Cuantificación de las señales de transferencia de western anti-mCherry correspondientes a los experimentos mostrados en (A) en relación con el péptido inmovilizado. Los datos se presentan como media y s.d. de dos (H3R2me2sK9me3) o tres (H3 sin modificar, H3K9me3) experimentos independientes. (C) Se analizaron series de titulación de diferentes péptidos H3 con proteínas UHRF1 recombinantes marcadas con fluorescencia mediante termoforesis a microescala. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (D) Las proteínas UHRF1 recombinantes se sometieron a ensayos de ubiquitina ligasa E3 utilizando mononucleosomas recombinantes no modificados o H3K9me3. Las reacciones se analizaron mediante transferencia Western (arriba). Las señales para UHRF1 y las proteínas histonas en la membrana de transferencia Western teñida se muestran para los controles de carga (parte inferior). Se indican las posiciones de ejecución de los marcadores de peso molecular (izquierda) y las diferentes proteínas identificadas (derecha). (mi) Cuantificación de señales de transferencia western anti-FLAG obtenidas para ensayos de ubiquitinación como se muestra en (D). Los valores absolutos se cuantificaron usando ImageJ y se normalizaron a la señal del nucleosoma H3unmod. Los datos se presentan como media y s.d. de cuatro (mUHRF1 V1, hUHRF1) y dos (mUHRF1 V2) experimentos independientes. Estudiantes t-Se realizó una prueba (no emparejada, de dos colas) para comparar muestras (**) PAG & lt 0.01, (***) PAG & lt 0,001.

El reconocimiento de H3K9me3 depende de la disponibilidad del TTD. (A) Experimento de extracción de histona-péptido representativo utilizando extractos de mCherry-hUHRF1 o -mUHRF1 que expresan células U2OS y MCF7. El material recuperado en péptidos inmovilizados se analizó mediante transferencia Western. HP1β sirve como control para De buena fe Proteína de unión a H3K9me3. (B) Cuantificación de las señales de transferencia de western anti-mCherry correspondientes a los experimentos mostrados en (A) en relación con el péptido inmovilizado. Los datos se presentan como media y s.d. de dos (H3R2me2sK9me3) o tres (H3 sin modificar, H3K9me3) experimentos independientes. (C) Se analizaron series de titulación de diferentes péptidos H3 con proteínas UHRF1 recombinantes marcadas con fluorescencia mediante termoforesis a microescala. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (D) Las proteínas UHRF1 recombinantes se sometieron a ensayos de ubiquitina ligasa E3 utilizando mononucleosomas recombinantes no modificados o H3K9me3. Las reacciones se analizaron mediante transferencia Western (arriba). Las señales para UHRF1 e histonas en la membrana de transferencia Western teñida se muestran para los controles de carga (parte inferior). Se indican las posiciones de ejecución de los marcadores de peso molecular (izquierda) y las diferentes proteínas identificadas (derecha). (mi) Cuantificación de señales de transferencia western anti-FLAG obtenidas para ensayos de ubiquitinación como se muestra en (D). Los valores absolutos se cuantificaron usando ImageJ y se normalizaron a la señal del nucleosoma H3unmod. Los datos se presentan como media y desviación estándar. de cuatro (mUHRF1 V1, hUHRF1) y dos (mUHRF1 V2) experimentos independientes. Estudiantes t-Se realizó una prueba (no emparejada, de dos colas) para comparar muestras (**) PAG & lt 0.01, (***) PAG & lt 0,001.

Anteriormente hemos demostrado que hUHRF1 existe en diferentes estados de unión a H3K9me3 en sistemas nativos (es decir, lisado celular) frente a sistemas recombinantes (28). Para evaluar si existen diferencias similares para las variantes murinas, comparamos el comportamiento de unión de péptidos de proteínas recombinantes en experimentos de termoforesis a microescala cuantitativa (MST). A diferencia de hUHRF1, las proteínas mUHRF1 V1 y V2 recombinantes mostraron un patrón de unión de péptidos similar en comparación con las proteínas celulares. El ratón V1 mostró una preferencia de unión significativa para H3K9me3 sobre la contraparte no modificada (Figura 2C), lo que sugiere el reconocimiento por parte del mTTD (consulte la Tabla complementaria S1 para obtener una lista de todos KD valores medidos en este estudio). Además, mostró una unión reducida 20 veces al péptido H3R2me2sK9me3, lo que indica que mUHRF1 V1 establece un modo de unión bivalente y sinérgico en el que los dominios mTTD y mPHD se acoplan con la diana. Por el contrario, mUHRF1 V2 no tenía preferencia de unión por el H3K9me3 sobre el péptido no modificado. También mostró una reducción mucho menor en la interacción con el H3R2me2sK9me3 en comparación con el péptido H3K9me3 (Figura 2C). Esto sugirió que los dominios mTTD y mPHD funcionan de forma independiente entre sí en mUHRF1 V2. En estos ensayos, hUHRF1 no mostró una preferencia significativa por la marca H3K9me3 sobre la afinidad no modificada y 10 veces más débil por el péptido doblemente modificado (H3R2me2sK9me3) en comparación con H3K9me3, lo que confirma un modo de unión dominado por hPHD.

Los distintos patrones de unión de las tres proteínas recombinantes se confirmaron en un sistema de ensayo independiente utilizando péptidos H3 fluorescentes marcados en los extremos N y C (polarización de fluorescencia, figura suplementaria de FP S6A). Además, comparamos la actividad de ligasa E3 de UHRF1 murino y humano en un in vitro ensayo de ubiquitilación utilizando sustratos nucleosomales que contienen K9me3 H3 sin modificar o. mUHRF1 V1 fue más activo en la ubiquitilación de H3 en el contexto de nucleosomas no modificados en comparación con V2 y hUHRF1 (Figura 2D). Esta actividad de V1 se mejoró aún más en los nucleosomas de H3K9me3, mientras que V2 y hUHRF1 no mostraron tal estimulación (Figura 2D, E). En general, nuestros resultados de los experimentos de unión con proteínas celulares y recombinantes, así como el ensayo de ubiquitilación, indican que, debido a los diferentes estados funcionales de los dominios TTD, las dos proteínas variantes mUHRF1 V1 y V2 difieren entre sí, así como de hUHRF1. con respecto a su reconocimiento H3K9me3.

Diferentes mecanismos moleculares determinan el estado funcional del TTD en UHRF1 murino y humano

En hUHRF1, una región polibásica (hPBR) de hLinker 4 regula el estado funcional de la hTTD bloqueando su surco de superficie de unión a péptidos (28, 67). La comparación de secuencias reveló la conservación de un parche básico en el PBR de proteínas UHRF1 humanas y murinas (Figura complementaria S6B). Comparamos la unión a H3K9me3 de los dominios mTTD y hTTD en ausencia y presencia de los correspondientes péptidos PBR. Los TTD aislados de ambas especies mostraron una unión similar al péptido H3K9me3 (Figura 3A, Figura complementaria S6C). Como se describió anteriormente, hPBR bloqueó la unión de hTTD a H3K9me3. Por el contrario, mPBR no tuvo ningún efecto sobre la interacción mTTD / H3K9me3 (Figura 3A, Figura complementaria S6D).

mTTD no está regulado por mLinker 4 / mPBR. (A) Las series de titulación de mTTD recombinante y hTTD con un péptido FAM-H3 (1-15) K9me3 con y sin exceso molar doble de oligopéptidos correspondientes a mPBR o hPBR se analizaron mediante polarización de fluorescencia. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (B) Se inmovilizaron proteínas recombinantes mPBR-RING y hPBR-RING en perlas magnéticas y se incubaron con mTTD-PHD V1, V2 o hTTD-PHD. La entrada de proteínas y el material recuperado se analizaron mediante transferencia Western. Se indican las posiciones de ejecución de los marcadores de peso molecular (izquierda) y las diferentes proteínas identificadas (derecha). (C) La serie de titulación de PI5P con mLinker 4 recombinante marcado con fluorescencia o hLinker 4 se analizó mediante termoforesis a microescala. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (D) Constantes de disociación (KD) para la unión del péptido H3K9me3 en ausencia y presencia de un exceso molar de 100 veces de PI5P 16: 0 sobre las proteínas UHRF1 murinas y humanas recombinantes, según se determina mediante termoforesis a microescala. Los resultados representan promedios de como mínimo tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d.

mTTD no está regulado por mLinker 4 / mPBR. (A) Las series de titulación de mTTD y hTTD recombinantes con un péptido FAM-H3 (1-15) K9me3 con y sin exceso molar doble de oligopéptidos correspondientes a mPBR o hPBR se analizaron mediante polarización de fluorescencia. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (B) Se inmovilizaron proteínas recombinantes mPBR-RING y hPBR-RING en perlas magnéticas y se incubaron con mTTD-PHD V1, V2 o hTTD-PHD. La entrada de proteínas y el material recuperado se analizaron mediante transferencia Western. Se indican las posiciones de ejecución de los marcadores de peso molecular (izquierda) y las diferentes proteínas identificadas (derecha). (C) La serie de titulación de PI5P con mLinker 4 recombinante marcado con fluorescencia o hLinker 4 se analizó mediante termoforesis a microescala. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (D) Constantes de disociación (KD) para la unión del péptido H3K9me3 en ausencia y presencia de un exceso molar de 100 veces de PI5P 16: 0 sobre las proteínas UHRF1 murinas y humanas recombinantes según se determina mediante termoforesis a microescala. Los resultados representan promedios de como mínimo tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d.

Para evaluar la interacción directa entre los TTD-PHD y las regiones C-terminales de las diferentes proteínas UHRF1, realizamos experimentos de inmunoprecipitación. Encontramos que, independientemente de las similitudes de secuencia, la fuerte interacción de PBR-RING con TTD-PHD solo está presente en hUHRF1 pero no en mUHRF1 V1 y V2 (Figura 3B). Estos resultados son consistentes con el residuo de R649 humano, que se ha demostrado que ocupa el bolsillo R en el surco de la superficie de hTTD (67), no conservándose en la secuencia de mPBR (Figura complementaria S6B).

