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11.7A: Anticuerpos, proteínas y unión a antígenos - Biología

11.7A: Anticuerpos, proteínas y unión a antígenos - Biología


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Una región en la punta de la proteína del anticuerpo es muy variable, lo que permite que existan millones de anticuerpos con diferentes sitios de unión al antígeno.

Objetivos de aprendizaje

  • Describir la función y estructura general de un anticuerpo.

Puntos clave

  • Un anticuerpo (Ab), también conocido como inmunoglobulina (Ig), es una proteína grande producida por las células B que es utilizada por el sistema inmunológico para identificar y neutralizar objetos extraños, como bacterias y virus. El anticuerpo reconoce una parte única de la diana extraña, llamada antígeno.
  • Cada punta de la "Y" de un anticuerpo contiene un paratopo que es específico para un epítopo particular (análogo a un candado y una llave) en un antígeno, lo que permite que estas dos estructuras se unan con precisión. Usando este mecanismo de unión, un anticuerpo puede marcar un microbio o una célula infectada.
  • La estructura general de todos los anticuerpos es muy similar: el monómero de Ig es una molécula en forma de Y que consta de cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas conectadas por enlaces disulfuro.
  • Los anticuerpos pueden presentarse en dos formas físicas, una forma soluble que se secreta por la célula y una forma unida a la membrana que se adhiere a la superficie de una célula B y se denomina receptor de célula B (BCR).

Términos clave

  • Región hipervariable: En los anticuerpos, las regiones hipervariables forman el sitio de unión al antígeno y se encuentran tanto en cadenas ligeras como pesadas. También contribuyen a la especificidad de cada anticuerpo. En una región variable, los 3 segmentos HV de cada cadena pesada o ligera se pliegan juntos en el extremo N para formar un bolsillo de unión al antígeno.

Un anticuerpo (Ab), también conocido como inmunoglobulina (Ig), es una proteína grande en forma de Y producida por células B que es utilizada por el sistema inmunológico para identificar y neutralizar objetos extraños, como bacterias y virus. El anticuerpo reconoce una parte única de la diana extraña, llamada antígeno. Cada punta de la "Y" de un anticuerpo contiene un paratopo (una estructura análoga a un candado) que es específico para un epítopo particular (análogo de manera similar a una llave) en un antígeno, lo que permite que estas dos estructuras se unan con precisión. Usando este mecanismo de unión, un anticuerpo puede marcar un microbio, o una célula infectada, para que sea atacada por otras partes del sistema inmunológico, o puede neutralizar su objetivo directamente; por ejemplo, bloqueando una parte de un microbio que es esencial para su invasión y supervivencia. La producción de anticuerpos es la función principal del sistema inmunológico humoral.

Funciones de anticuerpos

Las funciones de los anticuerpos incluyen las siguientes:

  • Combine con virus / toxinas para evitar que invadan las células.
  • Se adhieren a los flagelos de bacterias, restringiendo su movimiento.
  • Se une a muchas bacterias a la vez, lo que hace que se acumulen y eviten el movimiento alrededor del cuerpo.
  • Romper las paredes celulares de las bacterias
  • Se adhiere a las bacterias, lo que facilita que los fagocitos las ingieran.

Estructura de anticuerpos

Los anticuerpos son proteínas plasmáticas globulares pesadas (~ 150 kDa). Tienen cadenas de azúcar agregadas a algunos de sus residuos de aminoácidos; en otras palabras, son glicoproteínas. Los anticuerpos están formados típicamente por las mismas unidades estructurales básicas, cada una con dos cadenas pesadas grandes y dos cadenas ligeras pequeñas.

Cadenas pesadas y ligeras, regiones variables y constantes de un anticuerpo

Hay varios tipos diferentes de cadenas pesadas de anticuerpos y varios tipos diferentes de anticuerpos, que se agrupan en diferentes isotipos según la cadena pesada que poseen. Se conocen cinco isotipos de anticuerpos diferentes en mamíferos, que desempeñan funciones diferentes y ayudan a dirigir la respuesta inmune adecuada para cada tipo diferente de objeto extraño que encuentran.

La estructura general de todos los anticuerpos es muy similar. El monómero de Ig es una molécula en forma de Y que consta de cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas conectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena está compuesta por dominios estructurales llamados dominios de inmunoglobulina. Estos dominios contienen aproximadamente 70-110 aminoácidos y se clasifican en diferentes categorías según su tamaño y función; por ejemplo, variable o IgV y constante o IgC. La región constante determina la clase de inmunoglobulina. Todas las cadenas tienen un pliegue de inmunoglobulina característico en el que dos hojas beta crean una forma de "sándwich", que se mantienen unidas por interacciones entre cisteínas conservadas y otros aminoácidos cargados.

