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Regulación del ciclo de TCA y glucólisis por nucleótidos de adenina

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¿Por qué el ciclo del ácido tricarboxílico está regulado por la relación ADP / ATP como se indica en la siguiente cita?

La isocitrato deshidrogenasa es estimulada alostéricamente por ADP, que mejora la afinidad de la enzima por los sustratos.1

mientras que la glucólisis está regulada por la relación AMP / ATP como en la siguiente cita del mismo libro:

¿Por qué es AMP y no ADP el regulador positivo de la fosfofructoquinasa? Cuando el ATP se utiliza rápidamente, la enzima adenilato quinasa (sección 9.4) puede formar ATP a partir de ADP mediante la siguiente reacción: 2

Quiero verificar mi hipótesis de que se debe a que el ciclo de TCA necesita acetil-CoA (que puede provenir de la glucólisis y otras fuentes como la beta-oxidación de ácidos grasos) para funcionar, por lo que obtiene acetil-CoA de muchas fuentes y no depende solo de la glucólisis, y es por eso que se ve afectado por el ADP (que aumenta con el ejercicio inicial) mientras que el AMP estimula la glucólisis (aumenta después de más ejercicio) para dar más acetil-CoA y esa tasa del ciclo de TCA es más rápida que la glucólisis. ?

Referencias

1,2 J.M. Berg et al. (2002). Bioquímica, 5ª ed. Nueva York: A H Freeman.


Resumen

La glucólisis y el ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo TCA) son procesos distintos que no están necesariamente vinculados secuencialmente. Por lo tanto, no es sorprendente que sus modos de regulación no sean idénticos y, de hecho, impliquen una regulación mucho más compleja que la mencionada en la pregunta. El uso de AMP en lugar de ADP como sensor de déficit energético depende de la acción de la adenilato quinasa, que puede diferir entre el citoplasma y las mitocondrias.

Relación entre la glucólisis y el ciclo de TCA

La expectativa evidente en la pregunta de que la glucólisis y el ciclo de TCA deben controlarse exactamente de la misma manera supone que los dos procesos están inextricablemente vinculados o al menos que el funcionamiento del ciclo de TCA depende del de la glucólisis. Este no es el caso, aunque se puede disculpar al estudiante por esta mala impresión de la forma (quizás inevitable) en que los temas se tratan generalmente de forma secuencial en los libros de texto de bioquímica.

La función principal de glucólisis es producir ATP directamente a partir de ADP. El producto final de la vía, el piruvato, se convierte en algunas circunstancias en acetil CoA para el ciclo de TCA, y el NADH generado se utiliza para la producción de ATP a través de la cadena de transporte de electrones (etc.) y la fosforilación oxidativa. Sin embargo, el piruvato tiene una variedad de otros destinos posibles según el tipo de organismo o, en organismos superiores, el tejido y sus requisitos metabólicos generales. Por ejemplo, en el metabolismo anaeróbico, incluido el ejercicio del tejido muscular mencionado en el cartel, el piruvato puede verse reducido por reacciones que regeneran NAD.+ de NADH, p. ej. conversión a lactato. Puede servir como precursor de los aminoácidos alanina, valina y leucina. También se puede convertir en la reacción catalizada por la carboxilasa pirúvica en oxaloacetato, el intermedio clave que permite que la acetil CoA entre en el ciclo del TCA. La importancia de la síntesis directa de oxaloacetato de esta manera es que permite la continuación del ciclo cuando se utilizan productos intermedios con fines sintéticos (discutidos a continuación), en cuyo caso el oxaloacetato se agota.

En cuanto a la Ciclo de TCA, existen fuentes de acetil CoA distintas del piruvato producido por glucólisis, y tiene funciones distintas a la generación de energía. El acetil CoA puede surgir de la descomposición de ácidos grasos y de ciertos aminoácidos. En los organismos multicelulares, el piruvato también se puede producir a partir del lactato extraído de la sangre, aunque en las células hepáticas es probable que se utilice para la gluconeogénesis. Y ciertas bacterias, bacterias del ácido acético como Acetobacter, pueden utilizar el etanol producido por fermentación en el ciclo del TCA. Además de su función en la generación de energía, algunos de sus intermediarios (α-cetoglutarato, succinil CoA y oxaloacetato) son precursores de vías biosintéticas, y la producción de citrato a partir de acetil CoA es un medio para transferir este último fuera de la mitocondria, donde se reconvierte en acetil CoA por la enzima de escisión del citrato (ATP citrato liasa).

Por lo tanto, no es sorprendente que haya diferencias en la regulación de la glucólisis y el ciclo de TCA y, de hecho, que habrá diferencias entre diferentes organismos, algo que generalmente no se menciona en los textos elementales.

Regulación de la glucólisis

La función principal de la glucólisis es la generación directa de ATP ("a nivel de sustrato"), y el flujo de glucosa a través de él está controlado por los efectos reguladores de ATP (-ve) y AMP (+ ve) sobre la fosfofructoquinasa, que fue establecido y racionalizado por DE Atkinson (Biochemistry 1968, 7, 11, 4030-4034) en términos de una respuesta a la carga total de energía del sistema.

Esto surge de la capacidad de la adenilato quinasa para reconvertir ADP en ATP:

2ADP → ATP + AMP

[de Atkinson y Walton (1967) J. Biol. Chem. 242 3239-3241]

Se puede ver que AMP es un indicador mucho mejor de carga de baja energía que ADP en las circunstancias representadas por el gráfico anterior.

El citrato también es un efector negativo de la enzima, que coordina la glucólisis y el ciclo del TCA. (La regulación hormonal a través de la fosforilación de proteínas se produce en los tejidos de eucariotas superiores).

Regulación de la conversión de piruvato en acetil CoA

Para entrar en el ciclo del TCA, el complejo de piruvato deshidrogenasa debe convertir el piruvato en acetil CoA. La regulación de esta enzima determina hasta qué punto esto ocurre y, por tanto, hasta qué punto el piruvato es metabolizado por otros procesos. Los reguladores negativos aquí son altas concentraciones de los productos de reacción, acetil CoA y NADH, aunque en eucariotas superiores es importante la fosforilación de proteínas inducida hormonalmente.

Regulación del ciclo TCA

Luego, la primera enzima reguladora del ciclo del TCA, la isocitrato deshidrogenasa, responde a la concentración de las moléculas clave involucradas en la fosforilación oxidativa: es estimulada por ADP y +e inhibido por ATP y NADH. Vale la pena reflexionar sobre las consecuencias de la inhibición. Si se produce una acumulación de citrato, esto puede retroalimentar e inhibir la fosfofructoquinasa en la glucólisis. Sin embargo, el citrato puede moverse al citoplasma de los eucariotas y convertirse en acetil CoA (para la síntesis de ácidos grasos) por la enzima de escisión del citrato, que es estimulada por ATP e inhibida por ADP.

Una etapa reguladora posterior es la α-cetoglutarato deshidrogenasa, que es inhibida por ATP, NADH y su producto, succinil CoA. La inhibición de esta enzima permitiría la acumulación de α-cetoglutarato, que es un precursor de varios aminoácidos.

Esta la existencia de varios pasos reguladores en la oxidación del piruvato y el ciclo del TCA permite el uso del ciclo tanto para la generación de energía como como fuente de precursores sintéticos. Por lo tanto, debería ser evidente por qué su control es similar al de la glucólisis en algunos aspectos, pero presenta diferencias clave.

[Iceberg et al. Bioquímica 5.a ed, Figura 17.18]

Pero, ¿por qué el AMP no es una molécula reguladora del ciclo del TCA?

La glucólisis y el ciclo del TCA no necesitan marchar al mismo tiempo, aunque cuando ambos responden a la necesidad de ATP, sus enzimas clave están reguladas por nucleótidos de adenina, entre otras moléculas. La pregunta original (o una modificación de la misma) sigue siendo por qué el AMP es un efector positivo de la fosfofructoquinasa, pero no de la isocitrato deshidrogenasa, que responde al ADP. Es interesante que en la sección de Berg et al. Al discutir el concepto de carga de energía, se agrega un ciclista bastante cojo sin más explicación sobre el efecto de que la relación ATP / ADP también puede actuar como un índice del estado energético.

No lo sé con certeza, pero sospecha que las condiciones bajo las cuales la ecuación de Atkinson para la carga de energía es válida no se mantienen en la mitocondria. Esto es apoyado por Sobol et al. (1978) Eur J. Biochem. 87 377-390 que encontraron concentraciones de AMP en las mitocondrias de hígado de rata mucho más bajas de lo que se esperaría del equilibrio con ATP y ADP a través de la reacción de adenilato quinasa. Ellos sugirieron que una reacción adicional de AMP con GTP en la mitocondria podría ser responsable y también citaron informes de que la adenilato quinasa estaba ausente en la matriz de las mitocondrias de hígado de rata. Al menos en el hígado de rata, esto explicaría que el AMP no sería una molécula reguladora útil, mientras que la relación ATP / ADP sería indicativa del requisito de fosforilación oxidativa.


