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¿Por qué se suele añadir ácido propanoico a la dieta de C. elegans?

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¿Y cuáles son sus efectos sobre C. elegans?

El papel es Burnett C, Valentini S, Cabreiro F, Goss M, Somogyvári M, Piper MD, Hoddinott M, Sutphin GL, Leko V, McElwee JJ, et al.. 2011. Ausencia de efectos de la sobreexpresión de Sir2 sobre la esperanza de vida en C. elegans y Drosophila. Nature 477: 482-5.


El ácido propanoico es tóxico contra muchos tipos de moho, hongos y bacterias (wiki), pero al mismo tiempo casi no tiene ningún efecto sobre C. elegans ("cinco veces menos", referencia). Es por eso que los ácidos propanoicos y (más común) sus sales se utilizan como conservantes para cultivos de C.elegans (así como para otros animales, como Drosophila).


La alteración genética apunta a la longevidad, la delgadez

Imagínese que al alterar la función de un solo gen, podría vivir más tiempo, ser más delgado y tener niveles más bajos de colesterol y grasas en la sangre.

Los investigadores del Medical College of Georgia están utilizando un gusano diminuto llamado C. elegans para transformar esa visión en realidad.

Los investigadores You-Jun Fei y Vadivel Ganapathy han descubierto que el gen Indy es fundamental para proporcionar energía a las células, produciendo un transportador que ayuda a entregar los ingredientes clave del combustible que impulsa las células. Indy entrega sustratos metabólicos como citrato y succinato a las células donde ingresan a la central eléctrica llamada mitocondrias. Dentro de la central eléctrica, el oxígeno también es fundamental para la reacción bioquímica que se produce para producir ATP, el combustible para las células, dice el Dr. Fei, biólogo molecular.

Un subproducto desafortunado de este metabolismo del oxígeno son las especies reactivas del oxígeno, una especie de basura celular que envejece las células y puede contribuir a enfermedades desde el Parkinson hasta el Alzheimer. "Es por eso que la gente piensa que envejecemos, estos subproductos del metabolismo del oxígeno hacen que las células se degeneren", dice el Dr. Ganapathy, bioquímico que se convierte en presidente del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de MCG el 1 de julio.

Esa también es la razón por la que la disminución de la actividad del transportador de Indy parece hacer que los modelos animales al menos vivan vidas más largas y saludables.

Los investigadores de MCG han identificado este gen de la longevidad en humanos, ratones, ratas y pez cebra, así como en C. elegans.

Armados con una nueva subvención de $ 605,000 para tres años del Instituto sobre el Envejecimiento de los Institutos Nacionales de Salud, los investigadores quieren conocer el nivel de actividad que optimiza la longevidad y encontrar compuestos para controlar ese nivel.

"La esperanza de vida humana es un fenotipo determinado por múltiples genes", dice el Dr. Fei, investigador principal de la subvención. "Nuestro gen Indy es sólo uno de los genes determinantes de la vida. Pero puedo decir que cuando la función de este único gen se anula, el animal puede extender su vida útil".

Investigadores de la Universidad de Connecticut fueron los primeros en reconocer la relación entre Indy & ndash, abreviatura de 'I'm not dead yet' & ndash y la longevidad cuando encontraron mutaciones espontáneas del gen en la mosca de la fruta adulta que casi duplicaron su vida útil. Su investigación, publicada en la revista Science en diciembre de 2000, dice que las mutaciones pueden crear un estado metabólico que imita la restricción calórica, que se ha demostrado que prolonga la vida útil. No estaban seguros de la función del gen, pero sospechaban que era un transportador.

"Cuando miras la proteína codificada por este gen, puedes adivinar qué hace el gen porque los transportadores tienen ciertas características estructurales y la proteína producida por este gen tiene el mismo tipo de características estructurales del sistema de transporte", dice el Dr. Ganapathy. La estructura se parecía mucho a dos transportadores de dicarboxilato, los Dres. Fei y Ganapathy habían estado estudiando durante años. Así que clonaron el gen Indy de la mosca de la fruta, pero descubrieron que no coincidía con ninguno de los transportadores. "Sabíamos que tenía que haber algo más", dice el Dr. Ganapathy.

Ese algo más resultó ser un tercer transportador de dicarboxilatos y tricarboxilatos, que incluyen citrato, succinato y otros componentes del ciclo del ácido cítrico, la vía principal para la producción de energía en las células. "Ahora hay tres transportadores con una función similar. ¿Cómo demostramos que el tercero es realmente Indy? Necesitamos un modelo animal que nos permita estudiar el efecto sobre la esperanza de vida", dice.

Para que los investigadores no envejecieran demasiado tratando de aclarar que se trataba de Indy, eligieron C-elegans como modelo animal, un gusano que pasa de embrión a adulto en unos tres días y tiene una vida útil máxima de unas cuatro semanas.

El Dr. Fei clonó los tres transportadores de ácido en C. elegans, eliminó la actividad de cada uno y descubrió que el transportador más nuevo, Indy, aumentaba la vida útil del gusano y disminuía el tamaño corporal y el contenido de grasa sin aparentes efectos nocivos. Publicaron su trabajo de clonación inicial en el Journal of Biochemistry en 2003 y el trabajo sobre la función biológica de Indy en el Biochemical Journal este año.

