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¿Hay alguna diferencia entre el caldo Luria y el caldo de lisogenia?

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¿Hay alguna diferencia entre Luria Bertani y Luria Broth? ¿O son ambos lo mismo? ¿Es necesario esterilizar en autoclave el medio LB después de su preparación?


Aunque ambos nombres son bastante comunes, ambos están equivocados. En el artículo original de 1951, Bertani estaba estudiando la lisogenia en E. coli, de ahí que denominó a sus medios para este fin "Caldo de Lisogenia" o LB en resumen. En las décadas siguientes este nombre se transformó a "Luria Bertani" o "Caldo Luria", lo cual es incorrecto. Consulte las referencias 1 y 2 para obtener más detalles.

Para la segunda pregunta: Es absolutamente necesario esterilizar en autoclave los medios después de la preparación para evitar la contaminación y el crecimiento de microorganismos presentes en nuestro medio. Solo esterilizar el medio asegura que podamos trabajar con microorganismos definidos.

Referencias:

  1. Estudios sobre lisogénesis I.
  2. Las limitaciones del medio LB

¿Para qué se utiliza el medio LB?

Haga clic para leer la respuesta completa. En este sentido, ¿por qué usamos agar LB?

Caldo de LuriaLB) es un medio rico en nutrientes comúnmente usó cultivar bacterias en el laboratorio. La suma de agar para LB da como resultado la formación de un gel que las bacterias pueden crecen, como ellos están incapaz de digerir el agar pero pueden recoger la nutrición de la LB dentro de.

En segundo lugar, ¿de qué está hecho el agar LB? LB Caldo, también conocido como, LB medio, el caldo de lisogenia, el caldo de Luria o el medio de Luria-Bertani, es un medio de uso común rico en nutrientes para el cultivo de bacterias. Descrito por primera vez en 1951 por Giuseppe Bertani, un medio de 1 litro consta de 10 gramos de triptona, 5 gramos de extracto de levadura y 10 gramos de cloruro de sodio.

En este sentido, ¿cuál es la diferencia entre el agar LB y el caldo LB?

Agar es un carbohidrato gelatinoso complejo, y se agrega al Caldo LB, para formar un gel para que las bacterias crezcan como cultivo microbiano. LB es un medio rico que contiene peptona, extracto de levadura, NaCl y agar (para medio sólido).


LB Media

LB es el medio más común utilizado para cultivar recombinantes Escherichia coli (E. coli). Giuseppe Bertani nombró a LB media como “caldo de lisogenia” debido a la investigación que estaba realizando sobre la lisogenia. LB comúnmente se refiere incorrectamente a los medios Luria-Bertani, Luria Broth o Lennox Broth. Los medios LB también se utilizan para cultivar una variedad de otros organismos facultativos.

Componentes de LB Media

Una razón por la que se usa comúnmente LB es porque es simple de hacer, con solo unos pocos ingredientes, triptona, extracto de levadura y cloruro de sodio (NaCl). La triptona, una mezcla de péptidos generados por la digestión de caseína con la enzima pancreática tripsina, proporciona nitrógeno y carbono. El extracto de levadura proporciona vitaminas (incluidas las vitaminas B) y algunos oligoelementos. El NaCl proporciona iones de sodio para el transporte y el equilibrio osmótico. E. coli derivada de la cepa K-12, una de las cepas parentales más comúnmente utilizadas de E. coli en uso en biología molecular hoy en día son deficientes en la producción de vitamina B.

Antecedentes históricos de LB

LB es un medio rico en nutrientes que se ha utilizado desde la década de 1950 para cultivar Enterobacteriaceae y para ensayos de placa de bacteriófagos. LB permite un crecimiento rápido con buenos rendimientos de crecimiento para muchas especies. En 1951, Giuseppe Bertani desarrolló LB para optimizar la formación de placa en un Shigella cepa indicadora de Enterobacteriaceae. Hoy en día, el medio LB es el medio más común para el crecimiento de cepas recombinantes de E. coli. Hay tres formulaciones comunes de LB: LB Miller, LB Lennox y LB Luria. Todos se denominan a veces LB, aunque la formulación de LB Miller es la formulación común o más estándar de LB. Las formulaciones alternativas de LB varían en la concentración de NaCl (Tabla 1).

Tabla 1. Formulaciones de LB.

Ingredientes % Luria (g / L) Lennox (g / L) Miller (g / L)
Triptona 1.0% 10 10 10
Extracto de levadura 0.5% 5 5 5
Cloruro de sodio (NaCl) 0,05, 0,5 o 1,0% 0.5 5 10

La confusión sobre el nombre LB es comprensible dada la historia de Bertani, Luria y Lennox. Giuseppe Bertani era miembro del laboratorio de Luria en la Universidad de Indiana cuando formuló los medios LB. Ed Lennox también fue miembro del laboratorio de Luria y trabajó con Bertani en algunos de los primeros experimentos de lisogenia utilizando Shigella. Salvador Luria publicó un artículo en 1955 en el que copiaba la formulación original de Bertani y LB a veces se atribuye incorrectamente a Luria debido a su estatura científica, por lo que también se puede denominar incorrectamente Luria Broth. La formulación original de Bertani era triptona de Bacto al 1.0% (10.0 g / L), extracto de levadura al 0.5% (5.0 g / L), NaCl al 1.0% (10.0 g / L), glucosa al 0.1% (1.0 g / L) pH ajustado a 7.0 con NaOH 1 N. Se añadió glucosa después de esterilizar en autoclave. Con el tiempo, la adición de glucosa ha desaparecido de todas las formulaciones de LB. El nombre Miller proviene de la formulación del libro. Experimentos en biología molecular de Jeffery Miller, publicado en 1972, que no contiene glucosa. La formulación original y más común de LB, Miller, contiene 1.0% de NaCl. En 1955, Ed Lennox estaba estudiando los mecanismos de síntesis de ADN utilizando cepas de E. coli sensible al estrés osmótico desarrolló una formulación de LB que contiene la mitad de la sal de la formulación original, es decir, 0,5% de NaCl. Esta formulación se conoce como LB Lennox. Hoy, LB Lennox se utiliza para el cultivo de E. coli cuando se usan antibióticos sensibles a la sal como Blasticidin, Puromycin y Zeocin. Una tercera formulación de LB, que contiene la menor cantidad de sal, se denomina LB Luria. Esta formulación contiene 0,05% de NaCl. LB Luria se utiliza para aislar organismos marinos como Vibrio cholerae.

Mecanismos de crecimiento en LB

Los medios LB se diseñaron originalmente para el crecimiento de bacterias a bajas densidades. Se estima que el crecimiento exponencial, un período de crecimiento de estado estacionario, terminará cuando la DO600 (densidad óptica a 600 nm) está entre 0,6 y 1,0. Se sabe que el crecimiento de E. coli en LB generalmente se detiene cuando el OD600 alcanza aproximadamente 2,0 en condiciones normales de crecimiento, lo que corresponde a aproximadamente 0,6 mg E. coli (peso seco) por mL. En 2007, D'Ari y sus colegas llevaron a cabo un estudio exhaustivo de las características de crecimiento en LB, mirando específicamente a la fisiología de E. coli K-12, una de las cepas más comúnmente utilizadas en biología molecular en la actualidad. Demostraron que las células K-12 cultivadas en LB Miller con una DO final600 de 0,6 a 1,0 no siempre están en el mismo estado fisiológico. D’Ari y sus colaboradores confirmaron observaciones anteriores de crecimiento diauxico (crecimiento en dos fases) en LB y notaron que el crecimiento exponencial se detuvo en

sobredosis600 0.3, mucho antes de lo que comúnmente se piensa. Se sabe que E. coli se sabe que tienen un crecimiento deficiente cuando el pH excede 9,0, y no es raro que los medios LB cambien a un pH cercano a 9,0. Sin embargo, cuando D'Ari y sus colaboradores ajustaron el pH de LB, no hubo ningún efecto en la curva de crecimiento, mientras que, cuando se agregó glucosa al medio, los cultivos pudieron crecer hasta una DO.600 6.49. Esto sugiere que el crecimiento de E. coli en LB está limitada en carbono. Como se señaló, la formulación original de LB de Bertani contenía 0,1% de glucosa. Esta investigación demuestra que, si bien LB es un buen medio para el crecimiento de rutina, no debe usarse para estudios fisiológicos donde se requiere reproducibilidad y un período prolongado de crecimiento exponencial.

