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¿Cuál es la relación evolutiva entre el hemo, la clorofila y otros tetrapirroles?

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Como no biólogo, busqué en Internet y encontré docenas de artículos que discutían la similitud entre las estructuras de las moléculas de hemo y clorofila, pero no pude encontrar ninguna discusión sobre su relación evolutiva.

Para ser más específico, me gustaría saber si el uso de tetrapirrol en la sangre y en la fotosíntesis se puede rastrear hasta los primeros organismos en los que el tetrapirrol tenía alguna función, y luego la molécula evolucionó para ser capaz de las diferentes funciones que realiza actualmente. en animales y plantas.


Preámbulo

Encontré esta pregunta interesante, por lo que, a pesar de mi ignorancia general en esta área, he intentado Dirección la cuestión de la evolución de los tetrapirroles en lugar de respuesta eso. Las contribuciones adicionales son bienvenidas como comentarios. Pido disculpas por el gráfico grande, que considero indispensable para mi respuesta; sin embargo, he incluido un resumen encima, para que los lectores puedan decidir si desean seguir leyendo.

Resumen

  1. Hay cuatro tipos principales de tetrapirrol asociados con proteínas.
  2. Comparten una vía común desde el ácido 5-aminolevulínico hasta el uroporfirinógeno II
  3. La cuestión no resuelta de qué vía posterior evolucionó primero se discute en relación con su antigüedad y complejidad.
  4. También se discute la posible relevancia evolutiva de las dos vías diferentes para la síntesis del ácido 5-aminolevulínico, que se encuentra en diferentes organismos.

Tetrapirroles en proteínas: diversidad y justificación química

Aunque la estructura cíclica del tetrapirrol parece compleja, parece muy antigua, presumiblemente debido a la mayor versatilidad química de sus complejos con los iones metálicos de las proteínas, en comparación con las proteínas más simples que contienen iones metálicos. El anillo proporciona una coordinación precisa de cuatro que se puede mantener en posición para proporcionar dos sitios de coordinación adicionales (en ángulo recto con el plano del anillo) que pueden interactuar con las cadenas laterales de proteínas u otras moléculas (como el oxígeno). ). La combinación de iones, la sustitución del tetrapirrol y la interacción con la proteína permite un ajuste fino de las propiedades redox del ión.

El siguiente diagrama (adaptado de Zappa et al.) muestra los cuatro tipos principales de tetrapirrol en proteínas y cómo se relaciona su biosíntesis. Los dos mencionados en la pregunta son en realidad derivados de la protoporfirina IX: clorinas, como la clorofila, con su papel en la fotosíntesis, y proteínas hem, con ejemplos de citocromos de la cadena de transporte de electrones más extendidos que el de la hemoglobina en eucariotas. . Además, sin embargo, están las corrinas, sobre todo en la vitamina B12 con un papel en la transferencia de metilo, y sirohaem, que se produce en ciertas reductasas de sulfito y nitrito.

¿Qué tetrapirrol es el más antiguo en términos evolutivos?

¿Cómo podemos abordar la cuestión de qué tetrapirrol fue el primero en surgir? Esta pregunta es, de hecho, qué vía sintética, qué serie de enzimas, surgió primero. En mi revisión de la literatura, yo (como el cartel) encuentro que esta es un área que los ángeles temen, pero, siendo temerario, sugiero dos criterios. El primero es lo que consideramos el edades relativas de las funciones a las que sirven las proteínas, y el segundo el complejidad relativa de las vías necesario para sintetizarlos.

El primer criterio está sujeto a disputa. Desafortunadamente, la fácil comparación entre el hemo como portador de oxígeno en eucariotas y las clorofilas como proteínas fotosintéticas procarióticas antiguas se complica por el papel más antiguo del hemo en los citocromos. Se podría argumentar que los citocromos son una característica del metabolismo aeróbico que siguió a la aparición de la generación de oxígeno mediante la fotosíntesis, pero desafortunadamente la cadena de transporte de electrones existe en organismos anaeróbicos, donde el aceptor de electrones terminal puede ser nitrato, nitrito, hierro férrico, sulfato o dióxido de carbono. . Dado esto, y la mayor complejidad de la ruta de la protoporfirina IX a la bacterioclorofila a en comparación con el protohaem (10 pasos en comparación con uno), se podría argumentar que las clorinas surgieron después de los hem.

Pero, ¿qué pasa con los otros tetrapirroles? Un enfoque de las edades relativas es considerar los procesos bioquímicos que podrían haber estado presentes poco después de las emergencias de la vida. Uno de estos análisis de esto fue realizado por Weiss et al. en un artículo publicado en Nature Microbiology (2016) 1, 1-8, titulado “La fisiología y el hábitat del último ancestro común universal”. Llegaron a la conclusión de que el Último Ancestro Común Universal (LUCA) era un autótrofo anaeróbico que existía en un entorno hidrotermal y obtenía energía utilizando una vía Wood-Ljungdahl con hidrógeno como donante de electrones y dióxido de carbono como aceptor de electrones. Los dos tipos de tetrapirroles que postulan que habrían estado presentes en el LUCA son corrin (como cobalamina para la transferencia de grupos metilo) y sirohaem para el metabolismo del azufre (sulfito reductasa) en el ambiente hidrotermal. ¡Sin mención de porfirinas! Dada la complejidad de la vía de 16 pasos a corrin, en comparación con la vía de un paso a sirohaem, se podría sugerir que esta última evolucionó primero.

Síntesis del ácido 5-aminolevulínico: ¿implicaciones evolutivas?

