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15.6: Ejercicio 2 - Inmunodetección - Biología

15.6: Ejercicio 2 - Inmunodetección - Biología


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Este es un procedimiento de varios días. Las membranas se rehidratan y se tratan con reactivos de bloqueo.

  1. Usando GUANTES, desenvuelva la mancha seca del envoltorio de plástico. Utilice los patrones preteñidos para identificar el lado de la membrana al que se unen las proteínas. Sumerja la membrana en metanol con este lado hacia arriba. Agite suavemente la membrana con la mano durante 30-60 segundos hasta que la membrana se haya humedecido uniformemente con metanol. Decante el metanol en el recipiente apropiado y llene la bandeja hasta la mitad con agua desionizada. Agite suavemente la membrana durante un minuto más.
  2. Decante el agua y reemplácela con suficiente TBS-T (solución salina tamponada con Tris que contiene Tween 20 al 0,05%) para cubrir la mancha. Coloque la mancha en una plataforma oscilante. Equilibre la mancha en TBS-T durante 5 minutos con oscilación lenta. Al cabo de 5 minutos, escurra el TBS-T.
  3. Vierta suficiente solución de bloqueo (leche descremada al 5% en TBS-T) sobre la mancha para cubrirla.
  4. Cubre la bandeja con un pequeño trozo de plástico. Etiquete la bandeja claramente y colóquela sobre una plataforma mecedora en la cámara fría. La mancha debe flotar libremente en la bandeja para que se laven ambos lados. Incube la mancha durante al menos una hora o hasta 24 horas a 4 ° C.

Las membranas se lavan e incuban con anticuerpo primario (~ 24 horas)

  1. Ubique su mancha en la cámara fría y llévela de regreso a la sala de laboratorio.
  2. Retire la envoltura de plástico del recipiente que contiene la mancha y vierta la solución de bloqueo. ¡GUARDE la envoltura de plástico! ¡Lo necesitarás para volver a tapar el recipiente!
  3. Agregue suficiente TBS-T para cubrir la mancha y coloque el recipiente en la plataforma oscilante. Rock durante 5 minutos.
  4. Vierta el TBS-T. Agregue 15 mL de anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo.
  5. Cubra el recipiente con el mismo trozo de plástico y coloque la bandeja sobre la plataforma mecedora en la cámara fría a 4 ̊C. Asegúrese de que la mancha flote libremente en la bandeja y que los estándares estén en la cara superior de la mancha. Incubar durante la noche a 4 ° C con oscilación lenta. NOTA: El momento de este paso es el más crítico del procedimiento. Acortar el tiempo de incubación con el anticuerpo primario puede reducir la sensibilidad del western blot.

Unión y detección de anticuerpos secundarios (1,5-2 horas)

  1. Ubique su mancha en la cámara fría y llévela a su salón de clases de laboratorio.
  2. Drene con cuidado el anticuerpo de la mancha en el tubo de ensayo marcado como "Anticuerpo primario usado". (Los anticuerpos son costosos. Afortunadamente, las soluciones se pueden reutilizar).
  3. Llene la bandeja con la mancha hasta la mitad con TBS-T. Coloque la bandeja en una plataforma oscilante y lave la membrana durante 5 minutos para eliminar el anticuerpo primario no unido. Drene el TBS-T cuando se complete el lavado.
  4. Repita el paso 3 una vez más, para un total de dos lavados.
  5. Agregue suficiente anticuerpo secundario para cubrir la mancha e incube la membrana durante 1 hora con un suave balanceo a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario, que se conjuga con la peroxidasa de rábano picante (HRP), se ha diluido en TBS-T.
  6. Drene con cuidado el anticuerpo de la mancha en el tubo de ensayo marcado como "Anticuerpo secundario usado".
  7. Lave la membrana 3 veces durante 5 minutos cada una con TBS-T, como en el paso 3.
  8. Drene el TBS-T de la mancha. Con una micropipeta P1000, cubra la mancha con 1 ml de 3,3'5,5'-tetrametilbencidina (TMB), un sustrato colorigénico para HRP. Deje que el color continúe desarrollándose hasta que aparezcan bandas distintas. Las bandas probablemente se harán evidentes en unos minutos. No permita que la mancha se desarrolle demasiado, cuando aparezcan bandas inespecíficas.

9. Detenga el desarrollo del color diluyendo el sustrato con un exceso de agua desionizada. Drene el sustrato diluido en el contenedor de desechos.