LB y selección

Existe una variedad de aditivos que se pueden agregar al medio LB para la identificación o selección de una población de organismos. Los antibióticos a menudo se agregan al medio LB para seleccionar células que han sido diseñadas para tener resistencia a uno o más antibióticos. Se puede agregar X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) o Bluo-Gal (indolil-β-galactósido halogenado) al medio LB para el cribado azul-blanco para la inserción de la secuencia en un sitio de clonación múltiple (MCS) en un plásmido que contiene el fragmento α del gen de la β-galactosidasa. Para inducir la expresión de genes controlados por el promotor lac, se añade al medio el análogo de lactosa no metabolizable IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido). En las bacterias en las que no hay una secuencia insertada en el plásmido, las colonias de MCS serán azules, ya que X-Gal o Bluo-Gal serán escindidas por la β-galactosidasa para formar 5-bromo-4-cloro-indoxilo. Para los plásmidos donde hay una inserción, no habrá una β-galactosidasa funcional y las colonias permanecerán blancas.


Lisogenia a mediados del siglo XX: P1, P2 y otros sistemas experimentales

La mayoría de nosotros que investigamos tenemos un material preferido, un conjunto de técnicas probadas, una lista permanente de problemas no resueltos, formas de ver o hacer las cosas, que compartimos en gran medida con colegas del mismo laboratorio y otros en la misma área de especialización, ya sean amigos, antiguos socios o competidores. Todo esto y más está abarcado por el concepto de & # x0201cexperimental system & # x0201d tal como lo introdujo y utilizó Hans-J & # x000f6rg Rheinberger (76, 77), un historiador de la ciencia. Su concepto, bastante flexible y rico en metáforas, puede adaptarse fácilmente a la narrativa actual, que procede de una visión personal más que de un examen histórico crítico. Una cuidadosa restricción de material, técnicas y nomenclatura permite interacciones más constructivas entre diferentes laboratorios y diferentes generaciones de científicos en el mismo campo. Por supuesto, si se lleva a cabo en exceso, este proceso sofocará los desarrollos en nuevas áreas y pospondrá algunos descubrimientos. Max Delbr & # x000fcck, quien a principios de los años cuarenta había defendido enérgicamente el estudio de los bacteriófagos como el camino real hacia los secretos de la replicación y la recombinación, fue bastante franco sobre la necesidad de que los trabajadores de ese camino usaran un material común (los fagos T en Escherichia coli B) y técnicas estandarizadas con precisión (1). Por supuesto, los fagos T son generalmente parásitos de bacterias virulentos, que no se toman prisioneros y, por lo tanto, no podrían instruirnos sobre las interacciones más oscuras entre los bacteriófagos & # x0201cweaker & # x0201d y sus huéspedes bacterianos: sobre la lisogenia, donde la infección se encuentra con la herencia.

El término lisogenético & # x02014generador de lisis & # x02014 se aplicó muy pronto después del descubrimiento de los bacteriófagos y se utilizó al principio de formas descriptivas y acríticas. Por otro lado, los cultivos bacterianos que espontáneamente (es decir, en ausencia de una infección obvia del exterior) produjeron bacteriófagos, pero crecieron bien, sin evidencia evidente de lisis, se aislaron ya en 1922. Se debatieron diversas interpretaciones de ida y vuelta para varios años, con bastante ferocidad en la comunidad de investigación médica francófona. Si bien el desarrollo del concepto ha sido bien resumido (68), merece una mirada seria desde el punto de vista de la historia y la filosofía de la ciencia. El sabor de los debates lo transmite uno de los participantes, Paul Flu (42 ver también referencia 84). Eug & # x000e8ne Wollman (90, 91) del Institut Pasteur fue uno de los pocos que vio en ese momento las implicaciones genéticas de los conceptos de lisogenia. La genética estaba entonces bastante subdesarrollada en los países latinos de Europa, siendo la inmunología la estrella del día en los barrios médicos. Además, el debate rara vez se centró en un tipo de experimento con material bien definido y disponible en general. A principios de los años treinta se llegó a una definición de lisogenia (26) que sigue siendo válida, obviamente sin implicaciones moleculares modernas. Anlage, una palabra alemana utilizada en embriología, fue aplicada por Burnet y McKie (27) a lo que ahora llamamos profago. El concepto de Anlage o profago se basaba en el hecho de que nadie había logrado, utilizando una variedad de métodos, demostrar la presencia de partículas de fagos infecciosos dentro de una bacteria lisogénica. La Segunda Guerra Mundial interrumpió gran parte de este trabajo. Los Wollman murieron, y Flu apenas sobrevivió, en los campos de concentración nazis. Burnet tomó un trabajo de orientación más médica.

Encontré la lisogenia a principios de 1949 mientras estaba en Cold Spring Harbor como investigador en el laboratorio de Milislav Demerec. Estaba estudiando la mutación espontánea e inducida en un paciente dependiente de estreptomicina. E. coli Cepa B. Nunca antes había trabajado con bacterias. Una vez desconcertado por una colonia que parecía mordisqueada sectorialmente, se lo mostré a Evelyn Witkin y al difunto Gus Doermann, quienes, afortunadamente para mí, tenían sus laboratorios justo al lado de mi habitación. Ellos sugirieron la explicación obvia, contaminación por fagos, pero uno de ellos agregó & # x0201cTambién hay algo llamado lisogenia & # x02026 & # x0201d (En realidad, en ese momento la palabra inglesa en uso era lisogénesis o lisogenicidad). Nunca había oído hablar de lisogenia antes. (aunque había estado expuesto a las obras de Paul Buchner [25] sobre endosimbiosis) y comencé a buscar más información en la biblioteca.

Aproximadamente al mismo tiempo, sin que yo lo supiera, habían ocurrido dos eventos importantes. En Madison, Esther y Joshua Lederberg, en el curso de su trabajo sobre la cepa K-12 de E. coli, entonces la única bacteria & # x02014 aparte de Neumococo& # x02014 conocido por intercambiar material genético, aisló un mutante que se lisó inesperadamente cuando entró en contacto con la cepa parental. Llegaron a la conclusión de que la cepa K-12 original era lisogénica para un fago previamente insospechado, al que llamaron lambda, pensando que podría ser algo como el factor kappa de Tracy Sonneborn en Paramecio. Esto se comunicó brevemente en el primer número (enero de 1950) del Boletín informal de genética microbiana de Witkin. La publicación real llegó mucho más tarde (58). En París, Andr & # x000e9 Lwoff, un conocido protozoólogo y fisiólogo bacteriano, abordó la cuestión de cómo las bacterias lisogénicas producen las partículas de fagos. El problema fue atacado con valentía mediante la micromanipulación directa de bacterias lisogénicas individuales o pequeñas, las de gran tamaño Bacillus megaterium, cultivado en una gota de caldo bajo el microscopio. A intervalos, se eliminó el líquido que rodeaba a las bacterias, se reemplazó con caldo fresco y luego se analizó la presencia de bacteriófagos. Al mismo tiempo, se registró el número de bacterias en la gota y se examinó la gota en busca de bacterias que pudieran estar lisando. Un resultado importante fue que cuando la gota contenía fagos, éstos estaban presentes en grandes cantidades, como cabría esperar de la lisis repentina de una o más bacterias. Por el contrario, se demostró que las bacterias podían crecer y dividirse varias veces sin producir ningún fago. Sin embargo, la correlación de la producción de fagos con la lisis celular no pudo demostrarse de inmediato. Esto se aclaró más tarde con el hallazgo de que B. megaterium las células tenían la propiedad de lisarse de manera espontánea y no productiva, dejando un fantasma celular visible, mientras que la lisis ligada a la producción de fagos era extremadamente rápida y no dejaba rastros microscópicamente visibles de los cuerpos bacterianos (69, 70).