Hemos demostrado antes que el fosfatidilinositol 5-fosfato (PI5P) desbloquea la hTTD al interactuar con la hPBR. Esto permite el reconocimiento de H3K9me3 de hUHRF1 (28). Para probar si existe un mecanismo regulador similar en mUHRF1 V1 y V2, medimos la unión de PI5P al Linker 4 que contiene PBR de las diferentes proteínas usando MST. hLinker 4 enlazó PI5P con un KD de 1,4 μM (Figura 3C). La adición de PI5P mejoró significativamente la unión de H3K9me3 de hUHRF1, lo que indica el desbloqueo del hTTD concomitante con el sinergismo del módulo hTTD-PHD (Figura 3D). En comparación con la proteína humana, mLinker 4 mostró solo una afinidad débil por PI5P (KD & gt 80 μM, Figura 3C). Además, el fosfolípido no tuvo ningún efecto sobre el reconocimiento de la marca H3K9me3 por mUHRF1 V1 y V2 (Figura 3D). Además, y en contraste con hUHRF1 (22, 60), encontramos que la unión del péptido H3 de mUHRF1 no (V1) o solo levemente (V2) se ve afectada por el ADN hemimetilado (datos no mostrados). Sobre la base de estos hallazgos, concluimos que el reconocimiento de la marca H3K9me3 impulsado por TTD en las variantes de mUHRF1 se establece de manera diferente en comparación con hUHRF1.

El empalme alternativo de mLinker 2 bloquea la unión de mTTD H3K9me3 en mUHRF1 V1

Debido a que las dos variantes de mUHRF1 solo difieren entre sí en la inserción de nueve aminoácidos en mLinker 2 (Figura 1A), esta debe ser la causa de su diferente comportamiento de unión de la cola H3. Para determinar el impacto de mLinker 2 en la interacción de mTTD y mPHD con péptidos H3, establecimos mediciones cuantitativas de FP usando péptidos H3 sin modificar / K9-trimetilados con fluoróforo C o N terminal (FAM). Mientras que un péptido H3 marcado en el extremo C (H3unmod / K9me3-FAM) permite la unión tanto del PHD como del TTD (según el estado de trimetilación de K9), un péptido H3K9me3 marcado en el extremo N (FAM-H3K9me3) permite la monitorización Unión dependiente de TTD independiente de una contribución del PHD (7, 28). Dado que mLinker 4 no participa en la regulación del estado funcional del mTTD, nos centramos en el módulo mTTD-PHD aislado para investigar los diferentes comportamientos de unión a H3K9me3 de mUHRF1 V1 y V2. Como era de esperar, mTTD-PHD V1 se unió a los péptidos marcados en el extremo C con preferencia por H3K9me3 sobre los no modificados (KDsa 4,9 y 14,3 μM, respectivamente). Por el contrario, mTTD-PHD V2 se unió a ambos péptidos marcados en el extremo C con una afinidad similar (Figura 4A). Mientras que mTTD-PHD V2 y hTTD-PHD interactuaron con el péptido FAM-H3K9me3 marcado con N-terminal con una fuerza similar (KDs a 12,3 y 16,2 μM, respectivamente), mTTD-PHD V1 mostró solo una unión muy débil (KD & gt 300 μM, Figura 4B). Aparentemente, la inserción en mLinker 2 V1 es suficiente para bloquear la unión aislada de H3K9me3 dependiente de mTTD / independiente de mPHD.

El empalme alternativo de mLinker 2 bloquea la unión de mTTD H3K9me3 en mUHRF1 V1. (A) La serie de titulación de los péptidos recombinantes mTTD-PHD V1 (izquierda) y mTTD-PHD V2 (derecha) con péptidos H3 (1-15) sin modificar-FAM o H3 (1-15) K9me3-FAM se analizaron mediante polarización de fluorescencia. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (B) Experimentos de unión de polarización de fluorescencia como en (A) de las proteínas recombinantes indicadas con péptido FAM-H3 (1-15) K9me3. (C) Experimentos de unión de polarización de fluorescencia como en (A) de mTTD-PHD V1 TTD * con péptidos H3 (1-15) sin modificar-FAM, H3 (1-15) K9me3-FAM o FAM-H3 (1-15) K9me3.

El empalme alternativo de mLinker 2 bloquea la unión de mTTD H3K9me3 en mUHRF1 V1. (A) La serie de titulación de los péptidos recombinantes mTTD-PHD V1 (izquierda) y mTTD-PHD V2 (derecha) con péptidos H3 (1-15) sin modificar-FAM o H3 (1-15) K9me3-FAM se analizaron mediante polarización de fluorescencia. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (B) Experimentos de unión de polarización de fluorescencia como en (A) de las proteínas recombinantes indicadas con péptido FAM-H3 (1-15) K9me3. (C) Experimentos de unión de polarización de fluorescencia como en (A) de mTTD-PHD V1 TTD * con péptidos H3 (1-15) sin modificar-FAM, H3 (1-15) K9me3-FAM o FAM-H3 (1-15) K9me3.

Para probar esto aún más, introdujimos la inserción de nueve aminoácidos de mLinker 2 V1 en el módulo hTTD-PHD (hTTD-PHD, mLinker2 V1 *). En comparación con la hTTD-PHD de tipo salvaje, la proteína híbrida mostró una disminución sustancial en la unión del péptido FAM-H3K9me3 (KD & gt 100 μM, Figura 4B). Por el contrario, la interacción con péptidos H3 marcados en el extremo C no se vio afectada (Figura complementaria S7A, B).

Para verificar que el mTTD funcional está implicado en la unión del péptido mTTD-PHD V1 observado, analizamos un mutante de su jaula aromática (Y184A / Y187A). Como se esperaba, mTTD-PHD V1 TTD * no pudo mostrar una unión más fuerte con H3K9me3-FAM sobre H3unmod-FAM.Además, la baja interacción con el péptido FAM-H3K9me3 que no puede unirse al mPHD se perdió por completo (Figura 4C). En conjunto, estos hallazgos sugirieron que la inserción de mLinker 2 en mUHRF1 V1 está bloqueando el reconocimiento independiente de mPHD del péptido H3K9me3 por parte de mTTD pero al mismo tiempo estableciendo un estado conformacional del módulo mTTD-PHD que permite la unión sinérgica al péptido H3K9me3 .

Los módulos mTTD-PHD V1 y V2 exhiben diferentes disposiciones de dominio y comportamientos dinámicos

Para obtener más información sobre los diferentes arreglos conformacionales de los módulos mTTD-PHD V1 y V2 inferidos de in vitro experimentos de unión, nos propusimos realizar estudios estructurales utilizando dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) y espectroscopía de RMN. Anteriormente observamos que el módulo hTTD-PHD aislado tiene un movimiento dinámico intrínseco mediado por el hLinker 2 flexible y su interacción transitoria con el surco de la superficie hTTD y el bolsillo R (68). Dependiendo de la captura del residuo R296 de hLinker 2 en el bolsillo R, se ha observado un modo de unión del péptido H3 sinérgico (R296 unido al bolsillo R) o independiente (libre de R296) (7, 65, 68) .

Teniendo en cuenta las principales diferencias en la secuencia y la longitud del Linker 2 en las diferentes proteínas UHRF1 murinas y humanas, nos planteamos si esto da lugar a diferentes propiedades estructurales y dinámicas de sus respectivos módulos TTD-PHD. Realizamos análisis SAXS de mTTD-PHD V1 y V2 (Figura complementaria S7C, D, Tabla S2), y comparamos sus perfiles de dispersión con los de hTTD-PHD (68). Empleamos un enfoque de conjunto donde las curvas SAXS se ajustaron contra estructuras derivadas de modelos moleculares para determinar un subconjunto de conformaciones TTD-PHD que eran consistentes con los datos experimentales. Se generaron varios miles de conformadores de los módulos utilizando simulaciones de dinámica molecular y modelado de cuerpos rígidos para aproximar su espacio de conformación disponible. A continuación, se utilizó el método SES (55) para encontrar el conjunto "óptimo" de confórmeros que fueran consistentes con los perfiles de dispersión. En el caso de mTTD-PHD V1, el conjunto óptimo consistió completamente en conformaciones compactas, donde mLinker 2 está supuestamente unido a la ranura de la superficie de mTTD (Figura 5A). Para mTTD-PHD V2 y hTTD-PHD, en cambio, sus respectivos conjuntos óptimos dieron lugar a bimodal Rgramo distribuciones, con evidencia de conformaciones compactas y extendidas en las que el enlazador se coloca fuera de la ranura mTTD.