Fronteras en fisiología

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Abstracto

El interés en el tema del metabolismo tumoral ha aumentado y disminuido durante el último siglo de investigación sobre el cáncer. Las primeras observaciones de Warburg y sus contemporáneos establecieron que existen diferencias fundamentales en las vías metabólicas centrales que operan en el tejido maligno. Sin embargo, las hipótesis iniciales que se basaron en estas observaciones resultaron inadecuadas para explicar la tumorigénesis, y la revolución oncogénica empujó el metabolismo tumoral al margen de la investigación del cáncer. En los últimos años, el interés se ha renovado ya que ha quedado claro que muchas de las vías de señalización que se ven afectadas por mutaciones genéticas y el microambiente tumoral tienen un profundo efecto en el metabolismo central, haciendo de este tema una vez más una de las áreas de investigación más intensas. en biología del cáncer.


Ciclo de Krebs: activadores, inhibidores y su papel en la modulación de la carcinogénesis

Una característica metabólica fundamental de los tejidos cancerosos es el alto consumo de glucosa. La tasa de consumo de glucosa en una célula cancerosa puede ser de 10 a 15 veces mayor que en las células normales. El aislamiento y el cultivo de células tumorales in vitro destacan las propiedades asociadas con la utilización intensiva de glucosa, la presencia de un metabolismo oxidativo mínimo, un aumento de las concentraciones de lactato en el medio de cultivo y una tasa reducida de consumo de oxígeno. Aunque la glucólisis se sugiere como una característica general de las células malignas y recientemente se identificó como un posible factor que contribuye a la progresión del tumor, varios estudios destacan características metabólicas distintas en algunos tumores, incluida una disminución relativa de la avidez en comparación con la glucosa y / o la glutamina dependiente del lactato e incluso células tumorales proliferativas. El objetivo de esta revisión es determinar las particularidades en el metabolismo energético de las células cancerosas, centrándose en los principales sustratos nutricionales, como la glucosa y la glutamina, evaluando la lactato deshidrogenasa como posible marcador de malignidad y estimando activadores e inhibidores en el tratamiento del cáncer.

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Oncogenes y supresores de tumores que inciden en el ciclo de TCA

Las alteraciones genéticas y / o desregulaciones de los supresores de tumores u oncogenes a menudo impulsan la reprogramación metabólica en los cánceres, aunque este efecto puede diferir según las alteraciones o desregulaciones específicas y, a menudo, depende del contexto. Varios oncogenes, incluidos MI C, HIF, P53, y RAS, se sabe que regulan el fenotipo metabólico de los tumores y desempeñan un papel fundamental en la determinación de cómo se utiliza el ciclo de TCA en estas células cancerosas.

El protooncogén MI C controla una amplia gama de procesos celulares, incluida la proliferación celular, el metabolismo, la diferenciación celular y la inestabilidad genómica, y es un impulsor dominante de la transformación y progresión tumoral (Meyer y Penn, 2008). La actividad aberrante de MYC, resultante de translocaciones cromosómicas, amplificaciones de genes o mayor estabilidad de ARNm / proteínas, se encuentra en más de la mitad de todos los cánceres humanos (Gabay et al., 2014). Es importante destacar que MYC es un regulador central del metabolismo celular y puede promover una amplia gama de vías metabólicas, como la glucólisis aeróbica, la glutaminólisis, la biogénesis mitocondrial, la fosforilación oxidativa y la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos (Adhikary y Eilers, 2005 Gabay et al. , 2014 Wahlstrom y Henriksson, 2015). Como se indicó al principio de este artículo de revisión, MYC activa transcripcionalmente genes y enzimas clave que regulan la glutaminólisis y actúa como el principal impulsor del metabolismo de la glutamina a través del ciclo de TCA (es decir, anaplerosis de glutamina). Específicamente, para promover la importación de glutamina en la célula, MYC transcripcionalmente regula al alza los transportadores de glutamina, el transportador de aminoácidos ASC 2 (ASCT2) y el transportador del sistema N (SN2). Además, Gao et al. demostraron que MYC controla la conversión de glutamina en glutamato activando la glutaminasa 1 (GLS1) mediante la supresión transcripcional de su regulador negativo miR-23a / b (Wise et al., 2008 Gao et al., 2009). Hay dos vías independientes que controlan la conversión de glutamato en α-KG que ingresa al ciclo de TCA: una controlada por GLUD y otra por aminotransferasas. Las células cancerosas dependientes de MYC pueden utilizar GLUD o aminotransferasas para convertir glutamina en α-KG para el ciclo de TCA (Wise et al., 2008 Wang et al., 2011). MYC también puede desempeñar un papel en la dirección de la oxidación de los ácidos grasos y sus metabolitos en el ciclo de TCA por medio de acetil-CoA. Específicamente, la expresión de MYC conduce a la regulación positiva de los transportadores de ácidos grasos (p. Ej., La proteína de unión a ácidos grasos 4) y genes de oxidación de ácidos grasos como la hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (Wang et al., 2011 Edmunds et al., 2015).

Los factores inducibles por hipoxia (HIF) son factores de transcripción que responden a la disponibilidad reducida de oxígeno. Los HIF son heterodímeros compuestos por una subunidad α dependiente de oxígeno y una subunidad β expresada de manera constitutiva. En normoxia, la subunidad α se dirige a la degradación tras la hidroxilación por prolil hidroxilasas (PHD) y la ubiquitinación posterior por el supresor de tumores de von Hippel-Lindau (VHL). Los tumores activan el HIFα ante la hipoxia resultante de una vascularización deficiente o debido a una abrogación genética como BVS pérdida (Gordan y Simon, 2007). La activación de HIF organiza un programa metabólico que promueve el catabolismo de la glucosa a través de la glucólisis aeróbica y, por lo tanto, aleja la glucosa del ciclo de TCA (Semenza, 2012). El HIF promueve la glucólisis y la producción de lactato a través de la regulación positiva transcripcional de los transportadores de glucosa (SLC2A1 y SLC2A3), enzimas glucolíticas (p. Ej., Hexoquinasa (HK) y piruvato quinasa (PK)) y lactato deshidrogenasa A (LDHA) (Kim et al., 2006) . Kim y col. demostraron que HIF1 suprime el metabolismo de la glucosa a través del ciclo del TCA (es decir, la anaplerosis de la glucosa) activando directamente la piruvato deshidrogenasa quinasa 1 (PDK-1), un regulador negativo del ciclo de la enzima piruvato deshidrogenasa (PDH) (Kim et al., 2006). Para compensar la reducción de glucosa que alimenta el ciclo de TCA, las células tumorales con activación de HIF a menudo aumentan el uso de glutamina (Le et al., 2012). En condiciones de hipoxia, la glutamina alimenta en gran medida el ciclo de TCA en forma de α-KG para promover la carboxilación reductora que produce citrato para la lipogénesis (Wise et al., 2008 Metallo et al., 2011 Gameiro et al., 2013).

P53 es un factor de transcripción y supresor de tumores conocido que regula muchas vías celulares importantes, incluida la supervivencia celular, la reparación del ADN, la apoptosis y la senescencia (Bensaad et al., 2009). El P53 de tipo salvaje juega un papel importante en el metabolismo al lograr un equilibrio entre la bioenergética y la biosíntesis. Una de las formas en que lo hace es reduciendo las tasas de glucólisis y promoviendo la fosforilación oxidativa. P53 actúa para suprimir la glucólisis regulando directamente a la baja los transportadores de glucosa (GLUT1 y GLUT4) e inhibiendo indirectamente la actividad de las enzimas glucolíticas, fosfofructoquinasa 1 (PFK1) y fosfoglicerato mutasa (Kondoh et al., 2005 Bensaad et al., 2006, 2009 Zhang et al. ., 2013). Para promover la fosforilación oxidativa, P53 asegura la disponibilidad de sustratos anapleuróticos, glucosa y glutamina, para el ciclo de TCA. Como activador de PDH, P53 regula negativamente el regulador negativo PDK2 de PDH y activa indirectamente PDHA1 (subunidad PDH A1). Además, P53 promueve la incorporación de glutamina en el TCA a través de la regulación positiva transcripcional directa de la glutaminasa 2 (GLS2) (Zhang et al., 2011 Contractor y Harris, 2012). En tumores sólidos, P53 es comúnmente mutaciones somáticas y mutadas de P53 ocurren en más del 50% de las neoplasias malignas humanas (Kruiswijk et al., 2015). Posteriormente, la pérdida de la función de P53 de tipo salvaje tiene un impacto significativo en el metabolismo celular, lo que conduce a una glucólisis mejorada y una fosforilación oxidativa reprimida en estas células tumorales.

El mutado con más frecuencia RAS Los genes de la subfamilia del cáncer son KRAS, NRAS, y HRAS, que sirven como moléculas de señalización intercelular para transducir la señalización extracelular del receptor tirosina quinasa a los efectores posteriores (Pylayeva-Gupta et al., 2011 Stephen et al., 2014). RAS juega un papel fundamental en la activación de las vías de eliminación en ciertos tipos de tumores y promueve la absorción de nutrientes a través de fuentes extracelulares e intracelulares (Pylayeva-Gupta et al., 2011 Stephen et al., 2014). Por ejemplo, Kamphorst et al. demostró que KRASLas células pancreáticas impulsadas por el virus extraen proteínas, como la glutamina, del espacio extracelular y las utilizan para alimentar el ciclo del TCA (Kamphorst et al., 2015). Además, se ha demostrado que KRASLas células de cáncer de pulmón de células no pequeñas impulsadas por las células madre utilizan la autofagia para acceder a los suministros intracelulares de glutamina para promover la función del ciclo de TCA (Guo et al., 2011 Strohecker y White, 2014). Es más, KRASLas células cancerosas impulsadas por las células madre pueden eliminar los aminoácidos de cadena ramificada (es decir, isoleucina, valina y leucina) y convertirlos en acetil-CoA para alimentar el ciclo del TCA (Mayers et al., 2014). Un estudio reciente de Kerr et al. demostró que la ganancia de número de copias de mutantes KRAS asociado con la progresión del tumor puede promover la anaplerosis de la glucosa para alimentar el ciclo de TCA (Kerr et al., 2016).