En el otoño de 1949 me incorporé a Salvador Luria en la Universidad de Indiana en Bloomington. Mientras hacíamos planes de trabajo, propuse estudiar lisogenia. Luria no estaba muy contento con eso, ya que tenía en mente otros problemas relacionados con el desarrollo del virulento fago T2 (en el que, sin embargo, trabajé durante varios meses). Quizás & # x02014 supongo & # x02014 que no había mencionado la lisogenia en su propuesta de beca de investigación. & # X02009. & # X02009. & # X02009. No obstante, fue muy cooperativo y prometió intentar obtener algunas cepas que pudiera utilizar para estudiar la lisogenia. De hecho, en enero de 1950, recibimos de las cepas indicadoras de Lederberg que podrían usarse con K-12 y también con la cepa clásica de Lisbonne, un lisogénico E. coli cepa aislada a principios de los años veinte por M. Lisbonne y L. Carr & # x000e8re, junto con su Shigella indicador. Inmediatamente comencé a trabajar en ambos conjuntos de cepas, observando sus propiedades culturales y tratando de optimizar el crecimiento y la formación de placa. La ventaja obvia de K-12 y lambda era que se podía combinar el estudio de los fagos con el de la recombinación bacteriana, como de hecho también habían comenzado a hacer los Lederberg. La alternativa requería el uso de Shigella, oficialmente un patógeno, lo que requeriría precauciones de seguridad de laboratorio más estrictas que el uso de E. coli. Desafortunadamente, unas semanas después, Luria conoció a Joshua Lederberg en una reunión y entendió que él y Esther hubieran preferido mucho que yo no trabajara en lambda. Estaba bastante disgustado en ese momento, aunque reconocí que la solicitud de los Lederberg estaba dentro de sus derechos, ya que su descubrimiento de lambda aún no se había publicado en la literatura abierta. Luria, Jim Watson (entonces en su último año de la escuela de posgrado en Bloomington) y yo compartíamos un laboratorio pequeño, en el que se había recortado un rincón para el escritorio de Luria. Una tarde, tuvimos una seria discusión sobre cómo proceder en vista de la solicitud de los Lederberg. Recuerdo a Jim declarando a voz en grito que no le gustaría estar en un laboratorio donde uno usaba rutinariamente el presumiblemente patógeno. Shigella. Sin embargo, Luria me convenció de que dejara a lambda en paz, al menos por un tiempo, y acepté el desafío de tener un cuidado extra en el manejo. Shigella. Sin embargo, mirando hacia atrás, parece que este episodio menor nunca me permitió desarrollar el & # x0201c sentimiento adecuado para el organismo & # x0201d (43) con respecto a lambda.

Usando la cepa Lisbonne (simbolizada por brevedad como Li) y Shigella, Me propuse investigar esencialmente el mismo problema que Lwoff. Habiendo sufrido las fatigas de la micromanipulación en el curso de mi trabajo de tesis (4), la idea de utilizar su enfoque nunca se me pasó por la cabeza. Además, la producción de fagos en lisogénicos B. megaterium es inusualmente alto (por ejemplo, una partícula de fago libre por cada dos bacterias) en comparación con otras cepas lisogénicas (un pequeño porcentaje de fagos libres), por lo que el enfoque microscópico directo difícilmente tendría éxito con la mayoría de las cepas. Primero me aislé de Shigella un mutante resistente a la estreptomicina (más tarde conocido como Sh / s o Sh-16) y mostró que el fago producido por el lisógeno de Li no fue afectado por la estreptomicina. A continuación, configuré lo que llamé un experimento & # x0201cmodified single burst & # x0201d, en el que se distribuyeron bacterias lisogénicas de crecimiento exponencial (lavadas para eliminar cualquier fago libre) entre un conjunto de tubos, y después de una incubación adicional, se distribuyó todo el contenido de cada tubo. plateado con el indicador resistente a estreptomicina y una gota de estreptomicina. Esta técnica puntúa sólo el fago libre presente en el momento de la siembra en placa y no el fago que producirían las bacterias lisogénicas, en ausencia de estreptomicina, en las placas. Si el fago se produjera de forma continua durante el crecimiento del lisógeno, las placas tendrían placas distribuidas al azar. Si los cultivos lisogénicos produjeran fagos en & # x0201c ráfagas, & # x0201d como cuando una célula sensible a fagos es infectada por un fago virulento, la mayoría de las placas no tendrían placas y algunas tendrían un gran número de placas, es decir, presumiblemente, toda la progenie del fago de una bacteria. Una vez que se ajustaron los parámetros, el experimento funcionó a la perfección (5). Confirmó que la producción de fagos por un lisógeno era discontinua, involucrando raros y grandes estallidos de fagos. Por lo tanto, un día de trabajo permitió medir la frecuencia de producción espontánea de fagos, incluso a niveles muy bajos (una ráfaga por cada 45.000 generaciones de células para la cepa Li), y el tamaño medio de la ráfaga: más de lo que se podría obtener en meses de micromanipulación. Pero había una sorpresa reservada: aunque se sabía que el fago recuperado de cultivos de la cepa Li era bastante heterogéneo en cuanto al tamaño de la placa, en mi experimento las placas se veían diferentes en diferentes ráfagas. Investigaciones posteriores mostraron que la cepa Li sí produjo tres tipos de fagos inmunológicamente distintos, a los que llamé P1, P2 y P3, los tres capaces de establecer de forma independiente la lisogenia en el Shigella tensión y que por regla general se producían en ráfagas homogéneas, independientemente unas de otras (5). Continué trabajando con los fagos de la cepa Li, prestando especial atención a P2, en la que era relativamente fácil reconocer varios mutantes de tipo placa.

Mientras tanto, en el Pasteur, Lwoff y varios colaboradores habían estado buscando condiciones que pudieran afectar la & # x0201cdecision & # x0201d de una célula lisogénica para pasar del crecimiento normal a la producción suicida de un estallido de fagos. Después del fracaso de varios tratamientos químicos, obtuvieron un éxito espectacular: la exposición a una dosis muy pequeña de luz ultravioleta causó casi todas las bacterias en su lisogenicidad. B. megaterium cultivos para lisar y producir una explosión de fagos (71). El descubrimiento de la inducción UV, como se llamó al nuevo fenómeno, atrajo mucha atención a la lisogenia. Incluso Delbr & # x000fcck, que sólo unos años antes había expresado sus dudas al respecto (39), abrazó la lisogenia, sobre todo, debería agregarse, a través del entusiasmo de su colega, Jean Weigle, profesor de física en la Universidad de Ginebra, quien había en ese momento se jubiló anticipadamente y se comprometió a investigar sobre los fagos (83). Pronto se descubrió que también un fago en Pseudomonas (51) y lambda en E. coli K-12 (89) podría ser inducido por luz ultravioleta. Por otro lado, mis intentos de inducir cepas Li o Sh (P2) (es decir., Shigella los aislamientos lisogénicos para P2) fueron totalmente negativos. Esto fue decepcionante, pero también fue el primer indicio de que podría haber diferencias biológicas básicas entre los sistemas lisogénicos.