Análisis estructural de módulos mTTD-PHD V1 y V2. (A) Distribución de Rgramo determinado por modelado molecular en combinación con perfiles SAXS de mTTD-PHD V1 (izquierda), mTTD-PHD V2 (centro) y hTTD-PHD (derecha). La línea discontinua indica el conjunto inicial de estructuras derivadas del modelado molecular. La línea sólida indica los conjuntos ajustados por SAXS de confórmeros TTD-PHD. (B) Superposición de espectros HSQC (1 H– 15 N) (centro de zoom) de mTTD-Linker 2 V1 (rojo) y V2 (verde). Se asignaron resonancias para la proteína V1 (85% completa y depositada en el BMRB (ID 30704)). En la Figura complementaria S8B se presenta una superposición espectral completa. (C) Comparación de los cambios químicos de las amidas en los espectros HSQC (1 H– 15 N) de mTTD-Linker 2 V1 y mTTD-Linker 2 V2. Las resonancias superpuestas (de color azul) se asignan a la estructura mTTD-Linker 2 V1. Estos están localizados fuera de la interfaz de ranura del enlazador y TTDnorte–TTDC unión. (D) Conjuntos estructurales de RMN de mTTD-Linker 2 V1 (izquierda, PDBID: 6VEE) y hTTD-Linker 2 (derecha, PDBID: 6VED) que muestran la posición relativa de las regiones del Linker 2 con respecto al TTD. (mi) Estructura derivada de RMN de mTTD-Linker 2 V1 con representación de la superficie de mTTD en gris y mLinker 2 V1 en verde. El R298 (magenta - representación de barra) de mLinker 2 V1 está anclado al bolsillo R (cian). El parche P (es decir, P293, P294 y P295) está coloreado en rojo. mLinker 2 V2 (rosa) está cambiando con respecto a la superficie de mTTD. Se muestra una representación instantánea derivada del modelado molecular, con R293 (representación de barra naranja) sobre el bolsillo R. (F) Estructura de RMN de la interacción entre mLinker 2 V1 (verde, residuos marcados en negro) y mTTD (gris, residuos marcados en azul). La representación de la superficie con residuos hidrófobos (cian) y ácidos (rosa) que forman el bolsillo R ocupado por R298 resaltado se muestra a la izquierda. Enlaces de hidrógeno (líneas negras discontinuas) que estabilizan la interacción mLinker 2 V1-mTTD (aguas arriba del parche P: NA288–ON134, NY136–OL286, NQ292–OS289 y aguas abajo del parche P: NH2R298–OD1D138, NH2R298–OD2D138, NR298–OE2E149, NH1R298–OW147, NT300–OE2E186) se muestran en representaciones de palos en el centro y la derecha. (GRAMO) (1 H– 15 N) Titulaciones HSQC de mTTD-Linker 2 V1 (izquierda) y V2 (derecha) con 4-bencilpiperidina-1-carboximidamida (BPC) sin marcar en varias proporciones molares.

Análisis estructural de módulos mTTD-PHD V1 y V2. (A) Distribución de Rgramo determinado por modelado molecular en combinación con perfiles SAXS de mTTD-PHD V1 (izquierda), mTTD-PHD V2 (centro) y hTTD-PHD (derecha). La línea discontinua indica el conjunto inicial de estructuras derivadas del modelado molecular. La línea sólida indica los conjuntos ajustados por SAXS de confórmeros TTD-PHD. (B) Superposición de espectros HSQC (1 H– 15 N) (centro de zoom) de mTTD-Linker 2 V1 (rojo) y V2 (verde). Se asignaron resonancias para la proteína V1 (85% completa y depositada en el BMRB (ID 30704)). En la Figura complementaria S8B se presenta una superposición espectral completa. (C) Comparación de los cambios químicos de amida en los espectros HSQC (1 H– 15 N) de mTTD-Linker 2 V1 y mTTD-Linker 2 V2. Las resonancias superpuestas (de color azul) se asignan a la estructura mTTD-Linker 2 V1. Estos están localizados fuera de la interfaz de ranura del enlazador y TTDnorte–TTDC unión. (D) Conjuntos estructurales de RMN de mTTD-Linker 2 V1 (izquierda, PDBID: 6VEE) y hTTD-Linker 2 (derecha, PDBID: 6VED) que muestran la posición relativa de las regiones del Linker 2 con respecto al TTD. (mi) Estructura derivada de RMN de mTTD-Linker 2 V1 con representación de la superficie de mTTD en gris y mLinker 2 V1 en verde. El R298 (magenta - representación de barra) de mLinker 2 V1 está anclado al bolsillo R (cian). El parche P (es decir, P293, P294 y P295) está coloreado en rojo. mLinker 2 V2 (rosa) está cambiando con respecto a la superficie de mTTD. Se muestra una representación instantánea derivada del modelado molecular, con R293 (representación de barra naranja) sobre el bolsillo R. (F) Estructura de RMN de la interacción entre mLinker 2 V1 (verde, residuos marcados en negro) y mTTD (gris, residuos marcados en azul). La representación de la superficie con residuos hidrófobos (cian) y ácidos (rosa) que forman el bolsillo R ocupado por R298 resaltado se muestra a la izquierda. Enlaces de hidrógeno (líneas negras discontinuas) que estabilizan la interacción mLinker 2 V1-mTTD (aguas arriba del parche P: NA288–ON134, NY136–OL286, NQ292–OS289 y aguas abajo del parche P: NH2R298–OD1D138, NH2R298–OD2D138, NR298–OE2E149, NH1R298–OW147, NT300–OE2E186) se muestran en representaciones de palos en el centro y la derecha. (GRAMO) (1 H– 15 N) Titulaciones HSQC de mTTD-Linker 2 V1 (izquierda) y V2 (derecha) con 4-bencilpiperidina-1-carboximidamida (BPC) sin marcar en varias proporciones molares.

(1 H– 15 N) Los espectros de RMN TROSY de mTTD-PHD V1 y V2 marcados con 15 N mostraron diferencias considerables en las posiciones generales de los picos (Figura complementaria S8A). Los diferentes espectros de TROSY no pudieron atribuirse a efectos estructurales locales resultantes de la inserción en mLinker 2 V1 pero indicaron que existen diferencias globales en las conformaciones de mTTD-PHD V1 y V2. El gran tamaño de los módulos mTTD-PHD y su propensión a la agregación a las concentraciones necesarias para los experimentos de RMN (∼200 μM) dieron como resultado una calidad espectral relativamente pobre y no fueron adecuados para asignaciones de resonancia completa. Para ayudar a racionalizar los espectros de mTTD-PHD, preparamos 15 mTTD-Linker 2 marcado con N de V1 y V2 (Figura 5B, Figura complementaria S8B, C), así como mPHD (Figura complementaria S8D, E), que asignamos por completo . Al comparar los espectros de mTTD-PHD, mTTD-Linker 2 y mPHD (Figura complementaria S8D, E, G, H) se observaron dos tendencias: (i) los perfiles de pico de mPHD cambiaron poco en mTTD-PHD versus mPHD y (ii) mTTD- Los perfiles de los picos del vinculador 2 cambiaron poco en el contexto de mTTD-PHD versus mTTD-Linker 2. Estas observaciones indicaron que mPHD no interactúa con el mTTD o mLinker 2 en los módulos mTTD-PHD y que la interacción del Linker 2 con el mTTD se conserva en tanto el contexto mTTD-Linker 2 como mTTD-PHD. Observamos una tendencia similar al comparar los espectros de hTTD-Linker 2, hPHD y hTTD-PHD (para los cuales se determinaron previamente las asignaciones de la columna vertebral (68)) (Figura complementaria S8I). La comparación de espectros HSQC 1 H– 15 N de mTTD-Linker 2 V1 y V2 mostró diferencias significativas con & lt50% de los picos en posiciones superpuestas (Figura 5B, Figura complementaria S8B, C). Las resonancias que se superponen se localizan exclusivamente fuera de la interfaz del enlazador-surco y TTDnorte–TTDC empalme (Figura 5C). Una vez más, esto indicó que mLinker 2 V1 y V2 exhiben diferentes modos de interacción con el mTTD que conducen a diferentes propiedades estructurales y dinámicas de los respectivos módulos mTTD-PHD.

Pudimos asignar completamente la columna vertebral y las resonancias de la cadena lateral de mTTD-Linker 2 V1 y determinar su estructura de estado de solución (PDBID: 6VEE, Figura 5D-F, Figura complementaria S8L, Tabla S3). La estructura de mTTD es muy similar a las estructuras cristalinas y derivadas de RMN descritas anteriormente de hTTD ((6) PDBID: 2L3R). Se conservan los residuos aromáticos clave que forman la jaula de unión a K9me3, así como el bolsillo R ácido profundo que se encuentra en el surco de la superficie en la unión de los dos dominios tudor (Figura 5F). Curiosamente, observamos varios NOE de largo alcance en los espectros NOESY entre las resonancias mLinker 2 V1 y mTTD (Figura complementaria S8J, K). El conjunto estructural resultante muestra una interacción bien definida entre mLinker 2 V1 y el mTTD específicamente, R298 se coloca en el bolsillo R (Figura 5D-F). Debido a problemas de agregación, no pudimos asignar completamente las resonancias de mTTD-Linker 2 V2 y determinar su estructura. Sin embargo, como un punto de comparación adicional, asignamos completamente hTTD-Linker 2 y calculamos su estructura de solución (PDBID: 6VED, panel derecho de la Figura 5D, Figura complementaria S8L, Tabla S3). En contraste con mTTD-Linker 2 V1, observamos muy pocos NOE de largo alcance entre hLinker 2 y hTTD (Figura complementaria S8J). El conjunto estructural mostró un hLinker 2 deshilachado y desordenado en relación con el surco de la superficie de hTTD, en consonancia con estudios anteriores de hTTD-PHD (68).

Para confirmar aún más la dinámica diferencial de Linker 2 en mUHRF1 V1 y V2, realizamos titulaciones HSQC de proteínas mTTD-Linker 2 con 4-bencilpiperidina-1-carboximidamida (BPC). Se identificó BPC en una selección de compuesto hUHRF1 y se encontró que interactúa con el bolsillo R (68). Los datos de titulación indicaron claramente diferentes niveles de interacciones de surco de superficie de mTTD-Linker 2 para V1 y V2. Las resonancias de mTTD-Linker 2 V1 no mostraron perturbaciones de desplazamiento químico (CSP) tras la adición de BPC, lo que confirma que R298 adopta una posición estable en el bolsillo R que evita la unión del compuesto (Figura 5G). Por el contrario, se observaron CSP debido a la unión de BPC a mTTD-Linker 2 V2, lo que implica que hay una población de conformaciones donde están expuestos su surco de superficie y su bolsillo R.