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PLANIFICACIÓN ESTRATÉGICA

Los programas para HPLC con la columna Hyperclone C18 (ODS) y el lector de placas deben estar preparados para la medición antes de comenzar.

  • Columna para HPLC: columna Hyperclone C18 (ODS) (Phenomenex)
  • Tasa de flujo gradiente 0,8 ml / min (50 min / muestra)
    • ○ Equilibrio 0-0,2 min: 95% de tampón A: 5% de tampón B
    • ○ 0,2-53 min (gradiente lineal): hasta 50% de tampón B
    • ○ Recalibración: 7 min con tampón B al 5%

    2. Lector de microplacas (por ejemplo, Biotek EL 808 con filtro de 570 nm)

    1: PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL PARA LA MEDICIÓN

    Tanto el adenilato como el nucleótido de pirimidina actúan como "moneda" dentro de las células vivas y desempeñan un papel importante en la regulación del crecimiento y desarrollo de las plantas (Gakière, Fernie y Pétriacq, 2018 Geigenberger, Riewe y Fernie, 2010). Aunque varias publicaciones utilizan diferentes enfoques para la medición de nucleótidos de adenilato y pirimidina, no existe un protocolo detallado para la medición de estos compuestos en plantas. A continuación, presentamos protocolos detallados para el muestreo y extracción de plántulas, hojas o raíces enteras. Debido a las tasas de rotación extremadamente altas de los nucleótidos de adenilato y pirimidina (hasta milisegundos), el material vegetal debe cosecharse lo más rápido posible y luego congelarse instantáneamente, idealmente utilizando la técnica de sujeción por congelación (Ap Rees, Fuller y Wright , 1977). Cuando se trabaja con hojas, es importante enfriar las muestras directamente a la luz y no alterar la irradiancia incidente a través del sombreado. Dada la inestabilidad de estos metabolitos, los materiales vegetales deben congelarse a –80 ° C durante no más de 1 año. Aquí, usamos hojas de Arabidopsis como ejemplo.

    Materiales

    • Material vegetal
    • Nitrógeno líquido
    • Tubos de microcentrífuga de 2 ml
    • Tubos Safe-Lock de 1,5 ml
    • Molino de bolas (Retsch)
    • Equilibrio

    1. Coseche alrededor de 100 mg de Arabidopsis u otro material de hoja vegetal en un tubo de 2,0 ml y congélelo en nitrógeno líquido.

    2. Homogeneizar el material vegetal en un molino de bolas agregando una bola de metal limpia y preenfriada al material de la hoja, y triturar durante 30-45 sa velocidad media.

    3. Transfiera alícuotas de aproximadamente 25 mg (± 2 mg) a nuevos tubos de 1,5 ml y registre el peso exacto.

    4. Si los análisis no se pueden realizar inmediatamente, almacene las muestras a –80 ° C hasta la medición.

    2: MEDICIÓN DE ATP, ADP Y AMP MEDIANTE HPLC

    Como la "unidad molecular de moneda" de la transferencia de energía intracelular, el ATP es un metabolito que proporciona energía a múltiples procesos en la célula viva, incluida la síntesis de proteínas, la síntesis química, el metabolismo, la división celular y los procesos de transporte. Puede convertirse en ADP o AMP cuando se consume en células vivas. La medición de ATP, ADP y AMP se ha descrito en varios artículos (Liang et al., 2016 Pham et al., 2015 Zhang et al., 2018 Zhu et al., 2019), pero los protocolos detallados no están disponibles. Aquí, describimos en detalle el proceso de medición de ATP, ADP y AMP en muestras de plantas (Fig. 1).

    Materiales

    • Sal disódica de ATP trihidrato (Sigma-Aldrich 10519987001)
    • ADP (Sigma-Aldrich 01905)
    • Sal disódica de AMP (Sigma-Aldrich 01930)
    • Muestra: material de hoja de Arabidopsis preparado como en el Protocolo básico 1
    • HCl 0,1 M
    • Tampón CP (ver Tabla 1)
    • Cloroacetaldehído (Sigma-Aldrich 317276-5 ml ¡ALTAMENTE TÓXICO!)
    • Adenosina (Sigma-Aldrich A9251)
    • Ejecución de tampón A para HPLC (consulte la Tabla 2)
    • Ejecución del tampón B para HPLC (consulte la Tabla 3)
    • Centrífuga refrigerada
    • Agitador calentado
    • Viales de vidrio para HPLC
    • Columna Hyperclone C18 (ODS) (Phenomenex)
    • Sistema de HPLC (Dionex)

    Ajuste el pH a 4 con NaOH.

    Reactivo Fuente Conc final. Por 10 ml Por 25 ml
    Ácido cítrico monohidrato, 1 M Comúnmente disponible 62 mM 0,62 ml 1,55 ml
    (N / A)2HPO4· 2H2O, 1 M Comúnmente disponible 76 mM 0,76 ml 1,90 ml
    Agua 8,62 ml 21,55 ml

    Ajuste el pH a 4 con NaOH.

    Ajuste el pH a 5,8 con KOH.

    Reactivo Fuente Conc final. Por 2 L Por 5 L
    Hidrógeno sulfato de tetrabutilamonio (TBAS) Sigma 155837 5,7 mM 3,87 g 9,68 g
    KH2correos4 Roth 3904.2 30,5 mM 8,30 g 20,76 g

    Ajuste el pH a 5,8 con KOH.

    Reactivo Fuente Conc final. Por 2 L Por 5 L
    Acetonitrilo, grado HPLC Comúnmente disponible 67% 1340 ml 3350 ml
    Ejecución de búfer A Ver tabla 2 33% 660 ml 1650 ml

    Preparación de estándares de adenilato para la medición (siempre prepárelos frescos inmediatamente antes de la medición)

    1. Pese por separado cantidades definidas de AMP, ADP y ATP en polvo para obtener soluciones de 100 mM. Diluir estas soluciones a 1 mM y luego a 100 µM usando HCl 0.1 M.

    2. Tome una cantidad igual de cada una de las soluciones 100 µM de los tres compuestos para obtener soluciones mixtas 25, 12.5, 6.25 y 3.125 µM de los tres compuestos juntos.

    3. También prepare soluciones separadas de 25, 12,5, 6,25 y 3,125 µM de cada uno de los tres compuestos individuales.

    4. Tomar 15 µl de cada una de las diferentes concentraciones de solución mezclada y cada estándar individual a diferentes concentraciones en un nuevo tubo de 1,5 ml y mantener en hielo para la medición de HPLC.

    Medición de ATP, ADP y AMP mediante HPLC

    5. Agregue 200 µl de HCl 0.1 M a una alícuota de 25 mg del material foliar de Arabidopsis en un tubo de 1.5 ml, preparado como en el Protocolo básico 1, paso 3, y agite en vórtex durante 15 s antes de poner en hielo durante 30 s . Repita la agitación con vórtex durante 15 s, luego centrifugue 10 min a 12,000 × gramo, 4 ° C.

    6. Tomar 15 µl del sobrenadante para la medición por HPLC.

    7. Diluir los 15 µl de extracto de planta del paso 6 (muestra) y cada una de las alícuotas de 15 µl de mezclas estándar / estándares individuales a diferentes concentraciones (paso 4) con 77 µl de tampón CP y mantener en hielo.

    8. Añada 8 µl de cloroacetaldehído al 45% (¡MUY TÓXICO!) A cada muestra (hasta un volumen de 100 µl).

    9. Incubar a 80 ° C durante 10 min.

    10. Centrifugar 30 min a 12.000 × gramo, 20ºC.

    11. Transferir 90 µl del sobrenadante a viales de cristal para HPLC.

    12. Ejecute todas las muestras y estándares en HPLC.

    Programa de HPLC (ver también Planificación estratégica y Protocolo básico 5)

    El análisis de adenosinas se realiza mediante HPLC de fase inversa en una columna Hyperclone C18 (ODS) conectada a un sistema de HPLC (Dionex). El análisis por HPLC se lleva a cabo como se describió anteriormente (Estavillo et al., 2011). El gradiente para la separación de derivados de adenosina se optimiza de la siguiente manera: equilibrio de la columna durante 0,2 min con 95% (v / v) de tampón de ejecución A (Tabla 2) y 5% (v / v) de tampón de ejecución B (Tabla 3), gradiente lineal durante 53 min hasta 50% (v / v) de tampón de funcionamiento B, y reequilibrio durante 7 min con tampón de funcionamiento B al 5% (v / v). El caudal se establece en 0,8 ml / min.

    Consulte el Protocolo básico 5 para conocer la interpretación de los datos.