Sin embargo, una pequeña región en la punta de la proteína es extremadamente variable, lo que permite que existan millones de anticuerpos con estructuras de punta ligeramente diferentes o sitios de unión al antígeno. Esta región se conoce como región hipervariable. Cada una de estas variantes puede unirse a un antígeno diferente. Esta enorme diversidad de anticuerpos permite que el sistema inmunológico reconozca una variedad igualmente amplia de antígenos. La población grande y diversa de anticuerpos se genera mediante combinaciones aleatorias de un conjunto de segmentos de genes que codifican paratopos diferentes, seguidos de mutaciones aleatorias en esta área del gen del anticuerpo, que crean una mayor diversidad. El paratopo se forma en el extremo amino terminal del monómero del anticuerpo por los dominios variables de las cadenas pesada y ligera. El dominio variable también se denomina región FV y es la región más importante para la unión a antígenos. Más específicamente, los bucles variables de cadenas β, tres de cada una en las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) son responsables de la unión al antígeno.

Los anticuerpos pueden presentarse en dos formas físicas, una forma soluble que se secreta por la célula y una forma unida a la membrana que se adhiere a la superficie de una célula B y se denomina receptor de células B (BCR). El BCR solo se encuentra en la superficie de las células B y facilita la activación de estas células y su posterior diferenciación en fábricas de anticuerpos llamadas células plasmáticas o células B de memoria que sobrevivirán en el cuerpo y recordarán ese mismo antígeno para que las células B puedan responder más rápido a la exposición futura. En la mayoría de los casos, la interacción de la célula B con una célula T colaboradora es necesaria para producir la activación completa de la célula B y, por lo tanto, la generación de anticuerpos después de la unión del antígeno.


Disección de interacciones de unión en el complejo entre el anticuerpo anti-lisozima HyHEL-63 y su antígeno

Se utilizaron mutagénesis de barrido de alanina, cristalografía de rayos X y ciclos de mutantes dobles para caracterizar la interfaz entre el anticuerpo anti-lisozima de clara de huevo de gallina (HEL) HyHEL-63 y HEL. Once residuos HEL en contacto con HyHEL-63 en la estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo, y 10 residuos HyHEL-63 en contacto con HEL, se truncaron individualmente a alanina para determinar sus contribuciones relativas a la estabilización del complejo. Los residuos de HEL (Tyr20, Lys96 y Lys97) más importantes para la unión de HyHEL-63 (Delta G (mutante) - Delta G (tipo salvaje) & gt 3.0 kcal / mol) forman un parche contiguo en el centro de la superficie contactada por el anticuerpo. Los residuos de puntos calientes del anticuerpo (Delta Delta G & gt 2,0 kcal / mol) se organizan en dos grupos que yuxtaponen residuos de puntos calientes de HEL, lo que da como resultado una complementariedad energética a través de la interfaz. Todos los residuos energéticamente críticos están ubicados centralmente, protegidos del solvente por residuos periféricos que contribuyen significativamente menos a la energía libre de unión. Aunque los residuos Lys96 y Lys97 de los puntos calientes de HEL hacen interacciones similares con el anticuerpo en el complejo HyHEL-63 / HEL, la sustitución de Lys96 por alanina da como resultado una reducción de la afinidad casi 100 veces mayor que la mutación correspondiente en Lys97. Para comprender la base de esta marcada diferencia, determinamos las estructuras cristalinas de los complejos HyHEL-63 / HEL Lys96Ala y HyHEL-63 / HEL Lys97Ala a una resolución de 1,80 y 1,85 A, respectivamente. Mientras que los cambios conformacionales en las proteínas y las diferencias en las redes de disolventes en los sitios de mutación parecen demasiado pequeños para explicar la diferencia de afinidad observada, la superposición de HEL libre en diferentes formas cristalinas sobre HEL unida en los complejos de tipo salvaje y mutante HyHEL-63 / HEL revela que la conformación de la cadena lateral de Lys96 es muy similar en las diversas estructuras, pero que la cadena lateral de Lys97 muestra una flexibilidad considerable. Por consiguiente, puede asociarse una penalización entrópica mayor con la extinción de la movilidad de Lys97 que la cadena lateral de Lys96 tras la formación del complejo, reduciendo la unión. Para diseccionar aún más la energía de interacciones específicas en la interfaz HyHEL-63 / HEL, se construyeron ciclos de mutantes dobles para medir el acoplamiento de 13 pares de aminoácidos, 11 de los cuales están en contacto directo en la estructura cristalina. Se encontró una gran energía de acoplamiento, 3,0 kcal / mol, entre el residuo HEL Lys97 y el residuo HyHEL-63 V (H) Asp32, que forman un puente salino enterrado rodeado por residuos polares del antígeno. Así, en contraste con el plegamiento de proteínas donde los puentes salinos enterrados son generalmente desestabilizadores, los puentes salinos en las interfaces proteína-proteína, cuya composición residual es más hidrófila que la del interior de la proteína, pueden contribuir significativamente a la estabilización compleja.