Los PHD en UHRF1 de ratón y humano adoptan estructuras muy similares. Determinamos la estructura de la solución de mPHD (PDBID: 6VFO, Figura complementaria S8F, Tabla S3) y la comparamos con la estructura derivada de NMR previamente reportada de apo-hPHD (64). Tanto los PHD de ratón como los humanos se caracterizan por una región de unión de histona C-terminal canónica compacta que coordina dos iones de zinc (Figura complementaria S8F). La RMSD de la columna vertebral para hPHD y mPHD sobre esta región es ∼1,3 Å. Los PHD en ambos organismos también tienen una región de bucle N-terminal flexible, llamada "pre-PHD", que parece no esencial para la unión de histonas, y que coordina un tercer ion zinc (Figura complementaria S8F).

Concluyendo nuestro análisis estructural, hemos demostrado que el R298 de mLinker 2 V1 se une fuertemente al bolsillo R de mTTD. Además, la estructura de mTTD-Linker 2 V1 mostró que las tres prolinas (parche P: P293, P294 y P295) de la inserción del mLinker 2 forman una torcedura que hace contactos adicionales con la ranura de la superficie de mTTD (Figura 5E, F). En contraste, mLinker 2 V2 solo interactúa transitoriamente con el surco de la superficie mTTD, lo que resulta en una libertad conformacional mucho mayor de su módulo mTTD-PHD. Al igual que con R296 en hUHRF1, el R293 correspondiente de mLinker 2 no ocupa de forma estable el bolsillo R (Figura 5E).

El parche P y el R298 en mLinker 2 V1 son esenciales para bloquear la unión de H3K9me3 dependiente de TTD

Determinamos previamente que la unión de H3 a la hTTD de forma aislada es de naturaleza compuesta con (i) la unión de la jaula aromática de hTTD a K9me3 y (ii) la unión de la ranura superficial / cavidad R de la hTTD a K4 (6). Si el bolsillo R está bloqueado u ocupado, la interacción de hTTD con el péptido H3K9me3 se atenúa significativamente (6, 28). Para confirmar que el comportamiento dinámico de mLinker 2 V1 y V2 es responsable del comportamiento diferencial de unión de mTTD H3, realizamos un análisis de RMN. La titulación de mTTD-Linker 2 V1 con un péptido H3K9me3 no mostró CSP significativas (Figura 6A). Esto estaba de acuerdo con la estrecha asociación de mLinker 2 V1 con la ranura de la superficie de mTTD y el posicionamiento estable de R298 en el bolsillo R bloqueando así el acceso de H3K4 y eliminando el potencial de interacción compuesta (Figura 6B). Sin embargo, se observaron CSP prominentes cuando se tituló mTTD-Linker 2 V2 con el péptido H3K9me3 (Figura 6A). Los resultados confirmaron además que en este contexto el bolsillo R de mTTD es transitoriamente accesible para la unión del péptido compuesto.

mLinker 2 V1 bloquea la ranura de la superficie y la cavidad R de mTTD. (A) (1 H– 15 N) Titulaciones HSQC de mTTD-Linker 2 V1 (izquierda) y V2 (derecha) adquiridas en presencia de péptido H3 (1–15) K9me3 sin marcar en diferentes proporciones molares. (B) Estructura derivada de RMN de mTTD-Linker 2 V1 con representación de la superficie de mTTD en gris y mLinker 2 V1 en verde. El parche P (es decir, P293, P294 y P295) de mLinker 2 V1 está coloreado en rojo. El bolsillo R (cian) está ocupado por R298 (magenta - representación de barra). El modelo muestra el posicionamiento putativo de la cola de H3K9me3 (amarillo) en la superficie del mTTD, como se deriva del análisis del complejo hTTD / H3K9me3 ((6) PDBID: 2L3R). El residuo K9me3 de la cola H3 ocuparía la jaula aromática y el H3K4 el bolsillo R. Sin embargo, debido a que el R298 de mLinker 2 V1 (verde) está unido de manera estable al bolsillo R y el surco de la superficie está ocupado, la unión de H3K9me3 por el mTTD aislado se bloquea en mUHRF1 V1. (C) Serie de titulación de proteínas mutantes recombinantes mTTD-PHD V1 WT y R298A (R298 *), P293A / P294A / P295A (parche P *) y K302A / S303A (K302 / S303 *) con un FAM-H3 (1-15 ) El péptido K9me3 se analizó mediante polarización de fluorescencia. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (D) Experimentos de unión de polarización de fluorescencia como en (C) pero usando recombinante mUHRF1 V1 WT, R298 *, P-patch *, K302 / S303 * o P293A / P294A / P295A / L297A / R298A (P-patch / R *), R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (RS *), P293A / P294A / P295A / R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (P-patch / RS *) y P293A / P294A / P295A / L297 Proteínas N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (mLinker 2 V1 *).

mLinker 2 V1 bloquea la ranura de la superficie y la cavidad R de mTTD. (A) (1 H– 15 N) Titulaciones HSQC de mTTD-Linker 2 V1 (izquierda) y V2 (derecha) adquiridas en presencia de péptido H3 (1–15) K9me3 sin marcar en diferentes proporciones molares. (B) Estructura derivada de RMN de mTTD-Linker 2 V1 con representación de la superficie de mTTD en gris y mLinker 2 V1 en verde. El parche P (es decir, P293, P294 y P295) de mLinker 2 V1 está coloreado en rojo. El bolsillo R (cian) está ocupado por R298 (magenta - representación de barra). El modelo muestra el posicionamiento putativo de la cola de H3K9me3 (amarillo) en la superficie del mTTD, como se deriva del análisis del complejo hTTD / H3K9me3 ((6) PDBID: 2L3R). El residuo K9me3 de la cola H3 ocuparía la jaula aromática y el H3K4 el bolsillo R. Sin embargo, debido a que el R298 de mLinker 2 V1 (verde) está unido de manera estable al bolsillo R y la ranura de la superficie está ocupada, la unión de H3K9me3 por el mTTD aislado se bloquea en mUHRF1 V1. (C) Serie de titulación de proteínas mutantes recombinantes mTTD-PHD V1 WT y R298A (R298 *), P293A / P294A / P295A (parche P *) y K302A / S303A (K302 / S303 *) con un FAM-H3 (1-15 ) El péptido K9me3 se analizó mediante polarización de fluorescencia. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (D) Experimentos de unión de polarización de fluorescencia como en (C) pero usando recombinante mUHRF1 V1 WT, R298 *, P-patch *, K302 / S303 * o P293A / P294A / P295A / L297A / R298A (P-patch / R *), R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (RS *), P293A / P294A / P295A / R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (parche P / RS *) y P293A / P294A / P295A / L297 Proteínas N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (mLinker 2 V1 *).

Como se predijo a partir de los estudios estructurales, la mutación de R298 (R298 *: R298A) y el parche P (parche P *: P293A / P294A / P295A) resultó en una ganancia significativa de unión de mTTD-PHD V1 al péptido FAM-H3K9me3 en comparación con la proteína de tipo salvaje medida por FP (Figura 6C) y sugiriendo una mayor accesibilidad del surco / bolsillo R de la superficie de unión al péptido mTTD. Por el contrario, la mutación de los residuos adyacentes K302 / S303 (K302 / S303 *: K302A / S303A) que se conservan en el enlazador 2 de mUHRF1 V1, V2 y hUHRF1 (Figura 1A) no tuvo ningún efecto. Al probar las mismas mutaciones en el contexto de mUHRF1 V1 de longitud completa, estos efectos fueron mucho menos pronunciados (Figura 6D). Sin embargo, las mutaciones de residuos adicionales en mUHRF1 V1 Linker 2 permitieron la unión de FAM-H3K9me3. Esto se logró no solo por la mutación de la inserción completa (mLinker 2 V1 *: P293A / P294A / P295A / L297A / R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A) sino también por algunos cambios menos severos, como RS * ( R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A), parche P / R * (P293A / P294A / P295A / L297A / R298A) y parche P / RS * (P293A / P294A / P295A / R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A) (Figura 6D). De estas observaciones deducimos que el parche P y el R298 son necesarios aunque no suficientes para colocar de manera estable el mLinker 2 en la superficie del mTTD y para bloquear la unión de H3K9me3.

La inserción de Linker 2 facilita el reconocimiento sinérgico de H3K9me3 por parte del módulo mTTD-PHD

Para determinar si la asociación estable de mLinker 2 V1 con el mTTD de hecho impulsa el modo de unión del péptido H3K9me3 sinérgico, medimos la interacción de los péptidos H3 no modificados y H3K9me3 marcados con FAM en el extremo C con mUHRF1 de longitud completa V1, V2 y V1 Linker 2 mutantes. Predijimos que la mutación de la inserción de Linker 2 que la desplaza de la superficie del mTTD aboliría la especificidad de unión a H3K9me3 de mUHRF1 V1. De hecho, las mutaciones R298 *, P-patch / R * y R-S * mostraron una unión más débil al péptido H3K9me3-FAM en comparación con la proteína WT. Al mismo tiempo, la interacción con el péptido H3unmod-FAM no se vio afectada (Figura 7A). Congruente con la unión reducida a la cola K9me3 H3, la actividad de ubiquitilación de las proteínas mutantes mUHRF1 V1 también disminuyó hasta el nivel de mUHRF1 V2 (Figura 7B). Los resultados apoyaron la idea de que la inserción en mLinker 2 V1 dirige la sinergia entre mTTD y mPHD. La interrupción de la asociación mTTD-Linker 2 desacopla la mTTD de la mPHD, lo que da como resultado modos independientes de reconocimiento de péptidos (como se ve en mUHRF1 V2).