10. Deje que la mancha se seque sobre un trozo de papel de filtro. Grabe sus datos con la cámara de su teléfono celular.


Dieta y ejercicio: una combinación hecha en hueso

Propósito de la revisión: Múltiples componentes dietéticos tienen el potencial de afectar positivamente la densidad mineral ósea en la vida temprana y reducir la pérdida de masa ósea con el envejecimiento. Además, la actividad física regular con carga de peso tiene un fuerte efecto positivo en los huesos a través de la activación de la señalización de los osteocitos. Exploraremos los posibles efectos sinérgicos de los componentes dietéticos y los estímulos mecánicos para la salud ósea mediante la identificación de componentes dietéticos que tienen el potencial de alterar la respuesta de los osteocitos a la carga mecánica.

Hallazgos recientes: Varios aspectos (sub) celulares de los osteocitos determinan su señalización hacia osteoblastos y osteoclastos en respuesta a estímulos mecánicos, como el citoesqueleto del osteocito, el receptor de estrógeno α, el receptor de vitamina D y la arquitectura del sistema lacunocanalicular. Los moduladores potenciales de estas características incluyen la 1,25-dihidroxi vitamina D3, varias formas de vitamina K y el fitoestrógeno genisteína. Múltiples componentes dietéticos afectan potencialmente la función de los osteocitos y, por lo tanto, pueden tener un efecto sinérgico sobre la salud ósea cuando se combinan con un régimen de actividad física.

Palabras clave: Salud ósea Dieta Componentes dietéticos Nutrición Osteocitos Actividad física.

Declaracion de conflicto de interes

Conflicto de intereses

Ellen GHM van den Heuvel y Ruud JW Schoemaker son empleados de FrieslandCampina, una empresa láctea.

Astrid Bakker, Jenneke Klein-Nulend y Hubertine Willems declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Derechos humanos y animales y consentimiento informado

Este artículo no contiene ningún estudio con sujetos humanos o animales realizado por ninguno de los autores.


Los científicos descubren una molécula natural para tratar la diabetes tipo 2: la molécula imita algún efecto del ejercicio físico

Investigadores de la Facultad de Medicina Universit & eacute Laval, el Centro de Investigación del Instituto del Corazón y los Pulmones de Quebec y el Instituto de Nutrición y Alimentos Funcionales han descubierto una molécula natural que podría usarse para tratar la resistencia a la insulina y la diabetes tipo 2. La molécula, un derivado de los ácidos grasos omega-3, imita algunos de los efectos del ejercicio físico sobre la regulación de la glucosa en sangre.

Los detalles del descubrimiento realizado por el profesor Andr & eacute Marette y su equipo se publican hoy en Medicina de la naturaleza.

Se sabe desde hace algún tiempo que los ácidos grasos omega-3 pueden ayudar a reducir la resistencia a la insulina causada por una dieta rica en grasas saturadas. En su trabajo anterior, André Marette y sus colegas habían relacionado estos efectos con un lípido bioactivo llamado protectina D1. Al investigar más a fondo, descubrieron que otro miembro de la misma familia llamado protectin DX (PDX) desencadena la producción y liberación de interleucina 6 (IL-6) en las células musculares, una respuesta que también ocurre durante el ejercicio físico. "Una vez en el torrente sanguíneo, la IL-6 controla los niveles de glucosa de dos maneras: le indica al hígado que reduzca la producción de glucosa y actúa directamente sobre los músculos para aumentar la captación de glucosa", explica el investigador que también es Director Científico del Instituto de Universit & eacute Laval de Nutrición y alimentos funcionales.

Los investigadores utilizaron ratones transgénicos que carecen del gen IL-6 para demostrar el vínculo entre PDX e IL-6. La PDX tuvo muy poco efecto sobre el control de la glucosa en sangre en estos animales. En pruebas similares realizadas en ratas obesas diabéticas, se demostró que la PDX mejora drásticamente la capacidad de respuesta a la insulina, la hormona que regula la glucosa en sangre. "El mecanismo de acción descrito para PDX representa una nueva estrategia terapéutica para mejorar el control de la glucosa", propone el investigador. "Su eficacia puede ser comparable a la de ciertos medicamentos que se recetan actualmente para controlar la glucemia".

Aunque la PDX parece imitar el efecto del ejercicio físico al desencadenar la secreción de IL-6 en los músculos, André Marette advierte que no es un sustituto de la actividad física. "El ejercicio tiene beneficios cardiovasculares y otros beneficios hormonales que van mucho más allá de sus efectos metabólicos en los músculos", agrega el investigador cuyo trabajo es apoyado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y la Asociación Canadiense de Diabetes.