Quedaron abiertas varias cuestiones interesantes sobre la lisogenia. En una bacteria lisogénica establecida, ¿habría una copia de profago o muchas copias? Si solo fuera uno, ¿cómo se segregaría regularmente en la división celular? ¿Y cuál fue el modus operandi de la inmunidad a la superinfección? ¿Se debió la inmunidad a un producto específico de profago difusible (& # x0201cinmunity substancia & # x0201d, & # x0201crepressor & # x0201d), que bloquearía el desarrollo de un fago superinfectante, o fue el resultado de alguna interacción necesaria con un sitio bacteriano especial ? Los cruces bacterianos preliminares de Esther Lederberg, mencionados en su informe de 1950, habían indicado algún tipo de vínculo, aunque complejo, entre la lisogenia lambda y ciertos marcadores genéticos en K-12. La posibilidad de control cromosómico de una población de elementos citoplásmicos (como en el caso de kappa en Paramecio) no fue excluido. Usé mutaciones de tipo placa P2 como marcadores en la superinfección de Sh (P2) células lisogénicas, tratando de seguir el destino del fago superinfectante. Resultó que este último no fue degradado ni rechazado por el sistema inmunológico del lisógeno, solo se bloqueó en su replicación (como & # x0201c preprófago de superinfección & # x0201d) y se distribuyó aleatoriamente a las células hijas a medida que el lisógeno continuaba creciendo y dividiéndose. . Cuando una célula que lo portaba se lisiaba, el fago superinfectante participaba en el estallido esencialmente en pie de igualdad con el profago. En raras ocasiones, el profago residente (o algunos de sus genes) sería reemplazado por el tipo superinfectante. Aún más raramente se establecería una cepa estable doblemente lisogénica. Un mutante P2 (el tipo de placa transparente & # x0201c virulento débil & # x0201d) que había perdido la capacidad de lisogenizar podría ser transportado en el estado bloqueado durante varias generaciones de células y, en raras ocasiones, incluso comportarse como un segundo profago, es decir, ser heredado por todos. las células de la progenie, mientras el profago original (tipo de placa turbia) estuvo presente, se comportó como se esperaba de un mutante con una mutación recesiva que afecta la inmunidad. Estos resultados (6, 7, 8, 9, 10), aunque abiertos a interpretaciones más complejas, apoyaban bien tanto la idea de un profago, o excepcionalmente dos, por célula bacteriana (más precisamente, por nucleoide) como el concepto de un profago específico. producto de profago que interactúa con el fago superinfectante. Mientras tanto, una nueva cepa de E. coli, luego llamado C (16), apareció en escena, indirectamente como resultado de un hallazgo de Cavalli y Heslot (35). La cepa C fue sensible a lambda y a todos los fagos de la cepa Li, dio placas decentes con P2, y además (35) se cruzaría con cepas K-12. Gradualmente, cambié de Shigella a la cepa C durante la mayor parte del trabajo con P2, y luego se podrían realizar cruces bacterianos para establecer la ubicación cromosómica del profago (10, 14). Si bien aquí enfatizo el trabajo con P2, la mayoría de los lectores sabrán que durante ese tiempo (1951 a 1957) se logró un rápido progreso en la comprensión de la genética de K-12 y lambda, como luego lo revisaron (53) dos de sus principales contribuyentes. . Quedó bastante claro que el profago lambda en sí estaba anclado en un sitio específico, que al principio se pensó que era el único posible, en el cromosoma bacteriano. Un análisis de ligamiento detallado (28) y las entonces nuevas nociones de circularidad cromosómica llevaron a la propuesta de Allan Campbell de su conocido modelo de integración.

Fuera de la lisogenia, P1 y P2 también contribuyeron de manera más general al progreso inicial de la genética bacteriana. (Poco se hizo con P3.) Un ejemplo es el descubrimiento de & # x0201 variación controlada por el costo & # x0201d, ahora más comúnmente llamada & # x0201crestricción y modificación. & # X0201d Lo noté en P2 (usando la cepa B como el host de restricción , Shigella siendo el anfitrión estándar) y no sabía qué hacer con él. Jean Weigle, con quien mantenía correspondencia a menudo, lo notó en lambda (usando la cepa C como anfitrión permisivo, siendo K-12 el anfitrión estándar). Al conocer mis resultados, reconoció de inmediato las similitudes de los dos hallazgos. Poco antes de eso, un accidente de laboratorio menor, según lo relatado por Luria (66), había llevado al descubrimiento de otro caso, aunque más complejo, de variación controlada por el huésped (67). Aunque no se vislumbraba una explicación mecanicista satisfactoria en ese momento, Jean y yo estábamos animados por el paralelismo entre nuestros dos & # x0201csystems & # x0201d, totalmente independientes y decidimos publicar nuestros hallazgos juntos (16). Rara vez ocurre que un fenómeno nuevo, observado en dos sistemas diferentes, en laboratorios diferentes, se describe en el mismo artículo, de manera comparativa. Esto fortaleció la evidencia e insinuó la generalidad del fenómeno, al tiempo que puntuó la cooperación frente a la competencia en ciencia y asuntos humanos. (Un caso similar, varios años después, fue el de un artículo de Ren & # x000e9 Thomas y Elizabeth Bertani [87], que informó de experimentos paralelos con lambda y con P2 para definir con mayor precisión el modo de acción del represor de la inmunidad). P2 en E. coli B condujo a otro hallazgo inesperado: la presencia de un profago defectuoso (relacionado con P2 pero con una especificidad de inmunidad diferente) en esta cepa huésped de fagos más tradicional (37). Hoy en día, los profagos defectuosos son un hallazgo casi diario en los análisis genómicos de bacterias.

P1 también dio algunas sorpresas. Su establecimiento de lisogenia en Shigella estaba casi absolutamente controlado por la temperatura (17): muy altas frecuencias de lisogenización y sin producción inmediata de fagos cuando las bacterias infectadas se mantuvieron a 20 ° C después de la infección, 100% de lisis con producción de fagos a 40 ° C. Esta propiedad aparentemente se perdió ya que P1 fue & # x0201cadapted, & # x0201d a través de al menos dos pasos mutacionales, k y C (60, 88), para crecer de manera más eficiente en K-12, y nadie ha regresado al estudio del tipo salvaje original en Shigella. La razón de esta negligencia, por supuesto, es el hecho de que se descubrió que P1 era capaz de transducción y comenzó a usarse casi exclusivamente en derivados de K-12. Transducción, descubierto en 1951 por Zinder y Lederberg en Salmonela (94), y se correlacionó con el fago P22, permitió el análisis genético de mutaciones estrechamente vinculadas pero sin mapeo general. Por otro lado, el mapeo de estructura fina todavía era impracticable con E. coli K-12. El mérito de descubrir esta capacidad de P1 es para Ed Lennox, un físico en proceso de conversión a la biología, quien una mañana a principios de 1954 entró en nuestro laboratorio proclamando: & # x0201cJoe, ¡intentemos y veamos si tus fagos pueden transducir! & # x0201d Para entonces tenía algunos mutantes auxotróficos de la cepa C que podrían usarse para probar la idea. Hicimos el experimento al día siguiente y resultó que, de hecho, P1 (pero no P2) era un transductor muy eficiente. Todavía tengo una copia de una carta a Jean Weigle, fechada el 16 de abril, donde escribí con entusiasmo: & # x0201c Pasamos una semana de gran emoción (es decir, Ed Lennox y yo). Mi fago P1 puede transducir. P1 cultivado en Shiga puede transducir el carácter de Arginina en coli C, un marcador de galactosa también en coli C, y un marcador de estreptomicina en coli B. ¿Suficiente? & # X02026 Será posible estudiar la transducción y la recombinación genética en el mismo organismo, comparar el efecto de la temperatura en la lisogenización y tal vez en la transducción, quizás tener éxito en la transducción del profago P2 a través del fago P1, etcétera, etcétera. & # X0201d El hallazgo fue informó en la reunión de Oak Ridge sobre la recombinación genética esa misma primavera (59) y fue seguido por el artículo muy completo de Lennox (60). Tanto Lennox (60) como Jacob (52) demostraron cotransducibilidad del profago lambda con marcadores bacterianos. Posteriormente, los profagos P2 en tres sitios diferentes fueron cotransducidos y orientados por medio de P1 (31).