Quimiocinas y receptores de quimiocinas

Malaria

Plasmodium vivax también utiliza un receptor de quimiocinas para la entrada de células diana. 31 El ligando del parásito, llamado Plasmodium vivax La proteína de unión de Duffy (PvDBP), se expresa en micronemas de merozoitos y se une al norte-dominio terminal de ACKR1 (originalmente conocido como Duffy y más tarde como DARC [Receptor de antígeno Duffy para quimiocinas]) en los eritrocitos a través de un dominio rico en cisteína. Esta interacción es necesaria para la formación de uniones durante la invasión, pero no para la unión inicial o la orientación del parásito. P. vivax-La malaria es rara en África subsahariana debido a una deficiencia genética en ACKR1 / Duffy causada por una sustitución de un solo nucleótido en el gen promotor (-46 C) que afecta un sitio GATA-1 específico de eritroides. La fijación de la mutación en África probablemente se produjo debido a la presión selectiva positiva de la malaria. Deficiencia de ACKR1 / Duffy en humanos y en Ackr1 ratones knockout no está asociado con ningún problema de salud conocido. ACKR1 / Duffy es un objetivo farmacológico obvio, pero hasta la fecha, no se han informado candidatos.


Las infecciones por SARS-CoV-2 pueden desencadenar respuestas de anticuerpos contra múltiples proteínas virales

Crédito: Pixabay / CC0 Public Domain

Todos los coronavirus producen cuatro proteínas estructurales primarias y múltiples proteínas no estructurales. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones sobre el SARS-CoV-2 basadas en anticuerpos se han centrado en las proteínas de pico y nucleocápside. Un estudio publicado en PLOS Biología por Anna Heffron, Irene Ong y sus colegas de la Universidad de Wisconsin-Madison, EE. UU., sugiere que pueden desarrollarse respuestas inmunitarias contra otras proteínas producidas por el virus SARS-CoV-2.

La eficacia de las vacunas basadas en proteínas de pico es variable y no todas las personas infectadas con SARS-CoV-2 producen anticuerpos detectables contra las proteínas de pico o nucleocápside. Por lo tanto, las opciones expandidas basadas en anticuerpos tienen el potencial de desempeñar un papel importante en la mejora de las vacunas, los diagnósticos y la terapéutica, particularmente dada la aparición de nuevas variantes. Para investigar si la infección por SARS-CoV-2 induce fuertes respuestas de anticuerpos contra todas las proteínas del SARS-CoV-2, los investigadores mapearon 79 "epítopos", regiones específicas del proteoma viral que los anticuerpos reconocen y a las que se unen. También probaron si los anticuerpos que se desarrollan en respuesta al SARS-CoV-2 o los anticuerpos existentes de exposiciones previas a coronavirus podrían unirse a cualquiera de las proteínas en los otros seis coronavirus humanos conocidos para identificar posibles epítopos de reactividad cruzada.

Además de las proteínas de pico y nucleocápside, los autores localizaron epítopos de células B altamente reactivos previamente desconocidos en toda la gama de proteínas en el SARS-CoV-2 y otros coronavirus, ampliando el potencial para el desarrollo futuro de vacunas y terapias. Sin embargo, se necesitan investigaciones futuras para determinar cuánto tiempo permanecen estos anticuerpos y si las respuestas de las personas vacunadas difieren de las que contrajeron COVID-19 antes de la vacunación. El Dr. Ong y sus colegas continuarán investigando estos aspectos en adultos y niños.

Aunque los autores no perfilaron directamente las variantes de preocupación que han surgido desde el comienzo de la pandemia COVID-19, una comparación del genoma original del SARS-CoV-2 con algunas de las variantes de preocupación identificó numerosas variaciones en regiones que están en o dentro de los 3 aminoácidos de los epítopos de unión de anticuerpos identificados.

Según los autores, "nuestro amplio perfil de reactividad de anticuerpos de resolución a nivel de epítopo en sujetos convalecientes por COVID-19, confirmado por ensayos independientes, proporciona nuevos epítopos que podrían servir como objetivos importantes en el desarrollo de diagnósticos, vacunas y terapias mejoradas contra el SARS. -CoV-2, variantes preocupantes y peligrosos coronavirus humanos que pueden surgir en el futuro ".