El ácido 5-aminolevulínico (frecuentemente denominado por su antiguo nombre de ácido δ-aminolevulínico) es el precursor del uroporfirinógeno II, el precursor común del tetrapirrol. Sin embargo, existen dos vías por las que se puede formar, de las cuales, según tengo entendido, solo una está presente en cualquier organismo. Uno de estos (al menos en mi opinión) podría tener implicaciones evolutivas. Estas vías se muestran a continuación en una figura adaptada de un artículo sobre la biosíntesis de hemo procariotas de H. Panek y M.R. O'Brian (2002).

El aspecto intrigante de esto es que una de las vías (la vía C5) implica la reducción de glutamil-tRNA, mientras que la otra (la vía Shemin) es una reacción de sintasa convencional con sustratos de glicina y succinil-CoA. Los argumentos que apoyan la hipótesis del mundo del ARN incluyen el ARN catalítico y la presencia de nucleósidos en moléculas como NAD, donde la complejidad contradice la simplicidad de su función. Entonces, volviendo a poner mi cabeza sobre el parapeto (para variar mis metáforas), sugeriría que el uso de glutamil-tRNA para la síntesis de este antiguo e importante intermediario podría ser otro fósil del mundo del ARN. (Quizás no lo que el cartel tenía en mente al plantear su pregunta).


Tenga en cuenta que las moléculas no son tan similares, solo una porción es similar.

La porción similar en cada molécula es un tetrapirrol cíclico. Los tetrapirroles cíclicos y las porfirinas en particular son una estructura bastante común en biología, tienen varios usos funcionales y son bastante fáciles de construir a partir de moléculas biológicas más simples existentes. El hecho de que sean funcionalmente buenos para unir metales los convierte en una solución recurrente, aunque no todos los tetrapirroles cíclicos se unen a los metales. Muchos muchos Las moléculas biológicas contienen tetrapirroles cíclicos.

Muchas moléculas biológicas tienen estructuras similares a otras moléculas, especialmente aquellas que realizan tareas similares, solo hay tantas formas que puedes hacer con átomos de carbono, la forma de una molécula afecta sus propiedades químicas y esa forma es simple y tiene propiedades útiles. El propio hemo es un componente funcional de muchas proteínas llamadas hemoproteínas, básicamente siempre que necesiten unirse al hierro. Otros tetrapirroles cíclicos serían la cobalamina, también conocida como vitamina B12, que se une al cobalto.

Es la misma razón por la que los mangos de los martillos se ven muy similares incluso en culturas muy diferentes, simplemente colocar un palo es una solución simple y fácil de descubrir, por lo que es la que se encuentra la mayor parte del tiempo. Funcionalmente esa es la forma que funciona. O, para decirlo de otra manera, hay tantas formas que puedes hacer una rueda.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167488912001000

http://www.org-chem.org/yuuki/porphyrin/porphyrin.html

https://www.cpp.edu/~lsstarkey/courses/CHM-Lab/PorphyrinBasics.pdf

https://www.mdpi.com/journal/molecules/special_issues/porphyrin_chemistry

Para abordar la pregunta actualizada. Sinceramente, no sé si comparten un origen evolutivo. Pero dado que se sintetizan en diferentes orgánulos (mitocondrias para el hemo y cloroplasto para la clorofila, supongo que no.


Patrones en los orígenes evolutivos del hemo, la clorofila a y las vías biosintéticas del difosfato de isopentenilo sugieren períodos no fotosintéticos antes de los reemplazos de plastidios en dinoflagelados

El dinoflagelado ancestral probablemente estableció un plastidio que contiene peridinina, que ha sido heredado en los descendientes fotosintéticos existentes. Sin embargo, los dinoflagelados kareniaceos y Lepidodinio Se sabía que las especies tenían plástidos "no canónicos" que carecían de peridinina, que se establecieron mediante endosimbiosis de algas verdes y haptofitas, respectivamente. Para la función y el mantenimiento de los plastidios, se sabía que los dinoflagelados antes mencionados usaban proteínas codificadas por el núcleo heredadas verticalmente de los dinoflagelados ancestrales (heredados verticalmente o de tipo VI) y las adquiridas de organismos no dinoflagelados (incluido el endosimbionte). Estas observaciones indicaron que los proteomas de los plástidos no canónicos derivados de un haptofito y un alga verde fueron modificados por genes "exógenos" adquiridos de organismos no dinoflagelados. Sin embargo, no hubo una evaluación sistemática que aborde cómo los genes "exógenos" remodelaron las vías metabólicas individuales localizadas en un plastidio no canónico.


Contenido

Las hemoproteínas tienen diversas funciones biológicas que incluyen el transporte de gases diatómicos, catálisis química, detección de gas diatómico y transferencia de electrones. El hierro hemo sirve como fuente o sumidero de electrones durante la transferencia de electrones o la química redox. En las reacciones de peroxidasa, la molécula de porfirina también sirve como fuente de electrones, pudiendo deslocalizar los electrones radicales en el anillo conjugado. En el transporte o detección de gases diatómicos, el gas se une al hierro hemo. Durante la detección de gases diatómicos, la unión del gas ligando al hierro hemo induce cambios conformacionales en la proteína circundante. [7] En general, los gases diatómicos solo se unen al hemo reducido, como el Fe ferroso (II), mientras que la mayoría de las peroxidasas tienen un ciclo entre Fe (III) y Fe (IV) y hemeproteínas involucradas en el ciclo mitocondrial redox, oxidación-reducción, entre Fe ( II) y Fe (III).