    Como cofactor del metabolismo central, el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD) transporta electrones de una reacción a otra y está profundamente involucrado en la regulación de redox. El dinucleótido de nicotinamida y adenina oxidada (NAD +) acepta electrones de otras moléculas y se convierte a la forma reducida (NADH), especialmente en la glucólisis y el ciclo del TCA mitocondrial (Zhang y Fernie, 2018 Zhang et al., 2017 Youjun Zhang et al., 2018 ). El fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP) es un cofactor en reacciones anabólicas, como la biosíntesis de lípidos y ácidos nucleicos y el ciclo de Calvin, que utilizan NADPH como agente reductor (Kern et al., 2014). NAD + se puede convertir en NADP + por NAD + quinasa mediante la adición de un grupo fosfato adicional en la posición 2 'del anillo de ribosa que lleva el resto de adenina.

    En este protocolo, las formas reducidas, es decir, NADH o NADPH, primero se destruyen selectivamente a pH bajo y temperatura alta, luego, NAD + y NADP + se miden usando ensayos de ciclos altamente sensibles. La alcohol deshidrogenasa cataliza la oxidación del etanol, que implica la reducción de NAD + (figura 2), y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa cataliza la oxidación de glucosa 6-fosfato, que implica la reducción de NADP + (figura 2B). El etosulfato de fenazina luego cataliza la reducción de MTT en formazan de color púrpura oscuro, cuya absorbancia se puede medir a 570 nm. Al mismo tiempo, la reoxidación de NADH o NADPH hace posible reiniciar la oxidación de etanol o glucosa-6-fosfato. Este ciclo, que obedece a una ley de velocidad cinética de orden cero, se mantiene a una velocidad constante siempre que sus sustratos, es decir, etanol o glucosa-6-fosfato y MTT, estén saturados.

    Materiales

    • Hidrato de dinucleótido de β-nicotinamida y adenina (NAD +, Roche 10127990001)
    • Sal disódica de fosfato de dinucleótido de β-nicotinamida y adenina (NADP +, Roche 10128031001)
    • HCl 0,1 M
    • Nitrógeno líquido
    • Ácido perclórico 0,1 M (HClO4)
    • Muestra: material de hoja de Arabidopsis preparado como en el Protocolo básico 1
    • KOH 0,1 M en Tris⋅HCl 0,2 M, pH 8,4
    • Agua bidestilada
    • Mezcla de detección para NAD + / NADH (Tabla 4)
    • Mezcla de detección para NADP + / NADPH (Tabla 5)
    • Centrífuga refrigerada con rotor para tubos de microcentrífuga, capaz de alcanzar una velocidad de 20.000 × gramo
    • Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml
    • Bloque de calor
    • Microplacas de 96 pocillos (volumen máximo de pocillo Sarstedt, fondo plano transparente de 300 µl)
    • Lector de microplacas (p. Ej., Biotek EL 808 con filtro de 570 nm)
    Reactivo con concentración final. Stock conc. Fuente Amt. stock para 1 reacción Amt. stock para 100 reacciones
    Tricina 0,3 M / KOH, pH 9,0 1 M Carl Roth 6977.3 15 µl 1500 µl
    EDTA disódico 12 mM, pH 8,0 0,5 M Comúnmente disponible 1,2 µl 120 µl
    PES 0,3 mMa a

    Sal de etilsulfato de etildibenzopirazina.

    Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo.

    Sal de etilsulfato de etildibenzopirazina.

    Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo.

    Reactivo con concentración final. Stock conc. Fuente Amt. stock para 1 reacción Amt. stock para 100 reacciones
    Tricina 0,3 M / KOH, pH 9,0 1 M Carl Roth 6977.3 15 µl 1500 µl
    EDTA disódico 12 mM, pH 8,0 100 mM Comúnmente disponible 1,2 µl 120 µl
    PMS 0,3 mMa a

    Metilsulfato de metilfenazinio.

    Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo.

    Metilsulfato de metilfenazinio.

    Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo.

    Elaboración de estándares NAD + / NADP + para la medición

    1. Prepare 1 ml de cada uno de NAD + 20 mM y NADP + en HCl 0,1 M.

    2. Dividir el NAD + y NADP + soluciones en alícuotas de 50 µl, congelar en nitrógeno líquido y almacenar en un congelador a –80 ° C.

    Método de medición de NAD + / NADP +

    3. Agregue 200 µl de HClO 0.1 M4 a una alícuota de 25 mg de material foliar de Arabidopsis en un tubo de 1,5 ml, preparado como en el Protocolo básico 1.

    4. Mezcle inmediatamente el tubo golpeando ligeramente, agite el tubo en vórtex durante 15 s (manteniéndolo en hielo) y repita el vórtex hasta que el polvo de hojas se haya homogeneizado.

    5. Incubar el tubo durante 10 min en hielo, luego centrifugar 10 min a 12.000 × gramo, 4 ° C.

    6. Transfiera 200 µl de sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml.

    7. Calentar el tubo a 95 ° C durante 2 min, luego enfriar en hielo.

    8. Añada 200 µl de KOH 0,1 M en Tris $ $ HCl 0,2 M, pH 8,4, para neutralizar el extracto. Vórtice.

    El pH del extracto debe estar entre 8 y 8,5. Verifique el pH de una o dos muestras con papel de prueba de pH.

    9. Incubar los tubos en hielo durante un mínimo de 15 min.

    10. Calentar los estándares de NAD + y NADP + 20 mM (cada alícuota de 50 µl preparada en el paso 2) a 95 ° C durante 10 min, luego enfriar en hielo.

    11. Diluir los estándares de 20 mM a 1 µM con agua bidestilada. Haga esto poco antes de comenzar a pipetear, porque la solución estándar de 1 µM es muy inestable y solo se puede utilizar durante un máximo de 4 horas.

    12. Pipetee las muestras (del paso 9) y los estándares en una microplaca de 96 pocillos con un volumen final de 100 µl por pocillo. La concentración final estándar debe estar en el rango de 0-25 pmol (ver Tabla 6). No ponga el plato en hielo. Normalmente, usamos las dos primeras filas para los estándares y la tercera fila para las muestras de hojas.

    Conc final. en pmol por pocillo 0 5 10 15 20 25
    X µl 1 µM estándar 0 5 10 15 20 25
    X µl de agua 100 95 90 85 80 75

    13. Primero, haga una placa de prueba con dos muestras y los estándares para verificar si la cantidad de NAD + y NADP + que se está produciendo está dentro del rango de los estándares.

    14. Para la placa de prueba, pipetee 2, 5, 10 y 25 µl de las dos muestras y llene el pocillo hasta 100 µl con agua bidestilada.

    15. Prepare la mezcla de detección como en la Tabla 4 para NAD + y como en la Tabla 5 para NADP +, agregando PES para NAD + y PMS para NADP + poco antes de agregar la mezcla a las muestras y estándares. Agregue 50 µl de mezcla de detección por pocillo de la placa de prueba bajo luz tenue.

    Adquirir datos y calcular resultados

    16. El Protocolo básico 5 describe el análisis de datos.

    17. Lea la absorbancia a 570 nm con el lector de microplacas durante 45 min a 30 ° C.

    18. Uso Vsignificar para calcular la cantidad de NAD (P) +.

    19. Verifique la cantidad de NAD + y NADP + en las muestras y si los valores están en el rango de los estándares; si no, diluya o concentre las muestras en consecuencia. Repita la medición con todas las muestras. Aquí, sugerimos procesar tres réplicas técnicas para estándares y muestras. Si tiene de seis a ocho réplicas biológicas, puede reducir el número de réplicas técnicas a dos.

    Las formas oxidadas, es decir, NAD + o NADP +, primero se destruyen selectivamente a pH alto y temperatura alta, luego se miden NADH y NADPH usando los mismos ensayos que en el Protocolo básico 3 (Fig. 2B).

    Materiales

    • Dinucleótido de β-nicotinamida y adenina, sal disódica reducida hidratada (NADH, Roche 10107735001)
    • Sal tetrasódica reducida en 2'-fosfato de dinucleótido de β-nicotinamida y adenina hidrato (NADPH, Roche 10621692001)
    • 0,1 M de KOH
    • Nitrógeno líquido
    • Muestra: material de hoja de Arabidopsis preparado como en el Protocolo básico 1
    • HClO 0,1 M4 en Tris 0,2 M pH 8,4 (mezcle 10 µl de HClO 1 M4 y 200 µl de base Tris 1 M, agregue 60 µl de ddH2O, ajustar el pH a 8,4 y completar el volumen a 100 µl con ddH2O)
    • Agua bidestilada
    • Mezcla de detección para NAD + / NADH (Tabla 4)
    • Mezcla de detección para NADP + / NADPH (Tabla 5)
    • Centrífuga refrigerada con rotor para tubos de microcentrífuga, capaz de alcanzar una velocidad de 20.000 × gramo
    • Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml
    • Bloque de calor
    • Microplacas de 96 pocillos (volumen máximo de pocillo Sarstedt, fondo plano transparente de 300 µl)
    • Lector de microplacas

    Preparación de estándares NADH / NADPH para la medición

    1. Prepare 1 ml de cada uno de NADH 20 mM y NADPH en KOH 0,1 M.

    2. Divida las soluciones de NADH y NADPH en alícuotas de 50 µl, congélelas en nitrógeno líquido y almacénelas en un congelador a –80 ° C.

    Método de medición de NADH / NADPH

    3. Añada KOH 0,1 M a una alícuota de 25 mg de material en polvo de hojas de Arabidopsis en un tubo de 1,5 ml, preparado como en el Protocolo básico 1.

    4. Mezcle inmediatamente el tubo golpeando suavemente, agite el tubo en vórtex durante 15 s (manteniéndolo en hielo) y repita el vórtex hasta que el polvo de hojas se haya homogeneizado.