Un anticuerpo típico tiene dos sitios de unión a antígenos idénticos

Los anticuerpos más simples son moléculas en forma de Y con dos sitios de unión al antígeno idénticos, uno en la punta de cada brazo de la Y (figura 24-18). Debido a sus dos sitios de unión al antígeno, se describen como bivalente. Siempre que un antígeno tenga tres o más determinantes antigénicos, las moléculas de anticuerpos bivalentes pueden entrecruzarlo en una red grande (figura 24-19). Esta red puede ser rápidamente fagocitada y degradada por macrófagos. La eficacia de la unión y reticulación de antígenos aumenta considerablemente mediante un región bisagra en la mayoría de los anticuerpos, lo que permite que varíe la distancia entre los dos sitios de unión al antígeno (figura 24-20).

Figura 24-18.

Una simple representación de una molécula de anticuerpo. Tenga en cuenta que sus dos sitios de unión al antígeno son idénticos.

Figura 24-19.

Interacciones anticuerpo-antígeno. Debido a que los anticuerpos tienen dos sitios de unión a antígenos idénticos, pueden entrecruzar los antígenos. Los tipos de complejos anticuerpo-antígeno que se forman dependen del número de determinantes antigénicos del antígeno. Aquí una sola especie (más.)

Figura 24-20

La región de bisagra de una molécula de anticuerpo. Debido a su flexibilidad, la región de bisagra mejora la eficacia de la unión y reticulación de antígenos.

El efecto protector de los anticuerpos no se debe simplemente a su capacidad para unirse al antígeno. Participan en una variedad de actividades que están mediadas por la cola de la molécula en forma de Y. Como discutiremos más adelante, los anticuerpos con los mismos sitios de unión al antígeno pueden tener cualquiera de varias regiones de cola diferentes. Cada tipo de región de la cola confiere al anticuerpo diferentes propiedades funcionales, como la capacidad de activar el sistema del complemento, de unirse a las células fagocíticas o de cruzar la placenta de la madre al feto.


Purificación de anticuerpos por fraccionamiento fisicoquímico

Las principales clases de inmunoglobulinas séricas (p. Ej., IgG, IgM) comparten la misma estructura general, incluida la composición general de aminoácidos y las características de solubilidad. Estas propiedades generales son suficientemente diferentes de la mayoría de las otras proteínas abundantes en suero, como la albúmina y la transferrina, por lo que las inmunoglobulinas pueden seleccionarse y enriquecerse basándose en estas propiedades fisicoquímicas diferenciadoras.

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Cromatografía de exclusión por tamaño

Se pueden usar diálisis, desalación y diafiltración para intercambiar anticuerpos en tampones particulares y eliminar componentes de bajo peso molecular (MW) no deseados. Se pueden usar membranas de diálisis, resinas de exclusión por tamaño y dispositivos de diafiltración que presentan cortes de alto peso molecular (MWCO) para separar inmunoglobulinas (& gt140kDa) de pequeñas proteínas y péptidos. Sin embargo, excepto con columnas y equipos especializados, estas técnicas por sí solas no pueden purificar los anticuerpos de otras proteínas y macromoléculas que están presentes en las muestras de anticuerpos típicas. Más comúnmente, la filtración en gel y la diálisis se utilizan después de otros pasos de purificación, como la precipitación con sulfato de amonio (1).

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Precipitación de sulfato de amonio

La precipitación con sulfato de amonio se usa con frecuencia para enriquecer y concentrar anticuerpos del suero, líquido ascítico o sobrenadante de cultivo celular. A medida que aumenta la concentración de esta sal liotrópica en una muestra, las proteínas y otras macromoléculas se vuelven progresivamente menos solubles hasta que precipitan, el efecto liotrópico se denomina "formación de sal". Los anticuerpos precipitan a concentraciones más bajas de sulfato de amonio que la mayoría de las demás proteínas y componentes del suero.

A una saturación de sulfato de amonio del 40 al 50% (100% de saturación equivale a 4,32 M), las inmunoglobulinas precipitarán mientras que otras proteínas permanecen en solución (2). El método habitual implica agregar muy lentamente un volumen igual de solución saturada de sulfato de amonio a una muestra de anticuerpo neutralizado. , seguido de incubación durante varias horas a temperatura ambiente o 4 ° C. Después de la centrifugación y la eliminación del sobrenadante, el sedimento de anticuerpos se disuelve en tampón, como solución salina tamponada con fosfato (PBS).

La selectividad, rendimiento, pureza y reproducibilidad de la precipitación depende de varios factores, incluidos el tiempo, la temperatura, el pH y la velocidad de adición de sal (3). La precipitación con sulfato de amonio proporciona una purificación suficiente para algunas aplicaciones de anticuerpos, pero la mayoría de las veces se realiza como un paso preliminar antes de la cromatografía en columna u otro método de purificación (por ejemplo, Melon Gel Monoclonal IgG Purification Kit). El uso de muestras de anticuerpos parcialmente purificadas puede mejorar el rendimiento y prolongar la vida útil de las columnas de afinidad.