Se ha especulado que la función evolutiva original de las hemoproteínas era la transferencia de electrones en las rutas de fotosíntesis primitivas basadas en azufre en organismos ancestrales similares a las cianobacterias antes de la aparición del oxígeno molecular. [8]

Las hemoproteínas logran su notable diversidad funcional modificando el entorno del macrociclo hemo dentro de la matriz proteica. [9] Por ejemplo, la capacidad de la hemoglobina para suministrar oxígeno de manera eficaz a los tejidos se debe a los residuos de aminoácidos específicos ubicados cerca de la molécula de hemo. [10] La hemoglobina se une de manera reversible al oxígeno en los pulmones cuando el pH es alto y la concentración de dióxido de carbono es baja. Cuando la situación se invierte (pH bajo y concentraciones altas de dióxido de carbono), la hemoglobina liberará oxígeno a los tejidos. Este fenómeno, que establece que la afinidad de unión al oxígeno de la hemoglobina es inversamente proporcional tanto a la acidez como a la concentración de dióxido de carbono, se conoce como efecto Bohr. [11] El mecanismo molecular detrás de este efecto es la organización estérica de la cadena de globina un residuo de histidina, ubicado adyacente al grupo hemo, se carga positivamente en condiciones ácidas (que son causadas por CO disuelto2 en músculos activos, etc.), liberando oxígeno del grupo hemo. [12]

Grandes hemes Editar

Hay varios tipos de hemo biológicamente importantes:

Hemo A Hemo B Hemo C Hemo O
Número de PubChem 7888115 444098 444125 6323367
Fórmula química C49H56O6norte4Fe C34H32O4norte4Fe C34H36O4norte4S2Fe C49H58O5norte4Fe
Grupo funcional en C3 –CH (OH) CH2Lejos –CH = CH2 –CH (cisteína-S-il) CH3 –CH (OH) CH2Lejos
Grupo funcional en C8 –CH = CH2 –CH = CH2 –CH (cisteína-S-il) CH3 –CH = CH2
Grupo funcional en C18 –CH = O –CH3 –CH3 –CH3

El tipo más común es hemo B otros tipos importantes incluyen hemo A y hemo C. Los hemes aislados se designan comúnmente con letras mayúsculas, mientras que los hemes unidos a proteínas se designan con letras minúsculas. El citocromo a se refiere al hemo A en combinación específica con la proteína de membrana que forma una porción de la citocromo c oxidasa. [15]

Otros hemes Editar

  • Hemo l es el derivado del hemo B que está unido covalentemente a la proteína de lactoperoxidasa, peroxidasa de eosinófilos y peroxidasa de tiroides. La adición de peróxido con glutamil-375 y aspartil-225 de lactoperoxidasa forma enlaces éster entre estos residuos de aminoácidos y los grupos hemo 1- y 5-metilo, respectivamente. [16] Se cree que se forman enlaces éster similares con estos dos grupos metilo en las peroxidasas de eosinófilos y tiroides. Hemo l es una característica importante de las peroxidasas animales. Las peroxidasas vegetales incorporan el hemo B. La lactoperoxidasa y la peroxidasa eosinófila son enzimas protectoras responsables de la destrucción de bacterias y virus invasores. La peroxidasa tiroidea es la enzima que cataliza la biosíntesis de las hormonas tiroideas importantes. Debido a que la lactoperoxidasa destruye los organismos invasores en los pulmones y los excrementos, se cree que es una enzima protectora importante. [17]
  • Hemo metro es el derivado del hemo B unido covalentemente al sitio activo de la mieloperoxidasa. Hemo metro contiene los dos enlaces éster en los grupos hemo 1- y 5-metilo también presentes en el hemo l de otras peroxidasas de mamíferos, tales como lactoperoxidasa y peroxidasa de eosinófilos. Además, se forma un enlace iónico sulfonamida único entre el azufre de un residuo de metionil aminoácido y el grupo hemo 2-vinilo, lo que le da a esta enzima la capacidad única de oxidar fácilmente iones cloruro y bromuro a hipoclorito e hipobromito. La mieloperoxidasa está presente en neutrófilos de mamíferos y es responsable de la destrucción de bacterias invasoras y agentes virales. Quizás sintetiza hipobromito por "error". Tanto el hipoclorito como el hipobromito son especies muy reactivas responsables de la producción de nucleósidos halogenados, que son compuestos mutagénicos. [18] [19]
  • Hemo D es otro derivado del hemo B, pero en el que la cadena lateral del ácido propiónico en el carbono de la posición 6, que también está hidroxilado, forma una γ-espirolactona. El anillo III también está hidroxilado en la posición 5, en una conformación trans al nuevo grupo de lactonas. [20] El hemo D es el sitio para la reducción de oxígeno al agua de muchos tipos de bacterias a baja tensión de oxígeno. [21]
  • Hemo S está relacionado con el hemo B al tener un grupo formal en la posición 2 en lugar del grupo 2-vinilo. El hemo S se encuentra en la hemoglobina de algunas especies de gusanos marinos. Las estructuras correctas del hemo B y del hemo S fueron aclaradas por primera vez por el químico alemán Hans Fischer. [22]

Los nombres de los citocromos típicamente (pero no siempre) reflejan los tipos de hemo que contienen: el citocromo a contiene el hemo A, el citocromo c contiene el hemo C, etc. Es posible que esta convención se haya introducido por primera vez con la publicación de la estructura del hemo A.