La inserción de mLinker 2 V1 facilita el reconocimiento sinérgico de H3K9me3 por parte del módulo mTTD-PHD V1. (A) Serie de titulación de mUHRF1 V1 WT recombinante, R298A (R298 *), P293A / P294A / P295A (parche P *), P293A / P294A / P295A / L297A / R298A (parche P / R *), R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (RS *) y mUHRF1 V2 WT con péptidos H3 sin modificar (izquierda) y H3K9me3-FAM (derecha) se analizaron mediante termoforesis a microescala. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (B) Las proteínas recombinantes de (A) se sometieron a ensayos de ubiquitina ligasa E3 usando mononucleosomas H3K9me3 recombinantes. Las reacciones se analizaron mediante transferencia Western (arriba). Las señales para UHRF1 e histonas en la membrana de transferencia Western teñida se muestran para los controles de carga (parte inferior). Se indican las posiciones de ejecución de los marcadores de peso molecular (izquierda) y las diferentes proteínas identificadas (derecha). (C) Imágenes confocales representativas de células NIH-3T3 murinas que expresan diferentes proteínas mutantes y mUHRF1 V1 y V2 WT etiquetadas con EGFP (EGFP, canal verde). Se realizó una tinción de inmunofluorescencia para H3K9me3 (canal rojo). La tinción DAPI marca el ADN (canal azul). Las imágenes fusionadas muestran los tres canales simultáneamente. Barra de escala: 10 μm. (D) La co-localización de proteínas etiquetadas con EGFP como se muestra en (C) con H3K9me3 y regiones densas en DAPI se evaluó visualmente y se representa gráficamente en relación con el número total de células positivas para EGFP (norte & GT 70).

La inserción de mLinker 2 V1 facilita el reconocimiento sinérgico de H3K9me3 por parte del módulo mTTD-PHD V1. (A) Serie de titulación de mUHRF1 V1 WT recombinante, R298A (R298 *), P293A / P294A / P295A (parche P *), P293A / P294A / P295A / L297A / R298A (parche P / R *), R298A / N299A / T300A / G301A / K302A / S303A (RS *) y mUHRF1 V2 WT con péptidos H3 sin modificar (izquierda) y H3K9me3-FAM (derecha) se analizaron mediante termoforesis a microescala. Los datos se representan como promedio de tres experimentos independientes, las barras de error corresponden a la s.d. (B) Las proteínas recombinantes de (A) se sometieron a ensayos de ubiquitina ligasa E3 usando mononucleosomas recombinantes H3K9me3. Las reacciones se analizaron mediante transferencia Western (arriba). Las señales para UHRF1 e histonas en la membrana de transferencia Western teñida se muestran para los controles de carga (parte inferior). Se indican las posiciones de ejecución de los marcadores de peso molecular (izquierda) y las diferentes proteínas identificadas (derecha). (C) Imágenes confocales representativas de células NIH-3T3 murinas que expresan diferentes proteínas mutantes y mUHRF1 V1 y V2 WT etiquetadas con EGFP (EGFP, canal verde). Se realizó una tinción de inmunofluorescencia para H3K9me3 (canal rojo). La tinción DAPI marca el ADN (canal azul). Las imágenes fusionadas muestran los tres canales simultáneamente. Barra de escala: 10 μm. (D) La co-localización de proteínas etiquetadas con EGFP como se muestra en (C) con H3K9me3 y regiones densas en DAPI se evaluó visualmente y se trazó en relación con el número total de células positivas para EGFP (norte & GT 70).

Finalmente, preguntamos si la interrupción de la sinergia entre mTTD y mPHD por la mutación mLinker 2 V1 es suficiente para afectar la focalización celular de mUHRF1 V1 a H3K9me3. Sobreexpresamos transitoriamente EGFP-mUHRF1 V1 WT, R298 *, P-patch / R * y R-S *, así como EGFP-mUHRF1 V2 WT en células C127 y NIH-3T3. Usando microscopía confocal, encontramos que en ambas líneas celulares las tres mutaciones en mLinker 2 V1 causaron una disminución de la localización de focos de mUHRF1 V1 a H3K9me3, imitando la localización de mUHRF1 V2 (Figura 7C, D, Figura complementaria S9-S11). Concluimos que la unión sinérgica de histonas por mTTD y mPHD, que se establece mediante la inserción de mUHRF1 V1 Linker 2, es necesaria para impulsar la localización subnuclear específica de mUHRF1 V1. La ausencia de sinergia, ya sea por la ausencia de la inserción (mUHRF1 V2) o la mutación de R298, provocó una localización más difusa de mUHRF1, que no está enfocada en H3K9me3. Curiosamente y en contraste con P-patch / R * y R-S *, R298 * interrumpió la sinergia entre mTTD y mPHD, pero no liberó el surco de la superficie de mTTD para la unión de H3 (Figuras 6D y 7A). Esto indicó que las diferencias en la localización subnuclear son realmente causadas por el acoplamiento sinérgico de mTTD y mPHD en mUHRF1 V1 pero no V2.


Abstracto

Los relojes circadianos son mecanismos endógenos que traducen las señales ambientales en información temporal para generar los ritmos de 24 h en el metabolismo y la fisiología. La función circadiana se basa en la regulación precisa de la expresión génica rítmica en el núcleo del oscilador, que modula temporalmente la actividad transcripcional del genoma en prácticamente todos los organismos multicelulares examinados hasta la fecha. La evidencia emergente en plantas sugiere una interacción altamente sofisticada entre los patrones circadianos de expresión génica y los cambios rítmicos en la remodelación de la cromatina y las modificaciones de las histonas. El empalme alternativo de ARN mensajero precursor (pre-ARNm) también se ha definido recientemente como un pilar fundamental dentro del sistema circadiano, que proporciona la plasticidad y especificidad necesarias para ajustar el reloj circadiano. Esta revisión destaca la relación entre el reloj circadiano de la planta con la remodelación de la cromatina y el empalme alternativo y compara las similitudes y divergencias con estudios análogos en sistemas circadianos animales.

Reflejos

► Interacción entre la expresión génica circadiana y los cambios rítmicos en la remodelación de la cromatina. ► El empalme alternativo proporciona plasticidad y especificidad para ajustar el reloj circadiano. ► La evidencia emergente destaca los nuevos mecanismos responsables de la regulación pre, cotranscripcional y postranscripcional de la expresión génica circadiana.


Las modificaciones de histonas inducidas por la actividad gobiernan el empalme del ARNm de Neurexin-1 y la preservación de la memoria

Los mecanismos epigenéticos regulan la formación, consolidación y reconsolidación de los recuerdos. Sin embargo, la ruta de señalización desde la activación neuronal hasta las modificaciones epigenéticas dentro del circuito cerebral relacionado con la memoria sigue siendo desconocida. Divulgamos que el aprendizaje induce modificaciones de histonas de larga duración en las neuronas activadas por la memoria del hipocampo para regular la estabilidad de la memoria. La actividad neuronal desencadena un cambio de inicio tardío en la elección de la isoforma de empalme Nrxn1 en el sitio de empalme 4 mediante la acumulación de un marcador de histonas represivo, H3K9me3, para modular el proceso de empalme. La fosforilación dependiente de la actividad de p66α a través de la proteína quinasa activada por AMP recluta HDAC2 y Suv39h1 para establecer marcadores de histonas represivas y cambia la conectividad de las neuronas activadas. La eliminación de Suv39h1 abolió el cambio dependiente de la actividad en la elección de la isoforma de empalme de Nrxn1 y redujo la estabilidad de las memorias establecidas. Descubrimos un proceso autónomo de células para la preservación de la memoria en el que las neuronas relacionadas con la memoria inician una reducción tardía de sus capacidades de recableado a través de modificaciones de histonas inducidas por la actividad.


Un papel dinámico para las marcas de histonas en el empalme alternativo dependiente de EMT

(Alexandre Segelle y Jean-Phillipe Villemin)

Durante la EMT, hay cambios bien conocidos en el empalme alternativo que pueden ocurrir al principio de la EMT o más tarde en las etapas más finales del proceso de reprogramación. Además, hemos descubierto que muchos de estos genes empalmados alternativamente están regulados por modificaciones de la cromatina, lo que plantea la cuestión de cuál es la interacción dinámica entre las dos capas reguladoras. En este proyecto, combinaremos datos de epigenómica y transcriptómica de todo el genoma con metodologías de biología molecular más clásicas, para identificar y correlacionar en el tiempo los cambios en la cromatina y los lncRNA con los cambios en el empalme durante la EMT. Como prueba final del papel de estas marcas de histonas en el empalme dependiente de EMT, adaptaremos el sistema CRISPR / dCas9 para editar el exón del epigenoma específicamente y probar el efecto en el empalme alternativo.

Al correlacionar en el tiempo (T0, T1, T6, T21 días) los cambios en todo el genoma en el empalme alternativo, los niveles de expresión de lncRNA y los niveles de enriquecimiento de modificación de histonas durante el establecimiento y mantenimiento de un nuevo programa de empalme específico de EMT, identificaremos nuevos reguladores de empalme que se estudiará más a fondo con enfoques más mecanicistas.