Otros reactivos de precipitación de anticuerpos que se han utilizado para situaciones especiales de purificación de anticuerpos incluyen el uso de ácido octonoico, polietilenglicol y etacridina (3).

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Cromatografía de intercambio de iones

Se han adaptado y optimizado numerosos métodos de cromatografía en fase sólida de base química para lograr la purificación de anticuerpos en situaciones particulares.

La cromatografía de intercambio iónico (IEC) utiliza resinas cargadas positiva o negativamente para unir proteínas en función de sus cargas netas en un sistema tampón (pH) determinado. Especialmente en operaciones comerciales que implican la producción de anticuerpos monoclonales, se pueden determinar condiciones para IEC que se unen y liberen el anticuerpo diana con un alto grado de especificidad. Por el contrario, se pueden encontrar condiciones que se unen a casi todos los demás componentes de la muestra, excepto a los anticuerpos. Una vez optimizado, IEC es un método rentable, suave y confiable para la purificación de anticuerpos.

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Cromatografía de quelatos metálicos inmovilizados

La cromatografía de quelatos metálicos inmovilizados (IMAC) utiliza iones metálicos divalentes inmovilizados con quelato (generalmente níquel, Ni2 +) para unir proteínas o péptidos que contienen grupos de tres o más residuos de histidina consecutivos. La estrategia se usa con mayor frecuencia para purificar proteínas recombinantes que han sido diseñadas para contener una etiqueta de fusión terminal 6xHis. Curiosamente, las IgG de mamíferos son una de las pocas proteínas abundantes en el suero (o en el sobrenadante del cultivo de células de hibridoma monoclonal) que poseen agrupaciones de histidina capaces de unirse mediante níquel inmovilizado. Al igual que con IEC, las condiciones de IMAC para la unión y elución se pueden optimizar para muestras particulares para proporcionar una purificación de anticuerpos suave y confiable (3). Por ejemplo, el kit de purificación de conjugado Pierce utiliza esta técnica para separar el anticuerpo marcado con AP o HRP (conjugado con enzima) del exceso de enzima no conjugada siguiendo un procedimiento de marcado.

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Adsorción tiofílica

La adsorción tiofílica es un tipo altamente selectivo de interacción proteína-ligando que combina las propiedades de la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y la precipitación con sulfato de amonio (el efecto liotrópico). La interacción se denomina tiofílica porque implica la unión de proteínas a un grupo sulfona en las proximidades de un tioéter. A diferencia de la HIC estricta, la adsorción tiofílica depende de una alta concentración de sal liotrópica (p. Ej., Sulfato de potasio en oposición al cloruro de sodio). Con muestras de anticuerpos típicas que se han equilibrado con sulfato de potasio, la unión es bastante específica para los anticuerpos. Después de eliminar por lavado los componentes no unidos, los anticuerpos se recuperan fácilmente con condiciones de elución suaves (por ejemplo, tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH de 7 a 8). El adsorbente tiofílico (también llamado T-Gel) es agarosa en perlas al 6% modificada para contener el ligando sulfona-tioéter. El adsorbente tiene una alta capacidad de unión y una amplia especificidad hacia las imunoglobulinas de varias especies animales. En particular, es uno de los pocos métodos de afinidad que es eficaz para la purificación de IgY de pollo.

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Cromatografía en gel de melón

Melon Gel es una resina química patentada (y un sistema tampón optimizado) para purificar anticuerpos mediante fraccionamiento químico. En la condición de tampón suave especificada, la resina Melon Gel se une a la mayoría de las proteínas no IgG que se encuentran en suero, líquido ascítico y sobrenadantes de cultivo, mientras que permite que la IgG purificada se recoja en la fracción de flujo continuo.

Los diversos kits de Melon Gel están optimizados para una purificación rápida, conveniente y suave de IgG. El kit Melon Gel para la purificación de anticuerpos monoclonales ilustra los beneficios de combinar dos técnicas de purificación. Se recomienda la precipitación con sulfato de amonio para las muestras de sobrenadante de cultivo celular antes de realizar la purificación final en gel de melón. Se recomienda el tratamiento de muestras de líquido ascítico con un reactivo acondicionador antes de la purificación en gel de melón para disminuir la co-purificación de transferrina con el anticuerpo.

Debido a que el sistema Melon Gel utiliza selección negativa y no requiere pasos de elución, también proporciona un método conveniente y eficaz para eliminar la albúmina de suero bovino (BSA) o la gelatina de las soluciones madre de anticuerpos para que estas proteínas estabilizadoras no interfieran con los procedimientos de marcado de anticuerpos. Ésta es la base de nuestro kit de limpieza de anticuerpos.