Uso de letras mayúsculas para designar el tipo de hemo Editar

La práctica de designar hemes con letras mayúsculas se formalizó en una nota al pie en un artículo de Puustinen y Wikstrom [23] que explica bajo qué condiciones se debe usar una letra mayúscula: "Preferimos el uso de letras mayúsculas para describir la estructura del hemo como Las letras minúsculas se pueden usar libremente para citocromos y enzimas, así como para describir grupos hemo unidos a proteínas individuales (por ejemplo, citocromo bc y complejos aa3, citocromo b5, hem c1 del bc1 complejo, hemo a3 de la aa3 complejo, etc.) ". En otras palabras, el compuesto químico se designaría con una letra mayúscula, pero los casos específicos en estructuras con minúsculas. Por lo tanto, la citocromo oxidasa, que tiene dos hemas A (heme ay hemo3) en su estructura, contiene dos moles de hemo A por mol de proteína. Citocromo bc1, con hemes bH, BL, y C1, contiene hemo B y hemo C en una proporción de 2: 1. La práctica parece haberse originado en un artículo de Caughey y York en el que el producto de un nuevo procedimiento de aislamiento para el hemo del citocromo aa3 se denominó hemo A para diferenciarlo de preparaciones anteriores: "Nuestro producto no es idéntico en todos los aspectos al hemo a obtenido en solución por otros trabajadores mediante la reducción de la hemina a como se aisló previamente (2). Por este motivo, designaremos nuestro producto hemo A hasta que las aparentes diferencias puedan ser racionalizadas. ". [24] En un artículo posterior, [25] El grupo de Caughey usa letras mayúsculas para el hemo aislado B y C, así como para A.

El proceso enzimático que produce el hemo se denomina propiamente síntesis de porfirina, ya que todos los intermedios son tetrapirrol que se clasifican químicamente como porfirinas. El proceso está altamente conservado en biología. En los humanos, esta vía sirve casi exclusivamente para formar hemo. En las bacterias, también produce sustancias más complejas como el cofactor F430 y la cobalamina (vitamina B12). [26]

La ruta se inicia mediante la síntesis de ácido δ-aminolevulínico (dALA o δALA) a partir del aminoácido glicina y succinil-CoA del ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs). La enzima limitante de velocidad responsable de esta reacción, ALA sintasa, está regulada negativamente por la concentración de glucosa y hemo. El mecanismo de inhibición de los ALA por el hemo o la hemina es la disminución de la estabilidad de la síntesis de ARNm y la disminución de la ingesta de ARNm en las mitocondrias. Este mecanismo es de importancia terapéutica: la infusión de hemo arginato o hematina y la glucosa puede abortar los ataques de porfiria aguda intermitente en pacientes con un error innato del metabolismo de este proceso, al reducir la transcripción de la ALA sintasa. [27]

Los órganos que participan principalmente en la síntesis de hemo son el hígado (en el que la tasa de síntesis es muy variable, dependiendo de la reserva de hemo sistémica) y la médula ósea (en la que la tasa de síntesis de hemo es relativamente constante y depende de la producción de globina). cadena), aunque todas las células requieren hemo para funcionar correctamente. Sin embargo, debido a sus propiedades tóxicas, se requieren proteínas como la hemopexina (Hx) para ayudar a mantener las reservas fisiológicas de hierro con el fin de que se utilicen en la síntesis. [28] El hemo se considera una molécula intermedia en el catabolismo de la hemoglobina en el proceso del metabolismo de la bilirrubina. Los defectos en varias enzimas en la síntesis de hem pueden conducir a un grupo de trastornos llamados porfirias, que incluyen porfiria intermitente aguda, porfiria eritropoyética congénita, porfiria cutánea tarda, coproporfiria hereditaria, porfiria variegada, protoporfiria eritropoyética. [29] [ cita necesaria ]

Impossible Foods, productores de sustitutos de la carne a base de plantas, utilizan un proceso acelerado de síntesis de hemo que involucra leghemoglobina de raíz de soja y levadura, agregando el hemo resultante a elementos como las hamburguesas Imposible sin carne (veganas). El ADN para la producción de leghemoglobina se extrajo de los nódulos de la raíz de la soja y se expresó en células de levadura para producir hemo en exceso para su uso en las hamburguesas sin carne. [30] Este proceso pretende crear un sabor a carne en los productos resultantes. [31] [32]

La degradación comienza dentro de los macrófagos del bazo, que eliminan los eritrocitos viejos y dañados de la circulación. En el primer paso, la enzima hemo oxigenasa (HO) convierte el hemo en biliverdina. [33] El NADPH se utiliza como agente reductor, el oxígeno molecular entra en la reacción, se produce monóxido de carbono (CO) y el hierro se libera de la molécula como ión ferroso (Fe 2+). [34] El CO actúa como mensajero celular y actúa en la vasodilatación. [35]

Además, la degradación del hemo parece ser una respuesta conservada evolutivamente al estrés oxidativo. Brevemente, cuando las células están expuestas a radicales libres, hay una rápida inducción de la expresión de la isoenzima hem oxigenasa-1 (HMOX1) sensible al estrés que cataboliza el hem (ver más abajo). [36] La razón por la que las células deben aumentar exponencialmente su capacidad para degradar el hemo en respuesta al estrés oxidativo sigue sin estar clara, pero esto parece ser parte de una respuesta citoprotectora que evita los efectos deletéreos del hemo libre. Cuando se acumulan grandes cantidades de hemo libre, los sistemas de desintoxicación / degradación del hemo se abruman, lo que permite que el hemo ejerza sus efectos dañinos. [28]

hemo hemo oxigenasa-1 biliverdina + Fe 2+
H + + NADPH + O2 NADP + + CO

En la segunda reacción, la biliverdina reductasa (BVR) convierte la biliverdina en bilirrubina: [37]

La bilirrubina se transporta al hígado mediante la difusión facilitada unida a una proteína (albúmina sérica), donde se conjuga con ácido glucurónico para volverse más soluble en agua. La reacción es catalizada por la enzima UDP-glucuronosiltransferasa. [38]