Mientras los genetistas más antiguos estaban infectando y cruzando, los métodos de lo que ahora es la biología molecular aparecieron en escena, inmediatamente después de la microscopía electrónica y la ultracentrifugación. Durante algunas décadas, el entusiasmo por lambda como sistema experimental convirtió a lambda en el paradigma de la lisogenia (47, 48, 75, 82). Ahora es tan conocido hasta el nivel molecular que es útil modelarlo in silico (2). P1 también atrajo a numerosos seguidores, al principio como una herramienta en la transducción y luego por derecho propio (93), debido a su comportamiento cromosómico inusual (50). Algunos, incluyéndome a mí, seguimos trabajando en P2, aunque a veces con una sensación de aislamiento y la preocupación de que quizás sus diferencias con lambda no fueran lo suficientemente importantes para justificar el esfuerzo. Creo que este resultó no ser el caso (12).

Las partículas de P2 y lambda difieren estructuralmente. A diferencia de lambda, la replicación del ADN P2 sigue un modelo típico de círculo rodante a lo largo de su ciclo reproductivo (54, 64, 73, 79). Esto había sido sugerido por dos hallazgos sorprendentes, los estrictos requisitos de replicación del ADN P2 para la función Rep de la célula huésped (32) y para una cisproteína de fago que actúa (62), como es el caso del fago virulento, muy diferente, & # x003c6X174. La encapsidación se produce directamente a partir de círculos monoméricos (74). En el cromosoma bacteriano existen varios sitios de unión específicos de P2, diferentes del de lambda (3, 14, 33, 55). La recombinación genética en infecciones mixtas P2 ocurre con una frecuencia extremadamente baja (11, 15): el mapa genético P2 (13, 61) tuvo que obtenerse con la ayuda de irradiación UV para estimular la recombinación. El circuito regulador P2, lisis versus lisogenia, es más simple (78) que el de lambda. El mecanismo de integración del profago P2, aunque es una recombinación específica de sitio típica, tiene características especiales (20, 30, 46), en parte responsables de bloquear el desprendimiento del profago en la desrepresión. No se conoce ningún caso de transducción especializada en P2, por otro lado, se ha descrito su evento complementario & # x02014educción de un marcador bacteriano & # x02014 (56). Un gran impulso para los estudios de P2 fue el descubrimiento en 1966 por Erich Six (81) del notable fago satélite P4 y sus complejas interacciones (& # x0201ctransactivation & # x0201d) con P2 y fagos similares a P2 (22, 29, 36, 65) . Varias observaciones muy intrigantes, propias de P2, siguen sin comprenderse completamente y merecen más estudio: efectos metabólicos sorprendentes sobre la frecuencia de lisogenización (18, 19) sensibilización celular a un producto molecular pequeño (21) las interacciones complejas entre el gen no esencial P2 viejo, la célula huésped y un fago lambda coinfectante (24, 44, 63, 72, 80) y otros. Based on the results of screens of coliforms in Paris and Los Angeles (23, 53) and the Dhillons' extensive work in Hong Kong (40), it became clear that—to the extent that modern notions of segmental evolution (57) allow it— P2 and lambda are representative of two main groups of temperate phages for such bacteria. Within the P2-like group, phage 186 was studied in great genetic and molecular detail by Barry Egan and his students (41, 92) phage 299 was studied to a lesser extent by E. I. Golub (45). More recently, other phages obviously related to P2 have been encountered in several other species besides E. coli and as defective prophages in DNA sequencing studies (34).

The above recollections seem to indicate that at about the middle of the last century, starting before the formulation of the DNA structure and independently of the introduction and diffusion of “molecular” methods of analysis, there was a confluence of the rigorous approach of phage work with more traditional bacteriological perspectives, energized by the new remarkable findings about gene transfer. Studies of lysogeny were rather central in this process of broadening interest with respect to problems and materials. As a result, several new 𠇎xperimental systems” à la Rheinberger were developed in the fifties and sixties, lambda being the most successful. One is tempted to generalize these observations and suggest that it is the way of scientific progress to alternate between periods of broad and somewhat haphazard exploration and periods of highly focused in-depth analysis of particular problems or materials. On the one hand, as Francis Crick once wrote (38), �w molecular biologists would care to be caught studying the colour of butterflies' wings… .” The tendency in molecular biology (as it was, mutatis mutandis, in classical genetics) is for one to analyze the experimental material to the lowest possible structural level and thus invest heavily in one's system. On the other hand, the naturalist looks open mindedly for what may happen to be there and how it might be related to what has already been seen: in a way, he scouts for new experimental systems.

A comment may be made concerning induction: not lambda's, that of philosophers. It is hard to see how our intelligent species would have ever evolved without trusting induction, yet there are everyday examples of the risks of excessive reliance upon inductive predictions. Después de la B. megaterium phage, a phage in Pseudomonas, and lambda in K-12 were found to be inducible by UV light, it was hard to believe that P2 was not. How do you prove a negative? Similarly, after seeing that both lambda and P2 prophages were present in single copies, physically integrated in the bacterial chromosome at specific sites, it was very surprising when P1 was found to be present as one unattached copy and yet be regularly transmitted to the bacterial progeny without losses (50) or Mu to be capable of inserting itself anywhere in the chromosome (85, 86). Perhaps most surprising, after the early efforts had convinced everyone that lysogens produce phage through the lysis of individual cells, was the discovery that filamentous phages are indeed continuously secreted by growing cells, without lysis (49).

Postscript. My first paper on lysogeny (5), describing the modified single-burst experiment and the isolation of P1, P2, and P3, also contained the formula of the LB medium which I had concocted in order to optimize Shigella growth and plaque formation. Its use has since become very popular. The acronym has been variously interpreted, perhaps flatteringly, but incorrectly, as Luria broth, Lennox broth, or Luria-Bertani medium. For the historical record, the abbreviation LB was intended to stand for “lysogeny broth.”


PDusk and pDawn

The pDusk and pDawn plasmids are engineered DNA systems that allow someone to control gene expression using light. Both pDusk and pDawn make R e d Fluorescent Protein (RFP), wh ich makes the colonies reddish in color. The difference is that pDawn turns on the RFP gene when exposed to light, while pDusk will only make RFP when kept in the dark . The pDawn system allows you to control the expression of RFP in the light. This kit teaches you many basic molecular biology techniques, while also giving you the ability to perform cool experiments using light to control gene expression.

The pDusk and pDawn systems are activated by blue light but since most white light contains blue light any sort of ambient light should work.

  • 1 hour Make plates (set aside more time if it's your first time making plates)
  • streak out bacteria onto an LB Agar plate (takes

Day of experiment overview

    Mix bacteria t ogether with the plasmids, and transformation mix (takes

Incubate and wait for growth

1 hour, but leave more time if it&rsquos your first time)

Step by step walk-through of making plates with photos at: https://goo.gl/7yzpA1

Agar plates provide a solid media nutrient source for bacteri a to grow on. The standard media that is used is LB (Luria Broth, Lysogeny Broth, or Luria Bertani Broth). This contains a carbon source, a nitrogen source, and salt (many strains of bacteria like salt!).

The top of the plate is the larger part.