Contenido

El empalme alternativo se observó por primera vez en 1977. [9] [10] El adenovirus produce cinco transcripciones primarias al principio de su ciclo infeccioso, antes de la replicación del ADN viral, y una adicional más tarde, después de que comienza la replicación del ADN. Las primeras transcripciones primarias continúan produciéndose después de que comienza la replicación del ADN. La transcripción primaria adicional producida al final de la infección es grande y proviene de 5/6 del genoma del adenovirus de 32 kb. Esto es mucho más grande que cualquiera de los ARNm de adenovirus individuales presentes en las células infectadas. Los investigadores encontraron que la transcripción de ARN primaria producida por el adenovirus tipo 2 en la fase tardía se empalmó de muchas formas diferentes, lo que resultó en ARNm que codificaban diferentes proteínas virales. Además, la transcripción primaria contenía múltiples sitios de poliadenilación, dando diferentes extremos 3 'para los ARNm procesados. [11] [12] [13]

En 1981, se caracterizó el primer ejemplo de empalme alternativo en una transcripción de un gen endógeno normal. [11] Se descubrió que el gen que codifica la hormona tiroidea calcitonina se empalmaba alternativamente en células de mamíferos. La transcripción primaria de este gen contiene 6 exones; el ARNm de calcitonina contiene los exones 1 a 4 y termina después de un sitio de poliadenilación en el exón 4. Se produce otro ARNm a partir de este pre-ARNm omitiendo el exón 4, e incluye los exones 1-3, 5 y 6. Codifica una proteína conocida como CGRP (péptido relacionado con el gen de la calcitonina). [14] [15] También se observaron ejemplos de empalme alternativo en transcripciones de genes de inmunoglobina en mamíferos a principios de la década de 1980. [11] [16]

Desde entonces, se ha descubierto que el empalme alternativo es omnipresente en eucariotas. [1] El "poseedor del récord" para empalmes alternativos es un D. melanogaster gen llamado Dscam, que potencialmente podría tener 38.016 variantes de empalme. [17]

En 2021, se descubrió que el genoma del adenovirus tipo 2, el adenovirus en el que se identificó por primera vez el corte y empalme alternativo, podía producir una variedad mucho mayor de ARNm de lo que se pensaba anteriormente. [18] Mediante el uso de tecnología de secuenciación de próxima generación, los investigadores pudieron actualizar el transcriptoma del adenovirus humano tipo 2 y presentar un ARNm único 904 alucinante, producido por el virus a través de un patrón complejo de empalme alternativo.

Generalmente se reconocen cinco modos básicos de empalme alternativo. [1] [2] [3] [19]

  • Salto de exón o exón de casete: en este caso, un exón puede separarse de la transcripción primaria o retenerse. Este es el modo más común en los pre-ARNm de mamíferos. [19]
  • Exones mutuamente excluyentes: Uno de los dos exones se retiene en los ARNm después del corte y empalme, pero no ambos.
  • Sitio donante alternativo: Se utiliza una unión de empalme 5 'alternativa (sitio donante), cambiando el límite 3' del exón aguas arriba.
  • Sitio aceptor alternativo: Se utiliza una unión de empalme 3 'alternativa (sitio aceptor), cambiando el límite 5' del exón corriente abajo.
  • Retención de intrones: Una secuencia puede empalmarse como un intrón o simplemente retenerse. Esto se distingue de la omisión de exón porque la secuencia retenida no está flanqueada por intrones. Si el intrón retenido está en la región codificante, el intrón debe codificar aminoácidos en el marco con los exones vecinos, o un codón de parada o un cambio en el marco de lectura provocará que la proteína no sea funcional. Este es el modo más raro en mamíferos. [19]

Además de estos modos primarios de empalme alternativo, existen otros dos mecanismos principales mediante los cuales se pueden generar diferentes ARNm a partir del mismo gen, múltiples promotores y múltiples sitios de poliadenilación. El uso de múltiples promotores se describe adecuadamente como un mecanismo de regulación de la transcripción en lugar de un corte y empalme alternativo al iniciar la transcripción en diferentes puntos, se pueden generar transcripciones con diferentes exones 5 '. En el otro extremo, múltiples sitios de poliadenilación proporcionan diferentes puntos finales 3 'para la transcripción. Ambos mecanismos se encuentran en combinación con el empalme alternativo y proporcionan una variedad adicional de ARNm derivados de un gen. [1] [3]

Estos modos describen mecanismos de empalme básicos, pero pueden ser inadecuados para describir eventos de empalme complejos. Por ejemplo, la figura de la derecha muestra 3 formas de empalme del gen de la hialuronidasa 3 de ratón. La comparación de la estructura exónica que se muestra en la primera línea (verde) con la de la segunda línea (amarillo) muestra retención de intrones, mientras que la comparación entre la segunda y la tercera forma de empalme (amarillo frente a azul) exhibe saltos de exón. Recientemente se ha propuesto una nomenclatura modelo para designar de forma única todos los posibles patrones de empalme. [19]

Mecanismo de empalme general Editar

Cuando el pre-ARNm se ha transcrito del ADN, incluye varios intrones y exones. (En los nematodos, la media es de 4 a 5 exones e intrones en la mosca de la fruta. Drosophila puede haber más de 100 intrones y exones en un pre-ARNm transcrito). Los exones que se retendrán en el ARNm se determinan durante el proceso de corte y empalme. La regulación y selección de los sitios de empalme se realiza mediante el activador de empalme que actúa en trans y las proteínas represoras del empalme, así como los elementos que actúan en cis dentro del propio pre-mRNA, como los potenciadores de empalme exónico y los silenciadores de empalme exónico.

El intrón nuclear eucariota típico tiene secuencias consenso que definen regiones importantes. Cada intrón tiene la secuencia GU en su extremo 5 '. Cerca del extremo de 3 'hay una sucursal. El nucleótido en el punto de ramificación es siempre una A; el consenso en torno a esta secuencia varía algo. En los seres humanos, la secuencia de consenso del sitio de ramificación es yUnAy. [20] El sitio de la ramificación es seguido por una serie de pirimidinas, el tracto de polipirimidina, y luego por AG en el extremo 3 '. [3]

El empalme de ARNm se realiza mediante un complejo de ARN y proteínas conocido como espliceosoma, que contiene snRNP designados como U1, U2, U4, U5 y U6 (U3 no participa en el empalme de ARNm). [21] U1 se une al 5 'GU y U2, con la ayuda de los factores proteicos U2AF, se une al punto de ramificación A dentro del sitio de ramificación. El complejo en esta etapa se conoce como complejo de espliceosoma A. La formación del complejo A suele ser el paso clave para determinar los extremos del intrón que se empalmará y definir los extremos del exón que se retendrá. [3] (La nomenclatura U se deriva de su alto contenido de uridina).

El complejo U4, U5, U6 se une y U6 reemplaza la posición U1. U1 y U4 se van. El complejo restante luego realiza dos reacciones de transesterificación. En la primera transesterificación, el extremo 5 'del intrón se escinde del exón cadena arriba y se une al sitio de ramificación A mediante un enlace 2', 5'-fosfodiéster. En la segunda transesterificación, el extremo 3 'del intrón se escinde del exón corriente abajo y los dos exones se unen mediante un enlace fosfodiéster. A continuación, el intrón se libera en forma de lazo y se degrada. [1]

Elementos reguladores y proteínas Editar

El empalme está regulado por proteínas que actúan en trans (represores y activadores) y los correspondientes sitios reguladores que actúan en cis (silenciadores y potenciadores) en el pre-ARNm. Sin embargo, como parte de la complejidad del empalme alternativo, se observa que los efectos de un factor de empalme con frecuencia dependen de la posición. Es decir, un factor de empalme que sirve como activador de empalme cuando se une a un elemento potenciador intrónico puede servir como represor cuando se une a su elemento de empalme en el contexto de un exón, y viceversa. [22] La estructura secundaria de la transcripción de pre-ARNm también juega un papel en la regulación del empalme, como al reunir elementos de empalme o enmascarar una secuencia que de otra manera serviría como elemento de unión para un factor de empalme. [23] [24] Juntos, estos elementos forman un "código de empalme" que gobierna cómo se producirá el empalme en diferentes condiciones celulares. [25] [26]

Hay dos tipos principales de elementos de secuencia de ARN que actúan en cis presentes en los pre-ARNm y tienen las correspondientes proteínas de unión al ARN que actúan en trans. Empalme silenciadores son sitios a los que se unen las proteínas represoras de empalme, lo que reduce la probabilidad de que un sitio cercano se utilice como unión de empalme. Estos pueden estar ubicados en el propio intrón (silenciadores de empalme intrónico, ISS) o en un exón vecino (silenciadores de empalme exónico, ESS). Varían en secuencia, así como en los tipos de proteínas que se unen a ellos. La mayoría de los represores de empalme son ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP) como hnRNPA1 y proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB). [3] [25] Empalme potenciadores son sitios a los que se unen las proteínas activadoras de empalme, lo que aumenta la probabilidad de que un sitio cercano se utilice como unión de empalme. Estos también pueden ocurrir en el intrón (potenciadores de empalme intrónico, ISE) o exón (potenciadores de empalme exónico, ESE). La mayoría de las proteínas activadoras que se unen a ISE y ESE son miembros de la familia de proteínas SR. Dichas proteínas contienen motivos de reconocimiento de ARN y dominios ricos en arginina y serina (RS). [3] [25]

En general, los determinantes del empalme funcionan de manera interdependiente que depende del contexto, de modo que las reglas que gobiernan cómo se regula el empalme a partir de un código de empalme. [26] La presencia de un elemento de secuencia de ARN que actúa en cis en particular puede aumentar la probabilidad de que un sitio cercano se empalme en algunos casos, pero disminuye la probabilidad en otros casos, según el contexto. El contexto dentro del cual actúan los elementos reguladores incluye el contexto de actuación en cis que se establece por la presencia de otras características de la secuencia de ARN, y el contexto de actuación en trans que se establece por las condiciones celulares. Por ejemplo, algunos elementos de secuencia de ARN que actúan en cis influyen en el corte y empalme solo si están presentes múltiples elementos en la misma región para establecer el contexto. Como otro ejemplo, un elemento que actúa en cis puede tener efectos opuestos sobre el empalme, dependiendo de qué proteínas se expresan en la célula (por ejemplo, PTB neuronal versus no neuronal).La importancia adaptativa de empalmar silenciadores y potenciadores está atestiguada por estudios que muestran que existe una fuerte selección en genes humanos contra mutaciones que producen nuevos silenciadores o alteran los potenciadores existentes. [27] [28]