Esta forma de bilirrubina se excreta del hígado en la bilis. La excreción de bilirrubina del hígado a los canalículos biliares es un proceso activo, dependiente de la energía y limitante de la velocidad. Las bacterias intestinales desconjugan el diglucurónido de bilirrubina y convierten la bilirrubina en urobilinógenos. Parte del urobilinógeno es absorbido por las células intestinales y transportado a los riñones y excretado con la orina (urobilina, que es el producto de la oxidación del urobilinógeno y es responsable del color amarillo de la orina). El resto viaja por el tracto digestivo y se convierte en estercobilinógeno. Esta se oxida a estercobilina, que se excreta y es responsable del color marrón de las heces. [39]


Un citocromo B Origen de los centros de reacción fotosintética: un vínculo evolutivo entre la respiración y la fotosíntesis

El origen evolutivo de los centros de reacción fotosintética ha permanecido esquivo durante mucho tiempo. Aquí, utilizamos el análisis estructural y de secuencia para demostrar un vínculo evolutivo entre el citocromo B subunidad del citocromo antes de Cristo1 complejo y los polipéptidos centrales del centro de reacción bacteriana fotosintética. En particular, hemos identificado un área de similitud de secuencia significativa entre tres dominios contiguos del citocromo que atraviesan la membrana. B, que contiene sitios de unión para dos hemes, y tres dominios contiguos que atraviesan la membrana en las subunidades centrales del centro de reacción fotosintética, que contiene sitios de unión para cofactores como (bacterio) clorofilas, (bacterio) feofitina y un hierro no hemo. Tres de los cuatro ligandos hem del citocromo B se encuentran conservados con los ligandos cofactores en los polipéptidos del centro de reacción. Dado que el citocromo B y los polipéptidos del centro de reacción se unen a tetrapirroles y quinonas para la transferencia de electrones, la secuencia observada, las similitudes funcionales y estructurales se pueden explicar mejor asumiendo un origen evolutivo común. El análisis estadístico apoya además una relación homóloga distante pero significativa. Sobre la base de análisis evolutivos previos que establecieron un escenario de que la respiración evolucionó antes de la fotosíntesis, consideramos probable que el citocromo B es el precursor evolutivo de las apoproteínas del centro de reacción de tipo II. Con un análisis estructural que confirma un origen evolutivo común de los centros de reacción de tipo I y tipo II, proponemos además una nueva hipótesis de "apoproteína del centro de reacción temprano" para explicar el desarrollo de holoproteínas del centro de reacción fotosintético.


Conclusiones

La vía de biosíntesis de tetrapirrol en eucariotas fototróficos es un mosaico evolutivo que se origina en proteobacterias, cianobacterias y eucariotas. Representa una bolsa de compras de enzimas recolectadas durante la historia de la endosimbiosis plastídica retenidas, debido a su papel esencial en el metabolismo, incluso después de que se hayan perdido las capacidades fotosintéticas. Aquí confirmamos que los plástidos terciarios de los dinotomos representan compartimentos en gran medida independientes con la biosíntesis de tetrapirrol que ocurre paralelamente a la biosíntesis en el plastidio de peridinina. Las enzimas supuestamente localizadas en la antigua rama plástida hermana de las enzimas dinoflageladas, mientras que el plástido terciario contiene enzimas ramificadas hermanas de las de las diatomeas, reflejando el origen de los respectivos orgánulos. En GRAMO. theta, la vía se encuentra casi en su totalidad en el plástido, con la excepción de una ferroquelatasa eucariota aparentemente localizada en la mitocondria, lo que indica una tasa evolutiva lenta o una restricción evolutiva. Además, observamos que la mayor parte de la vía se conserva evolutivamente y se relaciona con el linaje rojo incluso en organismos que actualmente poseen un plastidio de procedencia de algas verdes, es decir, el dinoflagelado. Lepidodinium chlorophorum y la cloraracniófita B. natanes. Por lo tanto, si la maquinaria de direccionamiento de proteínas es compatible con el nuevo compartimento de plastidios, la vía de síntesis de tetrapirrol puede reubicarse "tal cual", como se ilustra en el caso de L. cloroforo. Curiosamente, tal escenario puede implicar la existencia de un plastidio críptico derivado del rojo en una etapa anterior de la historia de las cloraracniófitas. Si bien la evolución de los eucariotas se está volviendo más clara con el aumento de datos de linajes más profundos, la historia de las adquisiciones de plástidos se resiste a revelar un escenario inequívoco debido a la transferencia masiva de genes y el sesgo filogenético. Sugerimos que un enfoque dirigido a los procesos conservados podría dar lugar a nuevas hipótesis relevantes incluso en la era genómica.


MÉTODOS

Recuperación de secuencias y análisis filogenéticos

Se buscaron secuencias parciales de los genes de la vía de biosíntesis del hemo en los datos de secuencia de los 454 estudios de secuenciación del genoma de Chromera velia y CCMP3155 (Janouškovec et al., 2010) por BLAST 2.2.18 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Las secuencias codificantes completas se amplificaron a partir del cDNA de C. velia por 3 ′ RACE y 5 ′ RACE usando el kit FirstChoice RLM-RACE (Ambion), clonado y secuenciado. Para cada enzima, BLAST identificó los homólogos apropiados y los descargó de fuentes web (consulte la Tabla complementaria 1 en línea), se alinearon con MAFFT (Katoh y Toh, 2008), se editaron manualmente con BioEdit (Hall, 1999) y se usaron para análisis filogenéticos adicionales. (consulte Conjuntos de datos suplementarios 1 a 3 en línea). Los árboles bayesianos se calcularon utilizando PhyloBayes 3.2d bajo el modelo evolutivo CAT-GTR (Lartillot y Philippe, 2004). Para cada análisis, se ejecutaron dos cadenas independientes durante un número suficiente de pasos después de que las cadenas convergieran. La convergencia de dos cadenas independientes se evaluó en base al análisis bpcomp (PhyloBayes 3.2d). El valor de combustión se eligió de acuerdo con el mismo análisis (generalmente se descartó el 20% de los árboles). Cabe señalar que la presencia de Plasmodium Las secuencias de nuestros análisis no apoyaron ningún otro método de construcción de árboles debido a su alta divergencia. Solo el uso del modelo CAT avanzado admitió la ubicación esperada de Plasmodium en el mismo clado con otros apicomplejos en muchos de los análisis. Por lo tanto, los árboles muestran solo probabilidades posteriores bayesianas y no ningún otro soporte, como bootstraps de máxima verosimilitud. Preferimos utilizar todas las secuencias de apicomplexan, incluidas las que son muy divergentes, antes de utilizar otros métodos filogenéticos adicionales en el conjunto de datos reducido.