  1. Find the tube labelled &ldquoLB Agar M edia &rdquo dump its contents into the 250mL glass bottle. (You will need to make plates out of each kind of media . Rinse bottle between media. )
  1. Using the 50mL conical tube labelled &ldquo Tube for Measuring &rdquo, measure and add 150mL of water to the glass bottle.
  1. Making agar is like making jello-- heat the agar to dissolve it, then it will solidify when it cools. Heat the bottle in the microwave for 30 seconds at a time, being careful not to let the bottle boil over. DO NOT SCREW THE LID DOWN TIGHT! (just place it on top and give it a slight turn).
  1. The media is completely dissolved when the liquid looks yel low . This should take about 2 -3 minutes total of microwaving. Take the bottle out , (caution contents hot), and let it cool until you are able to touch it without much discomfort. This will take 20-30 minutes.
  1. While the bottle remains somewhat warm, pour the plates. One at a time, remove the lid of 7 plates and pour just enough of the LB agar from the bottle to cover the bottom half of the plate. Put the lid back on.

Making Competent Bacterial Cells for Transformation

&lsquoCompetent&rsquo means the bacterial cells are able to intake foreign DNA. The cells&rsquo walls normally prevent things from entering , but mixing the bacteria with chemicals and salts that change the cells&rsquo walls, allow the cells take up DNA from the environment. This process is called a &lsquotransformation&rsquo. We put all the components into synthetic DNA to trick the bacteria into thinking that our DNA is its own DNA , so they make the RFP.

The bacterial transformation mix contains:

10% Polyethylene Glycol(PEG) 8000

PEG 8000 is thought to play several different roles in transformation, though nobody really knows for certain. Since both DNA and cell walls are negatively charged, they reject each other. PEG 8000 is thought to function by shielding the charge of the DNA, thereby making it easier to permeate the cell wall. PEG 8000 is also thought to help transport the DNA into the cell, as well as make the cell membrane itself more porous.

5% Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

DMSO is sometimes used to treat ailments in humans. In a transformation it is thought to permeabilize the cell wall. Also, sometimes DNA folds into complex structures that make it more difficult to pass through the cell wall. DMSO also might help to break these DNA structures down.

25mM Calcium Chloride(CaCl 2 )

Similarly to PEG 8000, CaCl 2 is thought to shield and neutralize the negative charge of DNA, thereby making it more likely to enter into the cell.

    Take one of the tubes of dried E. coli BL21, add water to the top and shake till it is all dissolved. Next, using your pipette put 100uL of the bacteria solution onto a new LB plate you made and using an inoculation loop gently spread or &ldquostreak&rdquo the bacteria. Let the plate grow overnight

  1. Use a syringe to transfer 0. 1 mL of Transformation mix to a microcentrifuge tube with pDawn . Make sure you mix the transformation mix with the tiny droplet of pDawn DNA in the microcentrifuge tube. Repeat with with pDusk DNA using another syringe. (Syringes can be washed with soap and water for reuse!!)
  1. Using an inoculation loop, gently scrape an area of the size of a pencil eraser of bacteria off of your fresh plate and mix it into the transformation p Dawn mix. Mix until any big clumps have disappeared. Twirling the inoculation loop can work, but avoid making bubbles. Repeat with pDusk using a clean inoculation loop.
  1. Make a warm water bath for the next step. The water should be 42ºC (108ºF) water. You can approximate this temperature by using water that is warm, but comfortable enough such that you can still keep you hand in it.
  1. Add 1.5 mL of room temperature water (or fill to the top) to one of the LB media microcentrifuge tubes and shake to dissolve the LB.
  1. Using a clean syringe , add 0.5 mL of LB media to your competent cell mixture containing your DNA.
  1. Incubate the tube at 37 º C (99 º F) for 2 hour or 4 hours at room temperature. This step allows to bacteria to recover and replicate the DNA and perform the engineering process. Take an LB/ Kan plate out of the fridge and bring them to room temperature
  1. Pour half of the LB/competent cell mix to your LB/Kan plates and gently spread the bacteria around the plate with an inoculation loop. L et dry for 10 minutes before putting the lid back on.
  1. Flip the plate upside down to prevent condensation from forming and dripping onto your bacteria.
  1. Incubate the plate at room temperature for 24-48 hours. Keep pDusk in a dark place or wrap the plate with tin foil.
  1. If your transformation was successful, you should have a plate that looks like the one below. If you kept it in the dark the pDusk plate should look a little red. If you kept it in the light the pDawn plate should look red. If not, give it another shot, Science doesn&rsquot always work on the first try. Also, feel free to contact us at [email protected] and we will help you troubleshoot.

Now that you have colonies growing, you can do a couple of tests to see how pDusk and pDawn behave differently in light and in dark conditions.


Contenido

The most common growth media for microorganisms are nutrient broths (liquid nutrient medium) or lysogeny broth medium. Liquid media are often mixed with agar and poured via a sterile media dispenser into Petri dishes to solidify. These agar plates provide a solid medium on which microbes may be cultured. They remain solid, as very few bacteria are able to decompose agar (the exception being some species in the genera: Cytophaga, Flavobacterium, Bacilo, Pseudomonas, y Alcaligenes). Bacteria grown in liquid cultures often form colloidal suspensions. [4] [5]

The difference between growth media used for cell culture and those used for microbiological culture is that cells derived from whole organisms and grown in culture often cannot grow without the addition of, for instance, hormones or growth factors which usually occur en vivo. [6] In the case of animal cells, this difficulty is often addressed by the addition of blood serum or a synthetic serum replacement to the medium. In the case of microorganisms, no such limitations exist, as they are often unicellular organisms. One other major difference is that animal cells in culture are often grown on a flat surface to which they attach, and the medium is provided in a liquid form, which covers the cells. In contrast, bacteria such as Escherichia coli may be grown on solid or in liquid media.

An important distinction between growth media types is that of defined versus undefined media. [1] A defined medium will have known quantities of all ingredients. For microorganisms, they consist of providing trace elements and vitamins required by the microbe and especially defined carbon and nitrogen sources. Glucose or glycerol are often used as carbon sources, and ammonium salts or nitrates as inorganic nitrogen sources. An undefined medium has some complex ingredients, such as yeast extract or casein hydrolysate, which consist of a mixture of many chemical species in unknown proportions. Undefined media are sometimes chosen based on price and sometimes by necessity – some microorganisms have never been cultured on defined media.

A good example of a growth medium is the wort used to make beer. The wort contains all the nutrients required for yeast growth, and under anaerobic conditions, alcohol is produced. When the fermentation process is complete, the combination of medium and dormant microbes, now beer, is ready for consumption. The main types are

  • cultural media
  • minimal media
  • selective media
  • differential media
  • transport media
  • indicator media

Culture media Edit

Culture media contain all the elements that most bacteria need for growth and are not selective, so they are used for the general cultivation and maintenance of bacteria kept in laboratory culture collections.

An undefined medium (also known as a basal or complex medium) contains:

  • a carbon source such as glucose
  • agua
  • various salts
  • a source of amino acids and nitrogen (e.g. beef, yeast extract)

This is an undefined medium because the amino-acid source contains a variety of compounds the exact composition is unknown.

A defined medium (also known as chemically defined medium or synthetic medium) is a medium in which

Examples of nutrient media:

Minimal media Edit

A defined medium that has just enough ingredients to support growth is called a "minimal medium". The number of ingredients that must be added to a minimal medium varies enormously depending on which microorganism is being grown. [7] Minimal media are those that contain the minimum nutrients possible for colony growth, generally without the presence of amino acids, and are often used by microbiologists and geneticists to grow "wild-type" microorganisms. Minimal media can also be used to select for or against recombinants or exconjugants.

Minimal medium typically contains:

  • a carbon source, which may be a sugar such as glucose, or a less energy-rich source such as succinate
  • various salts, which may vary among bacteria species and growing conditions these generally provide essential elements such as magnesium, nitrogen, phosphorus, and sulfur to allow the bacteria to synthesize protein and nucleic acids
  • agua

Supplementary minimal media are minimal media that also contains a single selected agent, usually an amino acid or a sugar. This supplementation allows for the culturing of specific lines of auxotrophic recombinants.