Metilación del ADN y empalme alternativo en insectos sociales Editar

La metilación del ADN de CpG ha demostrado un papel para regular el empalme alternativo en insectos sociales. [29] [30] En las abejas melíferas (Apis mellifera), La metilación del ADN de CpG parece regular la omisión de exón según los primeros estudios genómicos [31] [32] después de que el genoma de las abejas melíferas estuvo disponible. [33] La metilación del ADN de CpG reguló el empalme alternativo de manera más extensa, no solo afecta la omisión de exón, sino también la retención de intrones y otros eventos de empalme. [34]

Ejemplos Editar

Salto de exón: Drosophila dsx Editar

Pre-ARNm de la D. melanogaster gene dsx contienen 6 exones. En los hombres, los exones 1, 2, 3, 5 y 6 se unen para formar el ARNm, que codifica una proteína reguladora de la transcripción necesaria para el desarrollo masculino. En las mujeres, los exones 1, 2, 3 y 4 están unidos y una señal de poliadenilación en el exón 4 provoca la escisión del ARNm en ese punto. El ARNm resultante es una proteína reguladora de la transcripción necesaria para el desarrollo femenino. [35]

Este es un ejemplo de omisión de exón. El intrón corriente arriba del exón 4 tiene un tracto de polipirimidina que no coincide bien con la secuencia consenso, por lo que las proteínas U2AF se unen mal sin la ayuda de los activadores de empalme. Por tanto, este sitio aceptor de empalme 3 'no se utiliza en machos. Las hembras, sin embargo, producen el transformador activador de empalme (Tra) (ver más abajo). La proteína SR Tra2 se produce en ambos sexos y se une a un ESE en el exón 4 si Tra está presente, se une a Tra2 y, junto con otra proteína SR, forma un complejo que ayuda a las proteínas U2AF a unirse al tracto de polipirimidina débil. U2 se recluta en el punto de ramificación asociado y esto conduce a la inclusión del exón 4 en el ARNm. [35] [36]

Sitios de aceptadores alternativos: Drosophila Transformador Editar

Pre-ARNm del Transformador (Tra) gen de Drosophila melanogaster someterse a un empalme alternativo a través del modo de sitio aceptor alternativo. El gen Tra codifica una proteína que se expresa solo en mujeres. La transcripción primaria de este gen contiene un intrón con dos posibles sitios aceptores. En los machos, se usa el sitio aceptor aguas arriba. Esto hace que se incluya una versión más larga del exón 2 en la transcripción procesada, incluido un codón de parada temprana. El ARNm resultante codifica un producto proteico truncado que es inactivo. Las hembras producen la proteína maestra de determinación del sexo Sex letal (Sxl). La proteína Sxl es un represor de corte y empalme que se une a un ISS en el ARN de la transcripción Tra cerca del sitio aceptor aguas arriba, evitando que la proteína U2AF se una al tracto de polipirimidina. Esto evita el uso de esta unión, desplazando la unión del espliceosoma al sitio aceptor aguas abajo. El empalme en este punto evita el codón de terminación, que se escinde como parte del intrón. El ARNm resultante codifica una proteína Tra activa, que en sí misma es un regulador del corte y empalme alternativo de otros genes relacionados con el sexo (ver dsx encima). [1]

Definición de exón: receptor Fas Editar

Se producen múltiples isoformas de la proteína del receptor Fas mediante empalme alternativo. Dos isoformas que ocurren normalmente en humanos son producidas por un mecanismo de omisión de exón. Un ARNm que incluye el exón 6 codifica la forma unida a la membrana del receptor Fas, que promueve la apoptosis o muerte celular programada. El aumento de la expresión del receptor Fas en las células cutáneas expuestas de forma crónica al sol y la ausencia de expresión en las células cancerosas de la piel sugieren que este mecanismo puede ser importante en la eliminación de las células precancerosas en los seres humanos. [37] Si se omite el exón 6, el ARNm resultante codifica una proteína Fas soluble que no promueve la apoptosis. La inclusión o la omisión del exón depende de dos proteínas antagonistas, TIA-1 y proteína de unión al tracto de polipirimidina (PTB).

  • El sitio donante 5 'en el intrón aguas abajo del exón 6 en el pre-mRNA tiene una débil concordancia con la secuencia consenso y no está unido normalmente por el U1 snRNP. Si U1 no se une, se omite el exón (consulte "a" en la figura adjunta).
  • La unión de la proteína TIA-1 a un sitio potenciador de empalme intrónico estabiliza la unión del snRNP de U1. [3] El complejo del sitio donante 5 'resultante ayuda a la unión del factor de empalme U2AF al sitio de empalme 3' aguas arriba del exón, a través de un mecanismo que aún no se conoce (ver b). [38]
  • Exon 6 contiene un silenciador de empalme exónico rico en pirimidina, ure6, donde PTB se puede unir. Si PTB se une, inhibe el efecto del complejo donante 5 'sobre la unión de U2AF al sitio aceptor, lo que da como resultado la omisión del exón (ver c).

Este mecanismo es un ejemplo de definición de exón en empalme. Un espliceosoma se ensambla en un intrón y las subunidades snRNP pliegan el ARN de modo que se unen los extremos 5 'y 3' del intrón. Sin embargo, ejemplos recientemente estudiados como este muestran que también existen interacciones entre los extremos del exón. En este caso particular, estas interacciones de definición de exón son necesarias para permitir la unión de factores de empalme del núcleo antes del ensamblaje de los espliceosomas en los dos intrones flanqueantes. [38]

Competencia de represor-activador: VIH-1 hacer encaje exon 2 Editar

El VIH, el retrovirus que causa el SIDA en los seres humanos, produce una única transcripción de ARN primaria, que alternativamente se empalma de múltiples formas para producir más de 40 ARNm diferentes. [39] El equilibrio entre transcripciones empalmadas diferencialmente proporciona múltiples ARNm que codifican diferentes productos que se requieren para la multiplicación viral. [40] Una de las transcripciones empalmadas diferencialmente contiene la hacer encaje gen, en el que el exón 2 es un exón de casete que puede omitirse o incluirse. La inclusión del exón 2 de tat en el ARN está regulada por la competencia entre el represor de corte y empalme hnRNP A1 y la proteína SR SC35. Dentro del exón 2 se superponen una secuencia silenciadora de empalme exónico (ESS) y una secuencia potenciadora de empalme exónico (ESE). Si la proteína represora A1 se une al ESS, inicia la unión cooperativa de múltiples moléculas A1, extendiéndose hacia el sitio donante 5 'aguas arriba del exón 2 y evitando la unión del factor de corte y empalme central U2AF35 al tracto de polipirimidina. Si SC35 se une al ESE, evita la unión de A1 y mantiene el sitio donante de 5 'en un estado accesible para el ensamblaje del espliceosoma. La competencia entre el activador y el represor asegura que se produzcan ambos tipos de ARNm (con y sin exón 2). [39]

El empalme alternativo es una de varias excepciones a la idea original de que una secuencia de ADN codifica un polipéptido (la hipótesis Un gen-una enzima). Ahora podría ser más correcto decir "Un gen, muchos polipéptidos". [41] Se necesita información externa para decidir qué polipéptido se produce, dada una secuencia de ADN y un pre-ARNm. Dado que los métodos de regulación se heredan, esto proporciona nuevas formas de que las mutaciones afecten la expresión génica. [7]

Se ha propuesto que para los eucariotas el empalme alternativo fue un paso muy importante hacia una mayor eficiencia, porque la información se puede almacenar de manera mucho más económica. Varias proteínas pueden ser codificadas por un solo gen, en lugar de requerir un gen separado para cada una, permitiendo así un proteoma más variado de un genoma de tamaño limitado. [1] También proporciona flexibilidad evolutiva. Una mutación de un solo punto puede causar que un exón dado sea ocasionalmente excluido o incluido de una transcripción durante el corte y empalme, lo que permite la producción de una nueva isoforma de proteína sin pérdida de la proteína original. [1] Los estudios han identificado regiones intrínsecamente desordenadas (ver proteínas intrínsecamente no estructuradas) como enriquecidas en exones no constitutivos [42], lo que sugiere que las isoformas de proteínas pueden mostrar diversidad funcional debido a la alteración de los módulos funcionales dentro de estas regiones. Esta diversidad funcional lograda por las isoformas se refleja en sus patrones de expresión y puede predecirse mediante enfoques de aprendizaje automático. [43] [44] Los estudios comparativos indican que el empalme alternativo precedió a la multicelularidad en la evolución y sugieren que este mecanismo podría haber sido adoptado para ayudar en el desarrollo de organismos multicelulares. [45]

La investigación basada en el Proyecto del Genoma Humano y otras secuencias del genoma ha demostrado que los humanos tienen solo un 30% más de genes que la lombriz intestinal Caenorhabditis elegans, y solo el doble que la mosca Drosophila melanogaster. Este hallazgo llevó a la especulación de que la mayor complejidad percibida de los humanos, o de los vertebrados en general, podría deberse a tasas más altas de empalme alternativo en humanos que en los invertebrados. [46] [47] Sin embargo, un estudio de muestras de 100.000 tecnologías ecológicamente racionales de humanos, ratones, ratas, vacas, moscas (D. melanogaster), gusano (C. elegans), y la planta Arabidopsis thaliana no encontraron grandes diferencias en la frecuencia de genes empalmados alternativamente entre humanos y cualquiera de los otros animales probados. [48] ​​Otro estudio, sin embargo, propuso que estos resultados eran un artefacto de los diferentes números de tecnologías ecológicamente racionales disponibles para los diversos organismos. Cuando compararon frecuencias de empalme alternativo en subconjuntos aleatorios de genes de cada organismo, los autores concluyeron que los vertebrados tienen tasas más altas de empalme alternativo que los invertebrados. [49]

Los cambios en la maquinaria de procesamiento de ARN pueden provocar un empalme incorrecto de múltiples transcripciones, mientras que las alteraciones de un solo nucleótido en los sitios de empalme o en los sitios reguladores de empalme que actúan en cis pueden dar lugar a diferencias en el empalme de un solo gen y, por lo tanto, en el ARNm producido a partir de un gen. transcripciones de genes mutantes. Un estudio de 2005 que incluyó análisis probabilísticos indicó que más del 60% de las mutaciones que causan enfermedades en humanos afectan el empalme en lugar de afectar directamente a las secuencias de codificación. [50] Un estudio más reciente indica que es probable que un tercio de todas las enfermedades hereditarias tengan un componente de empalme. [22] Independientemente del porcentaje exacto, existen varias enfermedades relacionadas con el empalme. [51] Como se describe a continuación, un ejemplo destacado de enfermedades relacionadas con el empalme es el cáncer.