El profesor Marette y Universit & eacute Laval han presentado una solicitud de patente para PDX y sus aplicaciones terapéuticas. "Para nosotros, el siguiente paso es demostrar los efectos antidiabéticos en humanos y determinar el receptor a través del cual actúa la PDX".

Además de Andr & eacute Marette, los autores del estudio son Phillip White, Philippe St-Pierre, Alexandre Charbonneau, Patricia Mitchell, Emmanuelle St-Amand y Bruno Marcotte.


Dieta y ejercicio: una combinación hecha en hueso

Propósito de la revisión: Múltiples componentes dietéticos tienen el potencial de afectar positivamente la densidad mineral ósea en la vida temprana y reducir la pérdida de masa ósea con el envejecimiento. Además, la actividad física regular con carga de peso tiene un fuerte efecto positivo en los huesos a través de la activación de la señalización de los osteocitos. Exploraremos los posibles efectos sinérgicos de los componentes dietéticos y los estímulos mecánicos para la salud ósea mediante la identificación de componentes dietéticos que tienen el potencial de alterar la respuesta de los osteocitos a la carga mecánica.

Hallazgos recientes: Varios aspectos (sub) celulares de los osteocitos determinan su señalización hacia osteoblastos y osteoclastos en respuesta a estímulos mecánicos, como el citoesqueleto del osteocito, el receptor de estrógeno α, el receptor de vitamina D y la arquitectura del sistema lacunocanalicular. Los moduladores potenciales de estas características incluyen la 1,25-dihidroxi vitamina D3, varias formas de vitamina K y el fitoestrógeno genisteína. Múltiples componentes dietéticos afectan potencialmente la función de los osteocitos y, por lo tanto, pueden tener un efecto sinérgico sobre la salud ósea cuando se combinan con un régimen de actividad física.

Palabras clave: Salud ósea Dieta Componentes dietéticos Nutrición Osteocitos Actividad física.

Declaracion de conflicto de interes

Conflicto de intereses

Ellen GHM van den Heuvel y Ruud JW Schoemaker son empleados de FrieslandCampina, una empresa láctea.

Astrid Bakker, Jenneke Klein-Nulend y Hubertine Willems declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Derechos humanos y animales y consentimiento informado

Este artículo no contiene ningún estudio con sujetos humanos o animales realizado por ninguno de los autores.


El ejercicio inhibe el crecimiento tumoral y el metabolismo del carbono central en modelos de xenoinjerto de cáncer colorrectal derivados del paciente

Fondo: Si bien el ejercicio autonotificado se asocia con una reducción del riesgo de recurrencia en el cáncer colorrectal, se desconocen los mecanismos moleculares que sustentan esta relación. Además, el efecto del ejercicio sobre los procesos metabólicos intratumorales no se ha investigado en detalle en los cánceres humanos. En nuestro estudio actual, generamos seis modelos de xenoinjertos derivados del paciente de pacientes colorrectales (CRC PDX) y tratamos cada PDX para que funcionara voluntariamente con la rueda (ejercicio) durante 6-8 semanas o sin exposición a la rueda (control). Luego se realizó un análisis metabolómico completo en los PDX para identificar los cambios inducidos por el ejercicio en el tumor que estaban asociados con un crecimiento más lento.

Resultados: Se observó inhibición del crecimiento tumoral en el grupo de rueda voluntaria en comparación con el grupo de control en tres de los seis modelos. Un análisis metabolómico reveló por primera vez que el metabolismo del carbono central se veía afectado en cada modelo independientemente del tratamiento. Curiosamente, la comparación de modelos sensibles y resistentes mostró que los niveles de metabolitos en el metabolismo de nucleótidos, que se sabe que están acoplados al metabolismo mitocondrial, eran predictivos de la respuesta. Además, los niveles de fosfocreatina que están relacionados con las demandas de energía mitocondrial se asociaron con la inhibición del crecimiento tumoral.

Conclusión: En conjunto, este estudio proporciona evidencia de que los cambios en el metabolismo mitocondrial de las células tumorales pueden ser la base en parte de los beneficios del ejercicio.

Palabras clave: Metabolismo del carbono central Cáncer colorrectal Ejercicio Metabolismo mitocondrial Xenoinjerto derivado del paciente.


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