    5. Incubar el tubo durante 10 min en hielo, luego centrifugar 10 min a 12.000 × gramo, 4 ° C.

    6. Transfiera 200 µl del sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml.

    7. Calentar el tubo a 95 ° C durante 2 min, luego enfriar en hielo.

    8. Agregue 200 µl de HClO 0.1 M4 en Tris · HCl 0,2 M, pH 8,4, para neutralizar el extracto. Vórtice.

    El pH del extracto debe estar entre 8 y 8,5. Verifique el pH de una o dos muestras con papel de prueba de pH.

    9. Incubar los tubos en hielo durante un mínimo de 15 min.

    10. Calentar los estándares de NADH y NADPH 20 mM (cada alícuota de 50 µl preparada en el paso 2) a 95 ° C durante 10 min, luego enfriar en hielo.

    11. Diluir los estándares de 20 mM a 1 µM con agua bidestilada. Haga esto poco antes de comenzar a pipetear, porque la solución estándar de 1 µM es muy inestable y solo se puede utilizar durante un máximo de 4 horas.

    12. Pipetee las muestras y los estándares en una microplaca de 96 pocillos para obtener un volumen final de 100 µl por pocillo. La concentración final estándar debe estar en el rango de 0-25 pmol (ver Tabla 6). No ponga el plato en hielo. Normalmente, usamos las dos primeras filas para los estándares y la tercera fila para las muestras de hojas.

    13. Primero haga una placa de prueba con dos muestras y los estándares para verificar si la cantidad de NADH y NADPH que se está produciendo está dentro del rango de los estándares.

    14. Para la placa de prueba, pipetee 2, 5, 10, 25 µl de dos muestras y llene hasta 100 µl con agua bidestilada.

    15. Prepare la mezcla de detección como en la Tabla 4 para NADH y como en la Tabla 5 para NADPH, agregando PES para NADH y PMS para NADPH poco antes de agregar la mezcla a las muestras y estándares. Agregue 50 µl de mezcla de detección por pocillo de la placa de prueba bajo luz tenue.

    Adquirir datos y calcular resultados

    16. El Protocolo básico 5 describe el análisis de datos.

    17. Lea la absorbancia a 570 nm a 30 ° C con el lector de microplacas hasta que la velocidad se estabilice.

    18. Uso Vsignificar (calculado por el software de la máquina) para calcular la cantidad de NAD (P) H.

    19. Verifique la cantidad de NADH y NADPH en las muestras y si los valores están en el rango de los estándares; si no es así, diluya o concentre las muestras según corresponda. Repita la medición con todas las muestras. Para estándares y muestras, debe tener tres réplicas técnicas. Si tiene de tres a cuatro réplicas biológicas, puede reducir el número de réplicas técnicas a dos.

    5: ANÁLISIS DE DATOS Y CONTROL DE CALIDAD

    Después de completar la HPLC y la lectura de la placa, los datos brutos se pueden utilizar para el análisis de los niveles finales de los metabolitos. Los valores normalizados se procesan con al menos seis réplicas biológicas en nuestro laboratorio y se utilizan para calcular la concentración de los nucleótidos de adenina y el dinucleótido de nicotinamida y adenina. Es muy importante tener en cuenta que los valores de las muestras no deben estar por encima o por debajo del rango de estándares utilizados para las curvas estándar. Aquí, utilizamos la plántula de Arabidopsis de tipo salvaje (adhesión Col-0) como ejemplo para analizar la concentración de nucleótidos de adenina y dinucleótido de nicotinamida y adenina.

    Análisis de los datos

    1. En la medición de ATP / ADP / AMP (Protocolo básico 2), utilizamos 200 µl de tampón de extracción y 15 µl de tampón de reacción. Se inyectan muestras de 10 µl en la columna. Aquí usamos ATP como ejemplo y los métodos de análisis ADP o AMP son los mismos que para ADP (Fig. 3A).

    2.Primero, analizamos los estándares de ATP de la HPLC y obtenemos los valores de pendiente y blanco (Fig. 3B).

    3. Después de obtener la pendiente, podemos calcular las concentraciones dentro de las muestras como se muestra en la Fig. 3C. Brevemente, la concentración de reacción se calcula como (valor - blanco) / pendiente y se normaliza por factor de dilución y peso fresco (FW). Normalmente, el nivel final se normaliza para proporcionar un valor con las unidades µmol / gFW (Fig. 3C), donde gFW se refiere al peso fresco del material vegetal en gramos.

    4. De manera similar al análisis de ATP, las concentraciones de nucleótido de pirimidina también se normalizan a partir del estándar. Aquí, usamos NAD + como ejemplo (Fig. 4A).

    5. Primero usamos los datos brutos del estándar para obtener la pendiente y Vblanco (Figura 4B).

    6. Después de obtener la pendiente, podemos volver a la concentración de muestras como se muestra en la Figura 4C. Brevemente, la concentración se calcula como (valor + blanco) / pendiente y se normaliza por factor de dilución, volumen de muestra y peso fresco. Por lo general, el nivel final se normaliza para proporcionar un valor con las unidades nmol / gFW, donde gFW se refiere al peso fresco del material vegetal en gramos.


    Cambios en el contenido de nucleótidos de adenina e intermedios de la glucólisis y del ciclo del ácido cítrico en el músculo de vuelo de la langosta en vuelo y su relación con el control del ciclo.

    Andrew N. Rowan, Eric A. Newsholme Cambios en el contenido de nucleótidos de adenina e intermedios de la glucólisis y el ciclo del ácido cítrico en el músculo de vuelo de la langosta en vuelo y su relación con el control del ciclo. Biochem J 15 de enero de 1979 178 (1): 209–216. doi: https://doi.org/10.1042/bj1780209

    1. Se ha medido el contenido de algunos intermedios de la glucólisis, el ciclo del ácido cítrico y los nucleótidos de adenina en el músculo de vuelo de la langosta sujetado por congelación en reposo y después de 10 sy 3 min de vuelo. El contenido de glucosa 6-fosfato, piruvato, alanina y especialmente fructosa bifosfato y triosa fosfatos aumentaron notablemente durante el vuelo. El contenido de acetil-CoA disminuye después de 3 minutos de vuelo, mientras que el de acetilcarnitina disminuye notablemente después de 10 segundos de vuelo, pero vuelve al valor de reposo después de 3 minutos de vuelo. El contenido de citrato disminuye notablemente después de 10 segundos y 3 minutos de vuelo, mientras que el de isocitrato cambia muy poco después de 10 segundos y aumenta en un 50% después de 3 minutos. El contenido de oxaloacetato es muy bajo en el músculo de vuelo de los insectos y, por lo tanto, se midió mediante un ensayo radioquímico sensible. El contenido de oxaloacetato aumentó aproximadamente 2 veces después de 3 minutos de vuelo. Se observó un cambio similar en el contenido de malato. El contenido de ATP disminuyó aproximadamente un 15%, mientras que los de ADP y AMP aumentaron aproximadamente 2 veces después de 3 minutos de vuelo. 2. Cálculos basados ​​en O2 La absorción del insecto intacto indica que la velocidad del ciclo del ácido cítrico debe aumentarse & gt100 veces durante el vuelo. En consecuencia, si la citrato sintasa cataliza una reacción de no equilibrio, la actividad de la enzima debe aumentar & gt100 veces durante el vuelo. Sin embargo, los cambios en las concentraciones de posibles reguladores de citrato sintasa, oxaloacetato, acetil-CoA y citrato (que es un inhibidor alostérico) no son suficientes para explicar este cambio en la actividad. Se concluye que puede haber cambios mucho mayores en la concentración libre de oxaloacetato de lo que indican los cambios en el contenido total de este metabolito o que otros factores desconocidos deben jugar un papel adicional en la regulación de la actividad de la citrato sintasa. 3. El aumento del contenido de oxalacetato podría producirse a través de la piruvato carboxilasa, que puede ser estimulada durante las primeras etapas del vuelo por el aumento de la concentración de piruvato. 4. Las disminuciones en las concentraciones de citrato y α-oxoglutarato indican que la isocitrato deshidrogenasa y la oxoglutarato deshidrogenasa pueden ser estimuladas por factores distintos de los sustratos de sus vías durante las primeras etapas del vuelo. 5. Las proporciones calculadas de NAD + / NADH mitocondrial y citosólico aumentan durante el vuelo. El cambio en la proporción mitocondrial indica la importancia de la proporción de concentración de ATP / ADP intramitocondrial en la regulación de la tasa de transferencia de electrones en este músculo.


    Sinopsis

    En un entorno natural, la disponibilidad de nutrientes puede variar "de un festín a una hambruna" y viceversa, de forma muy repentina y frecuente, lo que provoca un estrés nutricional excesivo. La robustez de un organismo representa su capacidad para hacer frente a estas transiciones. Entre los nutrientes esenciales para el crecimiento, el más investigado de todos sigue siendo la fuente de carbono con preferencia por la glucosa. El aumento repentino de la concentración de glucosa provoca cambios rápidos en la concentración de metabolitos que actúan como mensajeros secundarios, por ejemplo, cAMP. Sin embargo, con la excepción de los nucleótidos de adenosina (Theobald et al, 1997) e intermedios del metabolismo del carbono central (Visser et al, 2004), se sabe poco acerca de los cambios rápidos a nivel del metaboloma que ocurren dentro de los primeros minutos después de la adición de glucosa en exceso. Al integrar los datos del metaboloma y del transcriptoma recopilados en los primeros minutos después del alivio repentino de la limitación de la glucosa, este trabajo proporciona el primer estudio completo, que muestra claramente cómo las células de levadura se adaptan a las nuevas condiciones ambientales.