Si la eliminación específica de un componente de suero indeseable particular puede considerarse una forma de purificación de anticuerpos, entonces es apropiado mencionar aquí la eliminación de albúmina. La albúmina representa aprox. 60% de proteína sérica humana. Cibacron * Blue Dye se une selectivamente a la albúmina de suero humano y puede usarse como ligando de afinidad para preparar muestras de suero sin albúmina para análisis electroforético 2D.

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3-9. Las interacciones antígeno-anticuerpo involucran una variedad de fuerzas

La interacción entre un anticuerpo y su antígeno puede verse alterada por altas concentraciones de sal, pH extremos, detergentes y, a veces, por competencia con altas concentraciones del propio epítopo puro. Por tanto, la unión es una interacción no covalente reversible. Las fuerzas, o enlaces, involucrados en estas interacciones no covalentes se describen en la figura 3.9.

Figura 3.9

Las fuerzas no covalentes que mantienen unido el complejo antígeno: anticuerpo. Las cargas parciales que se encuentran en los dipolos eléctricos se muestran como & # x003b4 + o & # x003b4 -. Las fuerzas electrostáticas disminuyen como el cuadrado inverso de la distancia que separa las cargas, mientras que (más.)

Las interacciones electrostáticas ocurren entre las cadenas laterales de aminoácidos cargados, como en los puentes salinos. Las interacciones también ocurren entre dipolos eléctricos, como en los enlaces de hidrógeno, o pueden involucrar fuerzas de van der Waals de corto alcance. Las altas concentraciones de sal y los extremos de pH interrumpen la unión antígeno-anticuerpo al debilitar las interacciones electrostáticas y / o los enlaces de hidrógeno. Este principio se emplea en la purificación de antígenos utilizando columnas de afinidad de anticuerpos inmovilizados y viceversa para la purificación de anticuerpos (véase el Apéndice I, Sección A-5). Las interacciones hidrofóbicas ocurren cuando dos superficies hidrofóbicas se unen para excluir el agua. La fuerza de una interacción hidrofóbica es proporcional al área de la superficie que está oculta al agua. Para algunos antígenos, las interacciones hidrofóbicas probablemente representan la mayor parte de la energía de enlace. En algunos casos, las moléculas de agua quedan atrapadas en bolsas en la interfaz entre el antígeno y el anticuerpo. Estas moléculas de agua atrapadas también pueden contribuir a la unión, especialmente entre los residuos de aminoácidos polares.

La contribución de cada una de estas fuerzas a la interacción general depende del anticuerpo y antígeno particular involucrados. Una diferencia notable entre las interacciones de los anticuerpos con los antígenos proteicos y la mayoría de las demás interacciones naturales entre proteínas y proteínas es que los anticuerpos poseen muchos aminoácidos aromáticos en sus sitios de unión al antígeno. Estos aminoácidos participan principalmente en interacciones de van der Waals e hidrofóbicas y, a veces, en enlaces de hidrógeno. En general, las fuerzas hidrófobas y de van der Waals operan en rangos muy cortos y sirven para unir dos superficies que son de forma complementaria: las colinas en una superficie deben encajar en valles en la otra para que se produzca una buena unión. Por el contrario, las interacciones electrostáticas entre las cadenas laterales cargadas y los enlaces de hidrógeno que unen los átomos de oxígeno y / o nitrógeno, acomodan características específicas o grupos reactivos mientras fortalecen la interacción en general.

Por ejemplo, en el complejo de lisozima de clara de huevo de gallina con el anticuerpo D1.3 (figura 3.10), se forman fuertes enlaces de hidrógeno entre el anticuerpo y una glutamina particular en la molécula de lisozima que sobresale entre el VH y VL dominios. Las lisozimas de la perdiz y el pavo tienen otro aminoácido en lugar de la glutamina y no se unen al anticuerpo. En el complejo de alta afinidad de lisozima de clara de huevo de gallina con otro anticuerpo, HyHel5 (véase la figura 3.8c), dos puentes salinos entre dos argininas básicas en la superficie de la lisozima interactúan con dos ácidos glutámico, uno de cada uno del VH Bucles CDR1 y CDR2. Nuevamente, las lisozimas que carecen de uno de los dos residuos de arginina muestran una disminución de 1000 veces en la afinidad. Aunque la complementariedad global de la superficie debe desempeñar un papel importante en las interacciones antígeno-anticuerpo, las interacciones electrostáticas y de enlace de hidrógeno específicas parecen determinar la afinidad del anticuerpo. En la mayoría de los anticuerpos que se han estudiado con este nivel de detalle, solo unos pocos residuos hacen una contribución importante a la energía de unión. La ingeniería genética mediante mutagénesis dirigida al sitio puede adaptar aún más la unión de un anticuerpo a su epítopo complementario.