Examples of lysogeny broth in the following topics:

Culture Media

  • The most common growth media nutrient broths (liquid nutrient medium) or LB medium (LysogenyBroth) are liquid.

Plasmids and Lysogeny

  • Both plasmids and lysogeny are used by bacteria and viruses to ensure transfer of genes and nucleic acids for viral reproduction.
  • Lysogeny is the process by which a bacteriophageintegrates its nucleic acids into a host bacterium's genome.
  • Lysogeny is utilized by viruses to ensure the maintenance of viral nucleic acids within the genome of the bacterium host.
  • Lysogeny is one of two major methods of viral reproduction utilized by viruses.
  • An example of a virus which can promote the transformation of bacterium from a nontoxic to toxic strain via lysogeny is the CTXφ virus.

Temperate Bacteriophages: Lambda and P1

  • With phage the term virulent is often used as an antonym to temperate, but more strictly a virulent phage is one that has lost its ability to display lysogeny through mutation, rather than a phage lineage with no genetic potential to ever display lysogeny (which more properly would be described as an obligately lytic phage).
  • En lysogeny, P1 can exist within a bacterial cell as a circular DNA, in that it exists by replicating as if it were a plasmid and does not cause cell death.
  • Durante lysogeny, new phage particles are not produced.
  • A unique feature of phage P1 is that during lysogeny its genome is not incorporated into the bacterial chromosome, as is commonly observed during lysogeny of other bacteriophage.
  • This virus is temperate and may reside within the genome of its host through lysogeny.

History of Microbiology: Hooke, van Leeuwenhoek, and Cohn

  • Lazzaro Spallanzani (1729–1799) found that boiling broth would sterilise it and kill any microorganisms in it.
  • He also found that new microorganisms could settle only in a broth Si el broth was exposed to the air.
  • By boiling the broth beforehand, Pasteur ensured that no microorganisms survived within the broths at the beginning of his experiment.
  • Nothing grew in the broths in the course of Pasteur's experiment.
  • This meant that the living organisms that grew in such broths came from outside, as spores on dust, rather than spontaneously generated within the broth.

Pasteur and Spontaneous Generation

  • In summary, Pasteur boiled a meat broth in a flask that had a long neck that curved downward, like a goose.
  • The idea was that the bend in the neck prevented falling particles from reaching the broth, while still allowing the free flow of air.
  • When the flask was turned so that particles could fall down the bends, the broth quickly became clouded .
  • In detail, Pasteur exposed boiled broths to air in vessels that contained a filter to prevent all particles from passing through to the growth medium, and even in vessels with no filter at all, with air being admitted via a long tortuous tube that would not allow dust particles to pass.
  • Nothing grew in the broths unless the flasks were broken open, showing that the living organisms that grew in such broths came from outside, as spores on dust, rather than spontaneously generated within the broth.

The Lytic and Lysogenic Cycles of Bacteriophages

  • Those phages able to undergo lysogeny are known as temperate phages.
  • Even though there are similarities between lysogeny and latency, the term lysogenic cycle is usually reserved to describe bacteriophages.

Pure Culture

  • Another method of bacterial culture is liquid culture, in which the desired bacteria are suspended in liquid broth, a nutrient medium.
  • The experimenter would inoculate liquid broth with bacteria and let it grow overnight (they may use a shaker for uniform growth).

Tissue Culture of Animal Viruses

  • Viruses cannot be grown in standard microbiological broths or on agar plates, instead they have be to cultured inside suitable host cells.

Complex and Synthetic Media

  • Luria Broth as shown here is made with yeast extract, as yeast extract is not completely chemically defined Luria Broth is therefore an undefined media.By Lilly_M [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) or CC-BY-SA-3.0-2.5-2.0-1.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons

Minimal Inhibitory Concentration (MIC)

  • MICs can be determined on plates of solid growth medium (called agar, shown in the "Kirby-Bauer Disk Susceptibility Test" atom) or broth dilution methods (in liquid growth media, shown in ) after a pure culture is isolated.
  • For example, to identify the MIC via broth dilution, identical doses of bacteria are cultured in wells of liquid media containing progressively lower concentrations of the drug.
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VWR Life Science Premixed LB Broth

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Is there a difference between Luria Broth and Lysogeny Broth? - biología

Rich media used for routine culture of E. coli and other bacteria at high cell densities.

1L 5L Componente
10 g 50 gramos Tryptone
5 g 25 g Yeast Extract
10 g 50 gramos NaCl

Add dH2O to final volume. Autoclave. If mixing up large batches and aliquoting, be sure to add exact volumes to final media bottles so that they will be ready for addition of antibiotic to known concentrations.

This recipe is from Miller JH. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics. CSHL Press. Handbook Unit 25.5.

Note: Be aware that (1) there are several other formulations that may be called LB but vary the amount of NaCl. Using the wrong one can cause large changes in growth. (2) LB was originally supposed to stand for "Lysogeny Broth" and you may also see it called "Luria Broth" (more about this).

Expected results: E. coli strains grow to 5×10 9 cells/ml final density in LB.

Variant: 0.1×LB is made with 1 g Tryptone, 0.5 g Yeast Extract, and 10 g NaCl per liter. (It is 0.1× in the nutrients, but no the salt!)


Is there a difference between Luria Broth and Lysogeny Broth? - biología

When it comes to growing bacterial colonies, LB-agar steps up to the plate &ndash but first you have to get it into a gel state (a situation to which its friend agarose can surely relate!) &ldquo-ose&rdquo is an ending that&rsquos usually used to indicate something&rsquos a sugar &ndash and agarose es a sugar &ndash but so is agar! So what&rsquos the difference? They&rsquore related, but they differ by more than just a few letters and those differences make them useful for making gel matrices for different tasks &ndash agarose gels for separating DNA fragments by size and agar gel plates for growing bacteria)

A gar is a fish-like thing and AGAR (aka agar-agar (seriously!)) is a mezcla of 2 sugars &ndash agaropectin & the one we&rsquore more familiar with, agarosa. So you get agarose by purifying agar. And to understand why you&rsquod go through that trouble sometimes, but not other times, it helps to know a bit more about what these sugars are.

Agarose es un polisacárido (&ldquopoly&rdquo means many & saccharide&rsquos sugar, so a polysaccharide is a long chain of repeating sugar subunits joined together). It&rsquos an example of a polymer. Polymersare long chains of repeating subunits. Different polymers have subunits of different types (e.g. nucleotide subunits link up to give you the polymers we call DNA or RNA amino acids join to form proteins and monosaccharide sugars chain-ify to give make complex carbs (like agarose!))

Sugars have lots of hydroxyl (-OH) groups (which water happily sticks to, helping you form a gel &ndash an &ldquoinfinitely&rdquo interconnected (like 7° of Kevin bacon) polymer mesh containing water. (more to come)). Individual sugar units (monosaccharides) often adopt ring structures (as is the case in agarose) in which the -OH groups stick out like legs. Sugars can have the same &ldquolinkage&rdquo but have the linked groups sticking out in different ways & we use &ldquoL&rdquo and &ldquoD&rdquo to refer to which direction in space the legs point. More on such stereochemistry here: bit.ly/2Q8Dnax

Monosaccharides can use their -OH&rsquos to link together. Linking 2 gives you a disaccharide . Add a few more and you get oligosaccharides (oligo means few). Link lots and you get a polysaccharide (poly meaning many).

And speaking of many, the multiple -OHs mean there are multiple potential linkage sites (which we specify by which number &ldquoaddresses&rdquo on the sugar rings are joined). You can get &ldquobranching,&rdquo but in agarose, you have linear chains (of about 400 subunits). (Although branches can be introduced using &ldquocrosslinkers&rdquo to strengthen agarose so that it can do things like make size exclusion chromatography (&ldquogel filtration&rdquo) resin which can withstand the high pressures generated in FPLC (Fast performance liquid chromatography).