    Para el análisis de sistemas cuantitativos de la respuesta dinámica a la disponibilidad de glucosa, es esencial que las condiciones experimentales estén estrictamente controladas. Para lograr tal análisis, la levadura Saccharomyces cerevisiae se cultivó con limitación de glucosa a una velocidad de crecimiento de 0,05 / h en cultivo de quimiostato. En estado estacionario, la concentración de glucosa aumentó instantáneamente de 0,15 a 5 mM. Se tomaron muestras del cultivo después de 30, 60, 90, 120, 210, 300 y 330 s para el análisis de metabolitos y transcripciones.

    Como los metabolitos variaron en segundos después de la adición de glucosa al cultivo en estado estacionario, la respuesta del transcriptoma solo cambió entre 120 y 210 s. A pesar de este cambio de tiempo, se observó una correlación muy alta en la naturaleza de estas respuestas. Entre las fluctuaciones rápidas de metabolitos, se midió una caída importante en la reserva de AXP. Esta caída estuvo acompañada de una regulación positiva retardada en el tiempo de los genes que codifican la vía biosintética completa de purina. Curiosamente, los datos de la transcripción revelaron que además de los genes de biosíntesis de purina, el rescate de purina, un carbono (C1), las vías de asimilación de azufre se regularon positivamente de manera coordinada, lo que fortaleció los datos del metaboloma que indicaron un requerimiento de purinas (Figuras 3 y 4). La obtención coordinada de purina sintética y rescate, un carbono (C1) y las vías de asimilación de azufre sugieren que las reacciones de metilación mediadas por S-adenosilmetionina podría desempeñar un papel crucial en el proceso de aceleración del crecimiento. Un análisis más detallado de la respuesta del transcriptoma mediante la incorporación de una sobrerrepresentación de categorías funcionales y datos de análisis de ubicación de más de 100 factores de transcripción permitió el mapeo del circuito regulador que tiene lugar en esta transición metabólica. Imaginó que las células se estaban preparando para acelerar el crecimiento, como lo muestra la reprogramación de la maquinaria de transcripción y traducción, y estaban tratando de recuperarse de un estrés redox severo.

    Muy temprano (después de 120 s), una gran parte de los genes involucrados en la traducción del ADN ribosómico (subunidades del ARN pol I) y el procesamiento de los ribosomas se regularon significativamente al alza. En conjunto, parece establecerse el ajuste fino de la traducción, ya que muchos elementos de la maquinaria de iniciación de la traducción también se regularon al alza.

    Además del "estrés energético", como lo demuestra la pérdida de la carga de energía celular, las células se enfrentaron al estrés redox. Con base en los datos presentados aquí, planteamos la hipótesis de que el desequilibrio en los intermedios de la parte superior (alta) y la parte inferior (baja) de la glucólisis era una consecuencia directa de la inhibición de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa por el aumento de la relación NADH / NAD. . Para restaurar la homeostasis redox, la célula utilizó tanto regulaciones metabólicas como transcripcionales. El aumento de la concentración intracelular de trehalosa-6-fosfato estuvo en consonancia con su función inhibidora de las hexoquinasas que impiden que la célula muera por la llamada "muerte acelerada por glucosa". La modulación de la expresión de los genes que codifican las enzimas del ácido tricarboxílico también fue esencial en la restauración del estado celular redox.

    Más sorprendente fue la rapidez del cambio de transcripción. La medición de las semividas de ARNm mostró indudablemente que se estaba produciendo una desintegración mucho más rápida de la transcripción tras el alivio de la limitación de glucosa. La vida media promedio del ARNm que muestra una regulación a la baja significativa fue nueve veces más corta de lo que se informó anteriormente (Wang et al, 2001), lo que sugiere que la degradación del ARNm participa activamente en la regulación de la traducción. En consecuencia, se podría considerar que esta desintegración acelerada del ARNm representa un nivel regulador generalizado de represión de catabolitos desencadenada por glucosa.

    A la inversa de lo que se podría pensar, la transición nutricional de la limitación al exceso de glucosa no solo se limita a la aceleración del crecimiento, sino que representa un proceso más equilibrado en el que la célula tiene que superar el estrés inducido por la glucosa mientras se desarrollan los procesos celulares necesarios para acelerar el crecimiento. hasta.

    Los experimentos que, además de los datos del transcriptoma y del metaboloma, incluyan información en otros niveles de información relevantes (por ejemplo, proteoma, fosfoproteoma y fluxoma, referencias) serán esenciales para enfrentar el desafío de larga data de la fisiología celular / biología de sistemas: llegar a una comprensión integral de las respuestas de las células vivas a su entorno físico y químico.


    6 Contribución del metabolismo del sustrato a la disfunción contráctil en el corazón diabético

    Durante muchos años se ha reconocido que los pacientes diabéticos tienen una incidencia y gravedad significativamente mayores de angina, infarto agudo de miocardio (IAM), insuficiencia cardíaca congestiva y otras manifestaciones de aterosclerosis en comparación con la población no diabética [75-79]. Más recientemente, se ha determinado que el funcionamiento ventricular puede verse afectado (miocardiopatías diabéticas) incluso en ausencia de cardiopatía isquémica [80-88]. Aunque una mayor incidencia de aterosclerosis en diabéticos contribuye a estas complicaciones, los estudios basados ​​en la población han demostrado que los factores no coronarios también son factores contribuyentes importantes [2]. Por ejemplo, la incidencia y la gravedad de las complicaciones asociadas con el IAM son mayores en la población diabética, aunque el tamaño del infarto no es significativamente diferente, e incluso puede ser menor, en comparación con la población no diabética [89, 90]. Los cambios en el corazón inducidos por la diabetes parecen ser factores importantes que contribuyen a las lesiones durante y después de un IAM [1, 91, 92]. Tanto la insuficiencia cardíaca después de un IAM como las miocardiopatías diabéticas se han correlacionado con el grado de control glucémico del paciente [93-95]. Además, las miocardiopatías en ausencia de cardiopatía isquémica pueden mejorarse mediante la corrección de la hiperglucemia [95]. Las pruebas acumuladas han implicado que los cambios en el uso del sustrato energético del miocardio contribuyen a las miocardiopatías diabéticas [96-102].

    Varias líneas de evidencia, tanto clínicas como experimentales, sugieren que los altos niveles plasmáticos de ácidos grasos libres y las altas tasas de oxidación de los ácidos grasos en el miocardio dan como resultado una función contráctil deteriorada y más arritmias durante y después de la isquemia tanto en el corazón normal como en el diabético [32 , 103]. La acumulación de ácidos grasos y sus intermediarios tóxicos se ha asociado con disfunción mecánica y daño celular en corazones diabéticos sometidos a isquemia [104] y con depresión de la bomba de Ca 2+ del retículo sarcoplásmico y actividades de ATPasa miofibrilar e isoenzimas de miosina [105]. La mejor evidencia de un vínculo causal entre la oxidación alta de ácidos grasos y la función cardíaca deteriorada proviene de estudios en corazones de rata aislados donde se inhibió la oxidación de ácidos grasos (con inhibidores de CPT-I) o se estimuló la actividad de la PDH (con DCA) y la recuperación contráctil de mejoró la isquemia. Sin embargo, hasta la fecha, no se han informado los resultados de los ensayos clínicos destinados a suprimir la oxidación de ácidos grasos durante el IAM en diabéticos. Hay varios enfoques farmacológicos disponibles que suprimen la oxidación de ácidos grasos y aumentan el flujo a través de la PDH, como la supresión de la tasa lipolítica periférica y los niveles plasmáticos de ácidos grasos libres con insulina, inhibición directa de la β-oxidación [106, 107], inhibición de CPT-I [ 108], o la disminución de los niveles de acetil CoA intramitocondrial con carnitina [109, 110]. Como resultado, existe una clara justificación para utilizar este enfoque para mejorar la función contráctil y disminuir el daño irreversible después de AMI.


    DISCUSIÓN

    Hemos realizado perfiles de transcripción utilizando microarrays de ADN en una colección de mutantes defectuosos en cada uno de los 15 genes que codifican subunidades de proteínas del ciclo de TCA. Este análisis reveló genes & gt400 que respondían en gran medida a los defectos del ciclo del TCA, lo que sugiere que la señalización del gen nuclear responde a la función del ciclo del TCA. En este informe, nos hemos concentrado en dos conjuntos de genes que parecen responder a distintas señales metabólicas resultantes de la disfunción del ciclo de TCA. La primera vía de señalización parece monitorear el estado general del ciclo de TCA, porque los defectos a lo largo del ciclo provocan una respuesta en la expresión de genes nucleares. La segunda vía representa la señalización resultante de un único defecto enzimático en el complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa y parece ser el resultado de una señalización aberrante dependiente del hemo. Hasta donde sabemos, estas respuestas a la disfunción del ciclo de TCA no se han informado previamente.