Figura 3.10

El complejo de lisozima con el anticuerpo D1.3. Se muestra la interacción del fragmento Fab de D1.3 con lisozima de clara de huevo de gallina, con la lisozima en azul, la cadena pesada en violeta y la cadena ligera en amarillo. Se muestra un residuo de glutamina de lisozima (más.)


Análisis inmunoquímico comparativo de las estructuras antigénicas de la proteína HU de tipo histona de unión al ADN de Escherichia coli e histonas eucariotas

Las estructuras antigénicas generales de la proteína HU de unión al ADN de E. coli, las histonas H1, H2A, H2B, H3 y H4 del timo de ternero y la histona H5 de eritrocitos de pollo se compararon en inmunoensayos con la ayuda de anticuerpos policlonales monoespecíficos contra el Proteína HU e histonas individuales. Se demostró una reacción cruzada parcial entre la proteína HU y los anticuerpos contra las histonas H1 y H5. Los títulos de reacción obtenidos en un inmunoensayo enzimático en fase sólida indicaron que las reacciones cruzadas fueron equivalentes al 30% de la reacción con antígeno homólogo para anticuerpos de H1, y al 20% y 12% (al diluir la proteína HU en soluciones de baja concentración). y alta fuerza iónica, respectivamente) de la reacción con el antígeno homólogo para los anticuerpos de H5. No se detectaron reacciones cruzadas entre los anticuerpos de la proteína HU y las histonas H1, H5, H2A, H2B, H3 y H4. Sugerimos que la semejanza entre las estructuras antigénicas generales de la proteína HU de unión al ADN de E. coli y las histonas enlazadoras ricas en lisina H1 y H5 refleja la estructura de los sitios de unión entre estas proteínas y el ADN, que presumiblemente tienen un ADN similar. -patrón de unión y un papel funcional similar.


Cinética de interacción anticuerpo-antígeno

La asociación específica de antígenos y anticuerpos depende de enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas, fuerzas electrostáticas y fuerzas de Van der Waals. Estos son de naturaleza débil, no covalente, sin embargo, algunas de las asociaciones entre el antígeno y el anticuerpo pueden ser bastante fuertes. Al igual que los anticuerpos, los antígenos pueden ser multivalentes, ya sea mediante múltiples copias del mismo epítopo o mediante la presencia de múltiples epítopos que son reconocidos por múltiples anticuerpos. Las interacciones que implican la multivalencia pueden producir complejos más estabilizados, sin embargo, la multivalencia también puede resultar en dificultades estéricas, reduciendo así la posibilidad de unión. Toda la unión del anticuerpo antígeno es reversible y sigue los principios termodinámicos básicos de cualquier interacción bimolecular reversible: donde KA es la constante de afinidad, [Ab-Ag] es la concentración molar del complejo anticuerpo-antígeno, y [Ab] y [Ag] son las concentraciones molares de los sitios de unión desocupados en el anticuerpo (Ab) o el antígeno (Ag), respectivamente.

El tiempo necesario para alcanzar el equilibrio depende de la velocidad de difusión y la afinidad del anticuerpo por el antígeno y puede variar ampliamente. La constante de afinidad para la unión anticuerpo-antígeno puede abarcar un amplio intervalo, que se extiende desde menos de 105 / mol hasta más de 1012 / mol. Las constantes de afinidad pueden verse afectadas por la temperatura, el pH y el disolvente. Las constantes de afinidad se pueden determinar para los anticuerpos monoclonales, pero no para los anticuerpos policlonales, ya que tienen lugar múltiples formaciones de enlaces entre los anticuerpos policlonales y sus antígenos. Se pueden realizar mediciones cuantitativas de la afinidad del anticuerpo por el antígeno mediante diálisis de equilibrio. Las diálisis de equilibrio repetidas con una concentración de anticuerpo constante, pero una concentración de ligando variable, se utilizan para generar gráficos de Scatchard, que proporcionan información sobre la valencia de afinidad y la posible reactividad cruzada.

Al diseñar procedimientos experimentales, es importante diferenciar entre anticuerpos monoclonales y policlonales, ya que estas diferencias son la base tanto de las ventajas como de las limitaciones de su uso.


Cambio de clase de isotipo

El cambio de clase de isotipo es un mecanismo biológico que cambia la producción de anticuerpos de una célula B de una clase a otra.

Objetivos de aprendizaje

Describir el proceso de recombinación de cambio de clase que resulta en cambios en la cadena pesada de anticuerpos.