Posibles localizaciones de enzimas de la síntesis de tetrapirrol en C. velia

Se probaron localizaciones putativas de enzimas codificadas nucleares de la vía tetrapirrol mediante predicciones in silico utilizando servidores de predicción CBS (http://www.cbs.dtu.dk/services/). En particular, se utilizaron los programas SignalP y TargetP (Emanuelsson et al., 2007) para predecir SP y TP, respectivamente.

Radiomarcaje in vivo de clorofila

Para realizar el radiomarcaje in vivo de clorofila, 50 mL de C. velia o Synechocystis 6803 células en OD750

0.4 se concentraron en 350 μL de medio de crecimiento suplementado con tampón TES / NaOH 20 mM, pH 8.0, se transfirieron a un tubo de vidrio y se incubaron en un agitador durante 1 ha 30 ° C y a 80 μmol de fotones s −1 m - 2. Luego, se agregaron 350 μM de 14 C-Glu o 14 C-Gly (actividad específica

50 mCi / mmol de productos químicos radiomarcados estadounidenses) y las células se incubaron adicionalmente en las mismas condiciones. La incorporación de aminoácidos marcados en las células se controló midiendo la disminución de la radiactividad del sobrenadante cada 30 minutos en un analizador de centelleo líquido (Packard Tri-Carb 1500). Después de 2 h, las células se lavaron tres veces con agua y luego se extrajeron los pigmentos de las células sedimentadas usando 1,3 ml de metanol / NH al 0,2%.4. Esta solución se mezcló con 140 μL de NaCl 1 M y 400 μL de hexano y se agitó con vórtex. Se eliminó la fase de hexano que contenía clorofila y se evaporó en un concentrador de vacío, se resuspendió en 100 µL de metanol y se mezcló con 100 µL de metanol que contenía KOH al 10%. Después de una incubación de 15 min a temperatura ambiente, la solución se extrajo dos veces con 200 μL de hexano y una vez con 200 μL de éter de petróleo (rango de ebullición de 40 a 65 ° C) para eliminar el fitol y la clorofila sin procesar, y finalmente se acidificó con 20 μL de concentrado. HCl. La solución resultante que contenía el derivado de clorofila clorina se aclaró por centrifugación, el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo, se secó en un concentrador de vacío y se resuspendió en una gota de metanol. La cromatografía en capa fina de fase inversa se realizó en una placa de gel de sílice (Macherey-Nagel) se utilizó cloroformo: metanol: agua (65: 25: 3) como fase móvil. Después de la separación, la placa se secó y la señal se capturó en una película de rayos X (tiempo de exposición de 5 d).

Números de acceso

Los datos de secuencia de este artículo se pueden encontrar en las bibliotecas de datos de GenBank / EMBL con los siguientes números de acceso: HQ222925 a HQ222935 para los genes completos de la biosíntesis de tetrapirrol de C. velia y HQ245653 a HQ245656 para las secuencias de genes parciales de la cepa CCMP3155. Los números de acceso para las secuencias utilizadas en el análisis filogenético se presentan en la Tabla complementaria 1 en línea.

Datos suplementarios

Figura complementaria 1. Árboles filogenéticos de ácido Δ-aminolevulínico deshidratasa, porfobilinógeno desaminasa, uroporfirinógeno sintasa, coproporfirinógeno oxidasa y protoporfirinógeno oxidasa.

Figura complementaria 2. Comparación de las presencias N-terminales de ALAS de varios eucariotas, incluyendo C. velia.

Figura complementaria 3. Presencia de motivos reguladores de hemo conservados (motivos CP) en las presencias N-terminales de sintasas de ácido Δ-aminolevulínico de varios eucariotas, incluidos C. velia.

Tabla complementaria 1. Secuencias utilizadas en los análisis.

Conjunto de datos suplementarios 1. Archivo de texto de alineación correspondiente a la figura 1.

Conjunto de datos suplementarios 2. Archivo de texto de alineación correspondiente a la figura 2.

Conjunto de datos suplementarios 3. Archivo de texto de alineación correspondiente a la figura complementaria 1.


Materiales y métodos

Recuperación de secuencias y análisis filogenéticos

Las secuencias de los genes de la vía de biosíntesis del hemo se buscaron en las bases de datos de secuencias disponibles: PEPdb (http://amoebidia.bcm.umontreal.ca/pepdb), GenBank y E. gracilis Los datos del genoma se obtuvieron de la base de datos de secuencias del laboratorio de MC Field en: http://web.me.com/mfield/Euglena_gracilis (consulte la tabla complementaria S2, Material complementario en línea para las ID de secuencia). Donde solo hay pequeños fragmentos de genes disponibles, amplificamos segmentos de genes más grandes a partir del cDNA de E. gracilis cepa Z (amablemente proporcionada por el profesor Krajčovič, Bratislava). The 5' regions were amplified using the FirstChoice RLM-RACE kit (Ambion) or the spliced-leader specific primer (5'-ACACTTTCTGAGTGTCTATTTTTTTTCG-3'). All newly sequenced data were deposited in GenBank under accession numbers: JF292577-JF292587.