In agarose, the repeating subunit is a sugar duo (disaccharide) of galactose (D-galactose to be precise) linked to a modified galactose monosaccharide, 3,6-anhydro-L-galactose. We call this duo AGAROBIOSE (Linking a galactose to a glucose gives you lactose, a disaccharide you might be more familiar with).

In galactose, the rings have 6 sides with 4 -OH legs, 5 -H legs, & 1 methylhydroxyl (-CH₂OH) leg. We often don&rsquot draw the &ldquo-H&rdquo legs because they hide the more interesting legs that are capable of reacting. In agarose&rsquos modified galactose, 2 of the -OH groups have linked up & kicked out a hydrogen (&ldquoanhydro&rdquo) so that the methyl hydroxyl arm is bridged to an -OH arm forming a &ldquobridge&rdquo over the ring.

About 2/3 of agar is agarose but, agar also contains AGAROPECTIN. It&rsquos really similar (it has alternating D & L galactoses) BUT many of those galactoses have modifications. There are several different modifications including adding sulfate(s), pyruvic acid, or methyl groups, or sneaking in one of those linked-leg versions like&rsquos in agarose.

Unlike the consistent repeating nature of AGAROSE, it&rsquos only the alternating D- & L- galactose &ldquoskeleton&rdquo that&rsquos consistent in agaropectin. Its modifications are scattered throughout the chain (for instance,

every 10th is attached to a sulfate through an -O-sulfate linkage, but that&rsquos just on average, and it&rsquos not likely they&rsquore precisely, evenly, distributed). And, while the chains tend to be shorter than the agarose chains, their length is also variable, so, agaropectin&rsquos really quite a mix & you never know quite what you&rsquore gonna get!

Why use one over the other?

DNA has a lot of negatively-charged phosphate groups (phosphorus surrounded by 4 oxygens). This will serve the basis for them moving through the gel towards the positive end. So we need the gel to be neutral.

Agar has a lot of sulphate groups (sulfur surrounded by oxygens). These are also negatively-charged, so they can interfere with how the DNA moves through the gel. So it would make a bad matrix for electrophoresis.

BUT agarose is neutral, making a good matrix for electrophoresis.

BUT agarose is also more expensive because it has to be purified. So if you don&rsquot need to worry about the physical charge issue, might as well use something that has a lower *monetary* charge! Because agar requires less processing, its cheaper & perfect for use as a matrix to hold bacteria food!.

In agar plates, it&rsquos not the agar itself that&rsquos providing nutrients. That&rsquos one of the great things about agar &ndash *most* bacteria can&rsquot eat it. Instead, the agar just provides &ldquoscaffolding&rdquo to house the nutrients the bacteria need. And often those nutrients are provided through a liquid bacterial food &ldquogrowth media&rdquo called LB, which, no matter what your textbooks might say, (originally at least) stands for Lysogeny Broth. Sometimes initials for Luria, Lennox, or Luria & Bertani get credit for the name, but it really stands for LYSOGENY BROTH and its recipe was first published (by Giuseppe Bertani) in 1951. He was using it when studying lysogeny (a process where a bacteria-infecting virus called a bacteriophage (&ldquophage&rdquo) inserts its own DNA into a bacteria&rsquos DNA & bides its time until conditions are right for entering the lytic phage where it cuts itself out, makes lots of copies and bursts open the cell) http://bit.ly/2HLuB1S

The point of LB is basically to give the bacteria what they need to grow, divide, and do what we want (like make copies of DNA we put in them and/or make copies of proteins using instructions from DNA we put in them). And to do it cheaply.

Note: For the protein-making and large-scale DNA-making, we grow bacteria in straight-up LB liquid &ndash &ldquoin suspension&rdquo with shaking &ndash but when we need to isolate specific groups of bacteria that are all derived from the same &ldquoparent cell&rdquo and thus genetically-identical, we embed that LB into a gel so that different genetically-distinct &ldquocolonies&rdquo don&rsquot intermingle, but instead grow as gloopy dots. If you want to learn more about various media for the suspension stuff check out this post http://bit.ly/bacterialmedia but today I&rsquom going to focus on the gel-trapped form.

We don&rsquot give the bacteria 5-star cuisine. Instead, we want to spend as little money as possible while still giving them the nutrients they need. At a minimum, we need to give them a source of energy, something they can break down (catabolize) to make ATP &ndash such things can be sugars, proteins, fats. In addition to breaking things down, they need to be able to make things like proteins and DNA (do the anabolic part of metabolism). This requires nutrients that provide the elements needed like carbon and nitrogen, which thankfully you can get with a simple recipe that&rsquos sufficient for lots of bacteria.

There are 3 main components (though 2 of those components themselves have a lot of components.

  • TRYPTONE -> this is a mix of peptides formed by the digesting a protein called casein with pancreatic enzyme -> this provides amino acids the bacteria can use to make new proteins
  • YEAST EXTRACT -> this &ldquoautolysate&rdquo of yeast is basically just whatever happened to be in yeast (organic compounds including vitamins, trace elements, etc.) &ndash and if it was good enough for the yeast&hellip
  • SODIUM CHLORIDE (NaCl)(table salt) -> allows for osmotic balance, transport, etc.

A few of the major LB formulations are the &ldquoMiller,&rdquo &ldquoLennox,&rdquo & &ldquoLuria&rdquo versions & they differ in the amount of salt they have. Miller & Bertani drown the bacteria in NaCl (10g/L) whereas Lennox just uses 5g/L and Luria just 0.5g/L -> such low salt recipes are good if you&rsquore using a salt-sensitive antibiotic. in the original paper, Bertani also added glucose, but most later recipes leave it out.

And speaking of leaving things out, we need to make sure we &ldquoleave out&rdquo bacteria we don&rsquot want, which we can do by &ldquoselecting for&rdquo the bacteria we hacer want using selection media, which contain things like antibiotics etc. that suppress the growth of things you don&rsquot want to grow. For example, when we put genes into bacteria, we normally do it in the form of circular pieces of DNA called plasmids. We design those plasmids to also have an antibiotic resistance gene, so we can spike the food with that antibiotic and it can still grow, but other stuff can&rsquot http://bit.ly/2tcW4ky

There&rsquos also differential media &ndash this allows for &ldquoscreening&rdquo as opposed to &ldquoselection&rdquo &ndash you don&rsquot keep things from growing, but you change how they appear &ndash for example, we use X-gal for blue-white screening http://bit.ly/2MxNPs2

After I put a plasmid with my gene into bacteria and get colonies, I pick a few of those colonies and put them in liquid LB (with antibiotic) to grow overnight to make lots of copies of the plasmid, then I can purify out those copies and send them for sequencing to check for typos before l enter the &ldquoexpression prep&rdquo part.

Regardless of what media you use, you need it to be sterile. So you autoclave it (stick it in a really hot, high pressure dishwasher) -> make sure the bottles aren&rsquot sealed tight or they&rsquoll explode (thankfully I haven&rsquot made this mistake) &ndash and don&rsquot re-tighten the lids until the bottles have cooled of or the lids will get stuck (I *have* made this one). Another mistake not to make -> don&rsquot add antibiotics before autoclaving, or you&rsquoll inactivate them. We usually don&rsquot add it until right before we&rsquore ready to use it.

In undergrad, I made all my own media, but here, we use so much of it, we have a &ldquomedia-maker&rdquo lab technician who&rsquos amazing and makes & sterilizes our bacterial growth media. You know something&rsquos been through an autoclave if the lines on its autoclave tape are black &ndash the tape is temperature-sensitive so it color-changes when it gets really hot. I really want to design a line of joke and/or trivia messaged autoclave tape &ndash so if the whole teaching thing doesn&rsquot work out, I guess I have a back up!


Ver el vídeo: Medios de cultivo. Microbiología (Diciembre 2022).