Conclusiones clave

Puntos clave

  • El isotipo de anticuerpo de una célula B cambia durante el desarrollo y activación celular. Las células B inmaduras nunca han estado expuestas a un antígeno y se conocen como células B vírgenes. Las células B comienzan a expresar tanto IgM como IgD cuando alcanzan la madurez y hacen que las células B sean & # 8216maduras & # 8217 y estén listas para responder al antígeno.
  • Si las células B activadas encuentran moléculas de señalización específicas a través de sus receptores CD40 y de citocinas (ambos modulados por células T colaboradoras), se someten a un cambio de clase de anticuerpos para producir anticuerpos IgG, IgA o IgE que tienen funciones definidas en el sistema inmunológico.
  • Durante la recombinación de cambio de clase, la porción de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo cambia, pero la región variable de la cadena pesada permanece igual, por lo que el cambio de clase no afecta la especificidad del antígeno.
  • El anticuerpo conserva afinidad por los mismos antígenos, pero puede interactuar con diferentes moléculas efectoras. Esto permite que diferentes células hijas de la misma célula B activada produzcan anticuerpos de diferentes isotipos o subtipos (por ejemplo, IgG1, IgG2, etc.).

Términos clave

  • isotipo: Los anticuerpos pueden venir en diferentes variedades conocidas como isotipos, que se refieren a las variaciones genéticas o diferencias en las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.
  • recombinación de cambio de clase: A biological mechanism that changes a B cell’s production of antibody from one class to another for example, from an isotype called IgM to an isotype called IgG.

Isotype Class Switching

Antibodies can come in different varieties, known as isotypes or classes. In placental mammals there are five antibody isotypes: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM. They are each named with an “Ig” prefix that stands for immunoglobulin (another name for antibody) and differ in their biological properties, functional locations, and ability to deal with different antigens.

The antibody isotype of a B cell changes during cell development and activation. Immature B cells, which have never been exposed to an antigen, are known as naïve B cells and express only the IgM isotype in a cell surface bound form. B cells begin to express both IgM and IgD when they reach maturity the co-expression of both of these immunoglobulin isotypes renders the B cell ‘mature’ and ready to respond to an antigen. B cell activation follows engagement of the cell-bound antibody molecule with an antigen, causing the cell to divide and differentiate into an antibody-producing cell, called a plasma cell. In this activated form, the B cell starts to produce antibody in a secreted form rather than a membrane-bound form. If these activated B cells encounter specific signaling molecules via their CD40 and cytokine receptors (both modulated by T helper cells), they undergo antibody class switching to produce IgG, IgA or IgE antibodies (from IgM or IgD) that have defined roles in the immune system.

Immunoglobulin class switching (or isotype switching, or isotypic commutation, or class switch recombination (CSR)) is a biological mechanism that changes a B cell’s production of antibody from one class to another for example, from an isotype called IgM to an isotype called IgG. During this process, the constant region portion of the antibody-heavy chain is changed, but the variable region of the heavy chain stays the same (the terms “constant” and “variable” refer to changes or lack thereof between antibodies that target different epitopes). Since the variable region does not change, class switching does not affect antigen specificity. Instead, the antibody retains affinity for the same antigens, but can interact with different effector molecules. This allows different daughter cells from the same activated B cell to produce antibodies of different isotypes or subtypes (e.g. IgG1, IgG2 etc.).

Class switching occurs by a mechanism called class switch recombination (CSR) binding. Class switch recombination is a biological mechanism that allows the class of antibody produced by an activated B cell to change during a process known as isotype or class switching. During CSR, portions of the antibody-heavy chain locus are removed from the chromosome, and the gene segments surrounding the deleted portion are rejoined to retain a functional antibody gene that produces antibody of a different isotype. Double-stranded breaks are generated in DNA at conserved nucleotide motifs, called switch (S) regions, which are upstream from gene segments that encode the constant regions of antibody-heavy chains these occur adjacent to all heavy chain constant region genes with the exception of the δ-chain. DNA is nicked and broken at two selected S-regions by the activity of a series of enzymes, including Activation-Induced (Cytidine) Deaminase (AID), uracil DNA glycosylase and apyrimidic/apurinic (AP)-endonucleases. The intervening DNA between the S-regions is subsequently deleted from the chromosome, removing unwanted μ or δ heavy chain constant region exons and allowing substitution of a γ, α or ε constant region gene segment. The free ends of the DNA are rejoined by a process called non-homologous end joining (NHEJ) to link the variable domain exon to the desired downstream constant domain exon of the antibody-heavy chain. In the absence of non-homologous end joining, free ends of DNA may be rejoined by an alternative pathway biased toward microhomology joins. With the exception of the μ and δ genes, only one antibody class is expressed by a B cell at any point in time.

Class Switch Recombination: Mechanism of class switch recombination that allows isotype switching in activated B cells.