For each enzyme, appropriate homologues were identified by Blast, aligned using MAFFT ( Katoh and Toh 2008) and manually edited using BioEdit ( Hall 1999). Phylogenetic trees were computed using PhyloBayes 3.2f under the CAT-GTR evolutionary model ( Lartillot and Philippe 2004). For each analysis, two independent chains were run for at least 50,000 steps. The convergence of the chains was assessed based on bpcomp analysis (PhyloBayes 3.2f). For the 50% majority consensus trees, each 10th tree was sampled and the first 10% of the trees were discarded. The bootstrap support values were calculated in RAxML 7.0.3 ( Stamatakis 2006) using the PROTGAMMALG model after 1,000 replications.


Materiales y métodos

Sequences

All homologs of HemY, HemG, and HemJ were retrieved from the Gclust database (Gclust2010e29b data set at http://gclust.c.u-tokyo.ac.jp/ [last accessed August 12, 2014, now available under “Old versions”] including selected genomes covering plants, algae, nonphotosynthetic eukaryotes, and prokaryotes.) according to the published list of homologs. Gclust is a comparative genomic database of homologous protein clusters suitable for phylogenetic profiling ( Sato 2002, 2009 Sato et al. 2005). The sources of the original databases are described on the website.

We identified all homologs of enzymes involved in heme biosynthesis in all prokaryotic genomes in RefSeq of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database as of November 2010 (data set AllBact2010) and used them for the statistics shown in table 2. In most analyses, the two data sets were sufficient for obtaining an idea of the overall distribution of enzymes in various phyla. However, some new sequences were retrieved from RefSeq as of February 2013 to complement the data in detailed analyses for supplementary figures S4 and Supplementary Data , Supplementary Material online. All 3,916,828 proteins in the 1,196 prokaryotic genomes were used in all-against-all BLASTP (mostly v2.2.22) analysis (options: –m8 –FF –C0). The results in a single table (specified by option –m8) were used for clustering by use of gclust v3.56 (parallel version) ( Sato 2009). Each of the enzymes in the heme biosynthetic pathway was first identified by name, then all homologs were retrieved as several clusters. Additionally, some singletons were retrieved by following the “related groups” link. A list of enzymes in all analyzed organisms was compiled from the lists of homologs. The huge file of original data of clusters (7.12 GB) is not currently available on the web site but may be obtained from the corresponding author upon request.

Phylogenetic Analyses

Amino acid alignment was performed for each isofunctional enzymes by using Muscle v3.6 ( Edgar 2004). Sequences not aligned in the entire length were removed, and alignment was repeated. The sequence alignment was used for subsequent phylogenetic analysis and homology modeling. The sites with gaps in more than 20% of sequences were removed by use of SISEQ v1.59 ( Sato 2000), which was also used for conversion of various sequence formats. ClustalX v1.83 was used for profile alignment and to manage aligned sequences ( Thompson et al. 1994).

Each alignment was used in the phylogenetic analysis as follows. A neighbor-joining (NJ) tree was estimated with MEGA v4 ( Tamura et al. 2007) with the Jones–Taylor–Thorton (JTT) model and an equal evolutionary rate. Calculation with the ML method involved use of TreeFinder March 2008 version ( Jobb et al. 2004) with the Whelan–Goldman (WAG) model, and with RAxML v7.0.4 ( Stamatakis 2006) with –f d –i 10 –m PROTCATWAG options. The exact parameters were determined by initial trials with –c 10, 40, 55 with or without –i 10. Bootstrap was based on 1,000 replicates. Bayesian inference (BI) involved use of MrBayes v3.2 ( Ronquist and Huelsenbeck 2003), with the following options: aamodelpr = fixed(wag), ratepr = variable, ngen = 2,000,000, samplefreq = 200, burnin = 3,000 (for HemG, ngen = 1,000,000, samplefreq = 100), and with PhyloBayes v3.2e ( Lartillot et al. 2009) with the CAT+gtr model. A 16S–23S-based phylogenetic tree in Cyanobacteria ( fig. 2) was constructed with the BI method as described ( Sasaki and Sato 2010).

The approximately unbiased (AU) test, intended to test the relative likelihood of various forms of trees based on support levels of individual sites, involved use of the CONSEL program ( Shimodaira and Hasegawa 2001), with the output of Protml in MOLPHY v2.3beta ( Adachi and Hasegawa 1996), based on the 19 most probable trees for 20 representative taxa. For this purpose, the trees were selected by Protml with constrained trees according to the results of ML and BI analyses. The WAG and JTT models were used. Phylogenetic trees were drawn with use of NJplot ( Perrière and Gouy 1996) and Mesquite utility v2.5 (http://mesquiteproject.org, last accessed August 12, 2014). The alignment files used for phylogenetic analysis are available in supplementary material , Supplementary Material online.

Homology Modeling

Homology modeling of HemY homologues involved use of Modeller v8v1 or 8v2 ( Sali and Blundell 1993) with the automodel script, modified as necessary. Both of the structures in the Protein Data Bank (PDB) entry 1SEZ for tobacco Protox (PPO2) were used as templates. This file describes two monomers arranged in a symmetric position, but some loops and the N-terminus are invisible because of high flexibility. The corresponding parts in the inferred models are an invention of the software and are only meaningful as an indication of the presence of a structural part. Cartoon models of structure were prepared with use of Molscript ( Kraulis 1991). The coordinate files of homology modeling are available from the corresponding author upon request.