    Cuatro de las ocho enzimas del ciclo del TCA que inactivamos están codificadas por un solo gen, mientras que las otras cuatro enzimas están codificadas por múltiples (2-4) genes. Al comparar los perfiles de expresión en respuesta a defectos en genes que codifican diferentes subunidades de proteínas heterooligoméricas del ciclo del TCA, fue posible analizar cómo responde la célula a diferentes defectos en la misma enzima. Aunque la isocitrato deshidrogenasa y la succinil-CoA ligasa requieren ambas subunidades para su actividad, se pueden detectar subcomplejos compuestos de sólo algunas subunidades del complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa (Repetto y Tzagoloff, 1991 Scheffler, 1998). Sin embargo, el análisis de grupos sugirió que las respuestas a defectos en genes que codifican diferentes subunidades de las enzimas heterooligoméricas del ciclo del TCA fueron, en su mayor parte, muy similares (Figura 3). Esto fue ms evidente para elSDH1–4 matrices mutantes, que se agruparon en la misma rama. También podrían explicarse algunas diferencias entre las matrices de genes que codifican subunidades de la misma enzima. Por ejemplo, aunqueKGD1 y KGD2 Se observaron matrices en la misma rama, la LPD1 La matriz estaba agrupada en un grupo externo cercano. Debido a que la lipoamida deshidrogenasa codificada por LPD1 es también una subunidad en otras tres proteínas, la respuesta ligeramente diferente a una LPD1 El defecto probablemente refleja una respuesta agregada a la pérdida de los cuatro complejos enzimáticos. Debido a que las respuestas a diferentes mutaciones que codifican distintas subunidades de la misma enzima produjeron patrones de expresión similares, es posible que una mutación por enzima sea suficiente para establecer un perfil de expresión confiable.

    Una respuesta específica a los defectos en el KGD1–2 yLPD1 genes fue la expresión elevada de genes hipóxicos y una expresión disminuida de genes oxidativos. Esto pareció ser una respuesta específica a defectos en los genes que codifican el complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa y no fue aparente con otros defectos del ciclo del TCA (Figura 9), aunque algunos genes hipóxicos estaban elevados en células deficientes en aconitasa. El motivo más probable de los cambios observados en la expresión de genes oxidativos e hipóxicos es que los niveles de hemo están disminuidos en los mutantes α-cetoglutarato deshidrogenasa. La succinil-CoA es producida por el complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa, y este metabolito se usa directamente para la biosíntesis del hemo por la δ-aminolevulinato sintasa (Figura 1). Un defecto de α-cetoglutarato deshidrogenasa debería dar como resultado una disminución de la succinil-CoA y, por lo tanto, una disminución del hemo celular. La deficiencia de hemo daría lugar a la disminución de la expresión de genes oxidativos que están regulados a través de los complejos Hap1p, Hap2 / 3/4/5 y HDS. Los niveles de hemo disminuidos también dan como resultado niveles más bajos de Rox1p activo y otros factores que reprimen los genes hipóxicos, lo que lleva a la expresión elevada de genes hipóxicos, como CYC7, ANB1, y DAN1. La magnitud de los cambios de expresión en los mutantes de α-cetoglutarato deshidrogenasa parece ser cercana pero menor que los cambios máximos en la expresión reportados en los auxótrofos hem o por mutaciones enHAP1 o ROX1 (Kwast et al., 2002 Ter Linde y Steensma, 2002). Debido a que los mutantes de α-cetoglutarato deshidrogenasa no son auxótrofos hem, debe haber otras rutas para la síntesis de succinil-CoA. Una de esas enzimas podría ser succinil-CoA ligasa, que es una enzima reversible que puede sintetizar succinil-CoA a partir de succinato (Przybyla et al., 1998). Sin embargo, sobre la base de la magnitud de los cambios de expresión, la α-cetoglutarato deshidrogenasa puede ser una fuente significativa de succinil-CoA en estas condiciones.

    No está del todo claro por qué los cambios en los genes dependientes de hemo también se observan con la deficiencia de aconitasa (Figura 9). La deficiencia de aconitasa debe resultar en la acumulación de citrato y aconitato y una deficiencia de isocitrato y α-cetoglutarato. Las fuentes de glutamato deberían poder compensar la deficiencia de α-cetoglutarato; sin embargo, en las condiciones de cultivo utilizadas en estos experimentos, esto puede no estar ocurriendo. Los genes de la familia de las seripauperinas fueron los que mejor respondieron al defecto de la aconitasa, lo que sugiere que la respuesta de estos genes puede no deberse exclusivamente a los niveles de hemo celular (Cohen et al., 2001). Mutantes en ACO1muestran los defectos de crecimiento más severos en fuentes de carbono fermentables y no fermentables. Son auxótrofos de glutamato y no pueden crecer en algunas fuentes de carbono fermentables que no reprimen la expresión de genes oxidativos, como la rafinosa, lo que sugiere que las funciones oxidativas pueden verse gravemente comprometidas. Muchas células deficientes en aconitasa también son pequeñas (Figura 2B), y tales mutaciones del mtDNA pueden tener efectos profundos sobre la expresión de genes nucleares (Epstein et al., 2001b Traven et al., 2001). Por tanto, el perfil de expresión mostrado por ACO1 Se espera que los defectos sean complejos y sean el resultado de muchos factores diferentes, como niveles de hemo alterados, defectos del ADNmt y una tasa de crecimiento más lenta.

    Muchos genes respondieron de manera similar a los defectos generalizados dentro del ciclo de TCA. Mientras que algunos genes no parecían inducirse correctamente (Figura 5A), otros genes estaban hiperinducidos (Figura 5B), quizás en un intento de superar la ausencia de esta vía metabólica crítica.De particular interés fue un conjunto de genes que respondieron de manera similar a la disfunción del ciclo del TCA pero cuyo patrón de respuesta varió con el defecto enzimático (Figura 6). La expresión se elevó en respuesta a deficiencias de aconitasa e isocitrato deshidrogenasa, disminuyó en respuesta al complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa y deficiencias de succinil-CoA ligasa, se elevó nuevamente en respuesta a deficiencias de succinato deshidrogenasa y fumarasa, y disminuyó nuevamente en respuesta a malato deshidrogenasa y citrato sintasa. deficiencias. Aunque no es evidente de inmediato por qué este patrón alterno de expresión ocurre en respuesta a defectos en pares contiguos de enzimas del ciclo del TCA, presumiblemente es un reflejo de cambios en las señales metabólicas. Como enfoque para comprender este patrón, hemos reducido el ciclo de TCA en cuatro pasos mediante la combinación de las reacciones enzimáticas adyacentes que produjeron patrones de expresión similares (Figura 10). Desde este marco, buscamos similitudes y diferencias entre estos cuatro conjuntos de enzimas. Cada uno de estos pares de enzimas contiene una reacción que genera nucleótidos reducidos (NADH o FADH2) durante la función del ciclo de TCA, lo que sugiere que los cambios en el estado redox no son los principales responsables de generar esta respuesta. Los valores netos de ΔG para cada par son negativos, lo que indica una reacción exergónica general (Matthewset al. 2000). Además, cada conjunto contiene una reacción que es altamente reversible y una reacción que es esencialmente irreversible cuando se analiza individualmente (excepto para el par succinato deshidrogenasa-fumarasa, en el que ambas reacciones son reversibles). Cuatro ácidos carboxílicos separan estos pares de enzimas: citrato, α-cetoglutarato, succinato y malato. Es posible que los cambios en uno o más de estos metabolitos sean críticos para establecer este patrón de expresión como resultado de la disfunción del ciclo del TCA. Por ejemplo, un aumento de succinato causado por un defecto de succinato deshidrogenasa o fumarasa puede indicar un aumento de la transcripción de estos genes, mientras que una disminución en la formación de succinato causada por un defecto de succinil-CoA ligasa o α-cetoglutarato deshidrogenasa podría indicar una disminución en la expresion genica. Aunque los cambios en estos metabolitos del ciclo del TCA dentro de la matriz mitocondrial pueden iniciar una vía de señalización que resulte en una expresión genética nuclear alterada, no es seguro que sirvan directamente como moléculas de señalización. Por ejemplo, el glutamato y la glutamina se derivan del α-cetoglutarato a través de sucesivas reacciones de transaminación, y se ha demostrado que ambos aminoácidos señalan cambios en el estado metabólico de la célula que regulan la expresión génica nuclear (Butow, 2002 Crespo et al., 2002).

    Fig. 10. Un modelo sectorizado del ciclo de TCA para explicar el patrón de expresión génica alterna en respuesta a la disfunción del ciclo de TCA. Las enzimas del ciclo del TCA se emparejan sobre la base del patrón de expresión génica alternante en respuesta a la disfunción enzimática. Los defectos enzimáticos en blanco dieron como resultado una expresión disminuida, y los defectos enzimáticos en gris dieron como resultado una expresión génica elevada. Los valores de ΔG (kJ / mol) para cada par se calculan como la suma de las enzimas individuales (Matthews et al., 2000). Los metabolitos de señalización potenciales en los puntos de inflexión entre estos pares se muestran en recuadros negros. CS, citrato sintasa ACO, aconitasa IDH, isocitrato deshidrogenasa KGD, α-cetoglutarato deshidrogenasa SCL, succinil-CoA ligasa SDH, succinato deshidrogenasa FUM, fumarasa MDH, malato deshidrogenasa.