Los ARNm anormalmente empalmados también se encuentran en una alta proporción de células cancerosas. [5] [6] [8] Los análisis combinados de RNA-Seq y proteómica han revelado una expresión diferencial sorprendente de isoformas de corte y empalme de proteínas clave en vías importantes del cáncer. [52] No siempre está claro si estos patrones aberrantes de empalme contribuyen al crecimiento canceroso o son simplemente consecuencia de anomalías celulares asociadas con el cáncer. Para ciertos tipos de cáncer, como el colorrectal y el de próstata, se ha demostrado que el número de errores de empalme por cáncer varía mucho entre cánceres individuales, un fenómeno conocido como inestabilidad del transcriptoma. [53] [54] Se ha demostrado además que la inestabilidad del transcriptoma correlaciona la grealidad con un nivel reducido de expresión de los genes del factor de corte y empalme. Mutación de DNMT3A se ha demostrado que contribuye a las neoplasias malignas hematológicas, y que DNMT3ALas líneas celulares mutadas exhiben inestabilidad del transcriptoma en comparación con sus contrapartes isogénicas de tipo salvaje. [55]

De hecho, en realidad hay una reducción del empalme alternativo en las células cancerosas en comparación con las normales, y los tipos de empalme difieren, por ejemplo, las células cancerosas muestran niveles más altos de retención de intrones que las células normales, pero niveles más bajos de omisión de exones. [56] Algunas de las diferencias en el empalme en las células cancerosas pueden deberse a la alta frecuencia de mutaciones somáticas en los genes del factor de empalme, [8] y algunas pueden ser el resultado de cambios en la fosforilación de los factores de empalme que actúan en trans. [7] Otros pueden producirse por cambios en las cantidades relativas de factores de empalme producidos, por ejemplo, se ha demostrado que las células de cáncer de mama tienen niveles aumentados del factor de empalme SF2 / ASF. [57] Un estudio encontró que un porcentaje relativamente pequeño (383 de más de 26000) de variantes de empalme alternativas tenían una frecuencia significativamente mayor en las células tumorales que en las células normales, lo que sugiere que hay un conjunto limitado de genes que, cuando se empalman incorrectamente, contribuir al desarrollo de tumores. [58] Sin embargo, se cree que los efectos deletéreos de las transcripciones mal empalmadas generalmente se salvaguardan y eliminan mediante un mecanismo de control de calidad postranscripcional celular denominado desintegración del ARNm mediada por sin sentido [NMD]. [59]

Un ejemplo de una variante de empalme específica asociada con cánceres está en uno de los genes DNMT humanos. Tres genes DNMT codifican enzimas que agregan grupos metilo al ADN, una modificación que a menudo tiene efectos reguladores. Varios ARNm de DNMT3B empalmados anormalmente se encuentran en tumores y líneas de células cancerosas. En dos estudios separados, la expresión de dos de estos ARNm empalmados anormalmente en células de mamíferos provocó cambios en los patrones de metilación del ADN en esas células. Las células con uno de los ARNm anormales también crecieron dos veces más rápido que las células de control, lo que indica una contribución directa al desarrollo de tumores por parte de este producto. [7]

Otro ejemplo es el Ron (MST1R) protooncogén. Una propiedad importante de las células cancerosas es su capacidad para moverse e invadir el tejido normal. Producción de una transcripción anormalmente empalmada de Ron se ha encontrado que está asociado con niveles elevados de SF2 / ASF en las células de cáncer de mama. La isoforma anormal de la proteína Ron codificada por este ARNm conduce a la motilidad celular. [57]

La sobreexpresión de una variante de corte y empalme truncada del gen FOSB - ΔFosB - en una población específica de neuronas en el núcleo accumbens se ha identificado como el mecanismo causal involucrado en la inducción y mantenimiento de una adicción a las drogas y recompensas naturales. [60] [61] [62] [63]

Estudios provocativos recientes apuntan a una función clave de la estructura de la cromatina y las modificaciones de las histonas en la regulación del empalme alternativo. Estos conocimientos sugieren que la regulación epigenética determina no solo qué partes del genoma se expresan, sino también cómo se empalman. [64]

El análisis de todo el genoma del empalme alternativo es una tarea desafiante. Normalmente, se han encontrado transcripciones empalmadas alternativamente comparando secuencias EST, pero esto requiere la secuenciación de un gran número de EST. La mayoría de las bibliotecas de EST provienen de un número muy limitado de tejidos, por lo que es probable que, en cualquier caso, se pasen por alto las variantes de empalme específicas de tejido. Sin embargo, se han desarrollado enfoques de alto rendimiento para investigar el empalme, tales como: análisis basados ​​en microarrays de ADN, ensayos de unión de ARN y secuenciación profunda. Estos métodos se pueden usar para detectar polimorfismos o mutaciones en o alrededor de elementos de empalme que afectan la unión a proteínas. Cuando se combina con ensayos de empalme, que incluyen en vivo Luego, en los ensayos de genes informadores, se pueden analizar los efectos funcionales de los polimorfismos o mutaciones en el corte y empalme de las transcripciones de pre-ARNm. [22] [25] [65]

En el análisis de microarrays, las matrices de fragmentos de ADN que representan exones individuales (p.ej. Affymetrix exón microarray) o límites exón / exón (p.ej. matrices de ExonHit o Jivan). A continuación, se sondea la matriz con ADNc marcado de tejidos de interés. Los ADNc de la sonda se unen al ADN de los exones que están incluidos en los ARNm en su tejido de origen, o al ADN del límite donde se han unido dos exones. Esto puede revelar la presencia de ARNm particulares empalmados alternativamente. [66]

CLIP (entrecruzamiento e inmunoprecipitación) utiliza radiación UV para unir proteínas a moléculas de ARN en un tejido durante el empalme. A continuación, se precipita una proteína reguladora de corte y empalme que actúa en trans utilizando anticuerpos específicos. Cuando el ARN unido a esa proteína se aísla y se clona, ​​revela las secuencias diana de esa proteína. [4] Otro método para identificar proteínas de unión a ARN y mapear su unión a transcripciones de pre-ARNm es "Evaluación de microarrays de aptámeros genómicos por cambio (MEGAshift)". Net [67] Este método implica una adaptación de la "Evolución sistemática de ligandos por el método de enriquecimiento exponencial (SELEX) "[68] junto con una lectura basada en microarrays. El uso del método MEGAshift ha proporcionado información sobre la regulación del empalme alternativo al permitir la identificación de secuencias en transcripciones de pre-ARNm que rodean exones empalmados alternativamente que median la unión a diferentes factores de empalme, como ASF / SF2 y PTB. [69] Este enfoque también se ha utilizado para ayudar a determinar la relación entre la estructura secundaria del ARN y la unión de factores de empalme. [24]

Se han utilizado tecnologías de secuenciación profunda para realizar análisis de ARNm de todo el genoma, sin procesar y procesados, lo que proporciona información sobre el empalme alternativo. Por ejemplo, los resultados del uso de secuenciación profunda indican que, en los seres humanos, se estima que el 95% de las transcripciones de genes multiexon se someten a un empalme alternativo, con varias transcripciones de pre-ARNm empalmadas de una manera específica de tejido. [2] La genómica funcional y los enfoques computacionales basados ​​en el aprendizaje de instancias múltiples también se han desarrollado para integrar datos de RNA-seq para predecir funciones para isoformas empalmadas alternativamente. [44] La secuenciación profunda también ha ayudado a en vivo detección de lariats transitorios que se liberan durante el empalme, determinación de secuencias de sitios de ramificación y mapeo a gran escala de puntos de ramificación en transcripciones de pre-ARNm humano. [70]

El uso de ensayos informadores hace posible encontrar las proteínas de corte y empalme implicadas en un evento de corte y empalme alternativo específico mediante la construcción de genes informadores que expresarán una de dos proteínas fluorescentes diferentes dependiendo de la reacción de corte y empalme que se produzca. Este método se ha utilizado para aislar mutantes que afectan al empalme y, por tanto, para identificar nuevas proteínas reguladoras del empalme inactivadas en esos mutantes. [4]

Existe una colección de bases de datos de empalme alternativas. [71] [72] [73] Estas bases de datos son útiles para encontrar genes que tienen pre-mRNA que se someten a procesos de empalme alternativo y empalme alternativo o para estudiar el impacto funcional del empalme alternativo.


Ver el vídeo: RNA Splicing (Septiembre 2022).


Comentarios:

  1. Luki

    Puedo estar de acuerdo contigo.

  2. Kajishura

    Et 1,000,000,000 puds))))))))

  3. Strang

    Diría sobre la monumentalidad, la grandeza de algunas tramas. Y yo lo llamaría, sin filtro. En mi opinión, la belleza sigue siendo algo más: lo mejor, el más puro, el elegido, lo que te hace temblar y sorprenderte. Puedes encontrar belleza en todo, pero todo en una multitud no es belleza. EN MI HUMILDE OPINIÓN.

  4. Hekli

    Me encontraré con un estilo de presentación

  5. Dugrel

    Aquí realmente un teatro de recinto ferial lo que es



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