Conclusión

En resumen, HrHEMA, HrPOR y HrCAO silencing can cause leaf yellowing and chloroplast structure changes in Hosta. On note, leaves of Hosta con HrCAO silencing were the most affected, while the HrPOR silencing plant was the least affected. The overexpression of these three genes in tobacco enhanced photosynthesis by accumulating chlorophyll content, but the influential level varied under different light intensities. Es más, HrHEMA-, HrPOR- y HrCAO- overexpressing in tobacco can enhance the antioxidant capacity of plants to cope with stress under higher light intensity. However, under lower light intensity, the antioxidant capacity deteriorated in the HrHEMA-, HrPOR- y HrCAO-overexpressing tobaccos.


METHODS

Sequence Retrieval and Phylogenetic Analyses

Partial sequences of the genes of the heme biosynthesis pathway were searched in the sequence data of the 454 genome sequencing surveys of Chromera velia and CCMP3155 (Janouškovec et al., 2010) by BLAST 2.2.18 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Complete coding sequences were amplified from the cDNA of C. velia by 3′ RACE and 5′ RACE using the FirstChoice RLM-RACE kit (Ambion), cloned, and sequenced. For each enzyme, appropriate homologs were identified by BLAST and downloaded from Web sources (see Supplemental Table 1 online), aligned using MAFFT (Katoh and Toh, 2008), manually edited using BioEdit (Hall, 1999), and used for further phylogenetic analyses (see Supplemental Data Sets 1 to 3 online). Bayesian trees were computed using PhyloBayes 3.2d under CAT-GTR evolutionary model (Lartillot and Philippe, 2004). For each analysis, two independent chains were run for a sufficient number of steps after the chains converged. The convergence of two independent chains was assessed based on bpcomp analysis (PhyloBayes 3.2d). The burnin value was chosen according to the same analysis (usually 20% of the trees were discarded). It should be noted that the presence of Plasmodium sequences in our analyses did not support any other method of tree construction because of their high divergence. Only the use of the advanced CAT model supported the expected placement of Plasmodium into the same clade with other apicomplexans in many of the analyses. Thus, the trees show only Bayesian posterior probabilities and not any other support, such as maximum likelihood bootstraps. We preferred to use all apicomplexan sequences, including those that are highly divergent, before the use of other additional phylogenetic methods on the reduced data set.

Putative Localizations of Enzymes of the Tetrapyrrole Synthesis in C. velia

Putative localizations of nuclear encoded enzymes of the tetrapyrrole pathway were tested by in silico predictions using CBS prediction servers (http://www.cbs.dtu.dk/services/). In particular, programs SignalP and TargetP (Emanuelsson et al., 2007) were used to predict SPs and TPs, respectively.

In Vivo Radiolabeling of Chlorophyll

To perform in vivo radiolabeling of chlorophyll, 50 mL of C. velia o Synechocystis 6803 cells at OD750

0.4 were concentrated into 350 μL of growth media supplemented with 20 mM TES/NaOH buffer, pH 8.0, transferred into a glass tube, and incubated on a shaker for 1 h at 30ଌ and at 80 μmol of photons s 𢄡 m 𢄢 . Then, 350 μM 14 C-Glu or 14 C-Gly was added (specific activity

50 mCi/mmol American Radiolabeled Chemicals), and cells were further incubated under the same conditions. Incorporation of labeled amino acid into cells was monitored by measuring decrease of the radioactivity from the supernatant every 30 min on liquid scintillation analyzer (Packard Tri-Carb 1500). After 2 h, cells were washed three times with water and then pigments were extracted from pelleted cells using 1.3 mL of methanol/0.2% NH4. This solution was mixed with 140 μL of 1 M NaCl and 400 μL of hexane and vortexed. Hexane phase containing chlorophyll was removed and evaporated on a vacuum concentrator, resuspended in 100 μL of methanol, and mixed with 100 μL of methanol containing 10% KOH. After incubation for 15 min at room temperature, the solution was extracted twice with 200 μL hexane and once by 200 μL of petroleum ether (boiling range 40 to 65ଌ) to remove phytol and unprocessed chlorophyll, and finally acidified by 20 μL of concentrated HCl. The resulting solution containing the chlorophyll derivate chlorin was cleared by centrifugation, the supernatant transferred into a new tube, dried on a vacuum concentrator, and resuspended in a drop of methanol. Reverse-phase thin layer chromatography was performed on silica-gel plate (Macherey-Nagel) chloroform:methanol:water (65:25:3) was used as the mobile phase. After separation, the plate was dried and the signal captured on an x-ray film (exposure time of 5 d).

Accession Numbers

Supplemental Data

The following materials are available in the online version of this article.

Supplemental Figure 1. Phylogenetic Trees of δ-Aminolevulinic Acid Dehydratase, Porphobilinogen Deaminase, Uroporphyrinogen Synthase, Coproporphyrinogen Oxidase, and Protoporphyrinogen Oxidase.

Supplemental Figure 2. Comparison of ALAS N-Terminal Presequences of Various Eukaryotes, Including C. velia.

Supplemental Figure 3. Presence of Conserved Heme Regulatory Motifs (CP Motifs) in the N-Terminal Presequences of δ-Aminolevulinic Acid Synthases of Various Eukaryotes, Including C. velia.

Supplemental Table 1. Sequences Used in the Analyses.

Supplemental Data Set 1. Text File of Alignment Corresponding to Figure 1 .

Supplemental Data Set 2. Text File of Alignment Corresponding to Figure 2 .

Supplemental Data Set 3. Text File of Alignment Corresponding to Supplemental Figure 1.


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