    Uno de los aspectos más interesantes del patrón de expresión génica alternante es su correlación con un conjunto previamente identificado de defectos del gen del ciclo del TCA que se identificaron como mutaciones potenciadoras del crecimiento de células disfuncionales con isocitrato deshidrogenasa. Mutaciones en elCIT1, KGD1–2, LPD1,LSC1–2, y MDH1 los genes pueden servir como potenciadores del crecimiento de la disfunción de la isocitrato deshidrogenasa, y estos mismos defectos dan como resultado una respuesta de expresión disminuida (Figura 6). Esto sugiere un vínculo entre la mejora del crecimiento de glicerol de la disfunción de la isocitrato deshidrogenasa y el patrón de expresión génica oscilante que se informa aquí.

    Se ha informado de un análisis extenso del fenotipo de acumulación de supresores de glicerol asociado con la disfunción de la isocitrato deshidrogenasa (Przybyla-Zawislak et al., 1999). Se examinó una colección de mutaciones en cada uno de los 15 genes que codifican los polipéptidos del ciclo de TCA para este fenotipo. Además, se adoptaron dos enfoques complementarios para determinar las identidades de las mutaciones supresoras. Primero, sobre la base de la caracterización previa de defectos enCIT1 como la clase más abundante de supresores (Gadde y McCammon, 1997), se probaron mutaciones en genes que codifican proteínas del ciclo del TCA para determinar su capacidad para mejorar el crecimiento de células disfuncionales de isocitrato deshidrogenasa en glicerol. En segundo lugar, se caracterizó una colección de mutaciones supresoras espontáneas. Se extrajeron varias conclusiones de estos estudios. Primero, el fenotipo de acumulación del supresor de glicerol es un fenotipo único asociado con la pérdida de polipéptidos de isocitrato deshidrogenasa. En segundo lugar, defectos en los genes (CIT1, KGD1–2, LPD1,LSC1–2, y MDH1) que codifican la mitad del ciclo de TCA, las enzimas podrían funcionar como potenciadores del crecimiento, alelos de función parcial deKGD1–2 y LPD1 que pueden crecer en glicerol fueron capaces de potenciar el crecimiento, mientras que las mutaciones por deleción no. En tercer lugar, ni mutaciones por deleción ni glicerol de función parcial + alelos de ACO1,IDH1, SDH1–4, y FUM1 podría funcionar como potenciadores del crecimiento. Cuarto, solo defectos en MDH yCIT los genes que codifican las isoenzimas del ciclo del TCA eran capaces de suprimirlos. Por último, se identificaron otros ocho genes implicados en el metabolismo oxidativo como potenciadores del crecimiento, lo que indica que no todos los defectos del metabolismo oxidativo eran capaces de suprimirse. Estos resultados dividieron los genes del ciclo de TCA entre genes supresores y genes no supresores y establecieron límites al número y tipos de genes que son capaces de mejorar el crecimiento. Sin embargo, la base fisiológica para la mejora del crecimiento permaneció indefinida.

    Para investigar la relación entre el patrón de expresión génica alterna y las mutaciones potenciadoras del crecimiento, se utilizó el análisis de microarrays para determinar los efectos de un Δidh2 Δcit1doble mutación. Inactivación de cualquiera CIT1 oIDH2 resultó en una disminuciónCIT1) o elevado (IDH2) patrones de expresión génica. Con defectos en ambos genes, el patrón de expresión se corrigió en gran medida y fue muy similar a los niveles de tipo salvaje (Tabla 1). Estos resultados llevaron a la hipótesis de que la sobreexpresión de uno o varios de estos genes sensibles es perjudicial para el crecimiento y que las mutaciones supresoras funcionan para corregir esta expresión alterada. Hemos comenzado a probar esta idea ensayando el efecto de la inactivación de genes que muestran el patrón alterno de expresión sobre el crecimiento de glicerol. Hasta la fecha, hemos descubierto que dos de los seis genes probados pueden servir como mutaciones potenciadoras del crecimiento en cepas deficientes en isocitrato deshidrogenasa,CIT1 y YGR067C (Figura 8). CIT1 es el único gen supresor del ciclo de TCA que también muestra el patrón de expresión génica alterna en respuesta a la disfunción del ciclo de TCA.YGR067C parece codificar un factor de transcripción y, por tanto, puede regular la expresión de varios otros genes.

    También se identificaron otros ocho genes supresores que no codifican las proteínas del ciclo del TCA (Przybyla-Zawislak et al., 1999). Si bien no se han determinado las identidades de estos genes, las mutaciones muestran fenotipos de crecimiento en fuentes de carbono no fermentables, lo que sugiere que las proteínas codificadas están involucradas en el metabolismo oxidativo. Será interesante determinar cómo estos defectos afectan el patrón de expresión génica alterna de los genes que se describen aquí. Por ejemplo, ¿afectan estas y otras mutaciones supresoras a los genes alternos de manera similar? Además, ¿es posible que las mutaciones supresoras mejoren el crecimiento al disminuir la expresión de uno o más de los genes que muestran un patrón de expresión alterno que puede ser perjudicial cuando se sobreexpresa? Hay varias razones por las que las mutaciones supresoras pueden detectarse específicamente con defectos de isocitrato deshidrogenasa y no con otras mutaciones del ciclo del TCA que dan como resultado el mismo patrón de expresión génica alterna. Primero, cepas en las queIDH1 o IDH2 están inactivados son capaces de crecer en ciertas fuentes de carbono no fermentables mientras que los otros defectos genéticos del ciclo del TCA relacionados (es decir, en ACO1, SDH1–4,FUM1) no puede (Przybyla-Zawislak et al., 1999). En segundo lugar, muchos de los genes sensibles muestran su mayor defecto de expresión en cepas eliminadas para IDH1 y IDH2(Figura 6) y, por lo tanto, los niveles de las proteínas potencialmente dañinas pueden ser más altos en las cepas disfuncionales de isocitrato deshidrogenasa. Finalmente, estos genes potencialmente deletéreos pueden ser particularmente sensibles a las señales metabólicas resultantes de la disfunción de la isocitrato deshidrogenasa.

    La disfunción de la isocitrato deshidrogenasa da como resultado dos tipos de inestabilidad del ADN. Como se describió anteriormente, surgen mutaciones nucleares de segundo sitio que mejoran el crecimiento de células que carecen de isocitrato deshidrogenasa en glicerol. En segundo lugar, la disfunción de la isocitrato deshidrogenasa produce inestabilidad del mtDNA, y las cepas que carecen de esta enzima tienen una alta frecuencia de pequeñas mutaciones [ρ -] con grandes deleciones en el mtDNA (Elzinga et al., 1993 Lin et al., 2001). La inestabilidad del mtDNA es un fenotipo asociado con otros defectos del ciclo del TCA y con varios genes que codifican proteínas en la fosforilación oxidativa mitocondrial y la biogénesis (Contamine y Picard, 2000). Muchas de estas últimas proteínas son bifuncionales y parecen desempeñar funciones adicionales en la traducción y / o ensamblaje de proteínas codificadas mitocondrialmente. La isocitrato deshidrogenasa es una proteína bifuncional ya que se une al ARNm codificado mitocondrialmente y parece regular la traducción de estas transcripciones (Elzinga et al., 1993 de Jong et al., 2000). Sin embargo, no está claro si la inestabilidad del mtDNA asociada con la disfunción de la isocitrato deshidrogenasa es el resultado de la pérdida de actividad catalítica o de la expresión aberrante y el recambio de los complejos respiratorios mitocondriales (de Jonget al., 2000 Lin et al., 2001). Estas funciones pueden no ser distintas, porque la unión del ARNm por la isocitrato deshidrogenasa inhibe su actividad catalítica (Anderson y McAlister-Henn, 2000). Estas observaciones sugieren un mecanismo por el cual el flujo metabólico del ciclo del TCA y la síntesis de complejos respiratorios están regulados de manera coordinada (Anderson y McAlister-Henn, 2000). Mutaciones en CIT1 también suprime la inestabilidad del mtDNA de las células disfuncionales de isocitrato deshidrogenasa (nuestros resultados no publicados), lo que indica que estas dos propiedades están funcionalmente vinculadas.

    Estudios recientes han revelado que los genes de la fumarasa y la succinato deshidrogenasa actúan como supresores de tumores en humanos. Los defectos de la fumarasa se asociaron con fibromas uterinos de herencia dominante, leiomiomas cutáneos y cáncer de células renales (Tomlinson et al., 2002), mientras que dos tipos de tumores cerebrales fueron causados ​​por mutaciones en genes que codifican subunidades de succinato deshidrogenasa (Baysal et al., 2000 Niemann y Muller, 2000 Astuti et al., 2001). Nuestros estudios en levadura han revelado que los defectos en la succinato deshidrogenasa o en la fumarasa producen respuestas similares en la expresión génica, y los defectos en la aconitasa y la isocitrato deshidrogenasa producen patrones de respuesta similares. La correlación de este patrón con los defectos genéticos supresores de la disfunción de la isocitrato deshidrogenasa sugiere que la inestabilidad genética puede ser una consecuencia de la disfunción del ciclo de TCA. Por lo tanto, la inestabilidad genética causada por la disfunción de la isocitrato deshidrogenasa puede proporcionar pistas sobre las propiedades de crecimiento aberrantes de las células tumorales, y este modelo de levadura puede resultar útil para comprender cómo la señalización metabólica y los cambios en la función del ciclo del TCA afectan la función celular y la estabilidad genómica. Dada la ubicuidad del ciclo de TCA, especialmente en eucariotas, se predice que vías de señalización similares entre el ciclo de TCA y el núcleo operan en organismos superiores.


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Comentarios:

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