Pudieron imitar la mutación genética espontánea que los investigadores de Connecticut encontraron en la mosca de la fruta al alimentar a C. elegans con bacterias especialmente diseñadas que eliminan la actividad de Indy. Su modelo generó un aumento del 15-20 por ciento en la vida útil además de los otros beneficios. A diferencia de los verdaderos knockouts genéticos, con los científicos eliminando por completo ambas copias de un gen para que el 100 por ciento de la función desaparezca o eliminando una copia para que el gen funcione a la mitad de su capacidad, los científicos de MCG no pueden determinar el nivel exacto de actividad genética en su modelo animal. "Estos gusanos reflejan lo que sucede con la actividad reducida en el transportador", dice el Dr. Ganapathy. "Pero todavía no tenemos una línea mutante estable. Ese es uno de los objetivos de la subvención de los NIH".

Curiosamente, el beneficio máximo, al menos en la mosca de la fruta, no proviene de la actividad cero. Más bien, las moscas viven más tiempo con aproximadamente la mitad de la actividad genética normal. El Dr. Fei quiere encontrar el grado óptimo de actividad. Él y su co-investigador, el Dr. Ganapathy, ya están trabajando en un ratón knockout que tiene la mitad de la actividad normal de Indy para poder observar el impacto en la longevidad en ratones que normalmente viven dos años en lugar de unas pocas semanas.

Para confirmar que el gen funciona de manera similar en gusanos y humanos, también planean sacar el gen Indy de C. elegans y reemplazarlo con el gen humano para ver si eso revierte el efecto. "Lo llamamos humanizar al gusano", dice el Dr. Ganapathy.

Señaló que una diferencia interesante entre los genes de los gusanos y los humanos es que el gen Indy humano es más hábil para transportar tricarboxilatos o citratos, un precursor principal de la grasa y el colesterol. "Si encuentra un medicamento que pueda bloquear la función de este transportador, podría interferir con el uso del citrato para la síntesis de grasa y colesterol, lo que debería ayudar a las personas a perder peso y reducir el colesterol", dice el Dr. Ganapathy.

Drs. Fei y Ganapathy también están trabajando para identificar compuestos que puedan controlar la actividad genética. Es posible que no tengan que buscar más allá de los estantes de las tiendas para encontrar un buen punto de partida: el hidroxicitrato, un análogo del citrato que se encuentra en la piel de la fruta india garcinia, ya está siendo promocionado por sus propiedades para bajar de peso y reducir el colesterol. "Creemos que el mecanismo de funcionamiento de este compuesto es, al menos en parte, mediante la manipulación de este sistema de transporte", dice el Dr. Ganapathy, y agrega que los estudios del hidroxicitrato podrían apuntar hacia compuestos más específicos y potentes.

El beneficio potencial derivado de manipular la actividad de Indy ha llevado a la Oficina de Transferencia de Tecnología y Desarrollo Económico de MCG a buscar patentes nacionales e internacionales sobre la tecnología del transportador.

Fuente de la historia:

Materiales proporcionados por Colegio Médico de Georgia. Nota: El contenido puede editarse por estilo y longitud.


¿Por qué se suele añadir ácido propanoico a la dieta de C. elegans? - biología

Edición de octubre de 2019

Salud cognitiva: dietas con alto contenido de plasmaógeno y Alzheimer y rsquos
Por Carissa Perez Olsen, PhD
Dietista Today & rsquos
Vol. 21, núm. 10, pág. 12

Los suplementos se utilizan comúnmente para proporcionar nutrientes o vitaminas que no se proporcionan en la dieta en cantidades suficientes, como los ácidos grasos omega que se encuentran en el aceite de pescado. Aunque los plasmalógenos aún no se encuentran entre los suplementos comúnmente conocidos, el aumento de los niveles de plasmalógenos puede ser importante para prevenir la enfermedad de Alzheimer y rsquos (EA).

Los plasmalógenos son un tipo especializado de fosfolípidos: las moléculas que forman nuestras membranas celulares. Hasta que los plasmalógenos estén disponibles en forma de píldora, los alimentos con alto contenido de plasmalógenos, como las vieiras, pueden ayudar a las personas con casos leves de enfermedad de Alzheimer y rsquos a mejorar su función cognitiva.

Aunque es necesario realizar más investigaciones para determinar la mejor manera de aumentar los niveles de plasmalógeno, cada vez hay más evidencia sobre por qué y cómo esto puede funcionar. Mientras tanto, agregar más vieiras, mejillones y otros tipos de mariscos a la dieta de los pacientes con EA es una intervención de bajo riesgo y relativamente simple con importantes beneficios potenciales.

Plasmalógenos y su conexión con la EA
El advenimiento de las mediciones basadas en espectrometría de masas ha permitido la comparación de las moléculas que se alteran durante la EA. Uno de los cambios que ha surgido de estos estudios es un agotamiento constante de plasmalógenos. Existe una tremenda diversidad en los tipos de fosfolípidos que se encuentran en las membranas, y los plasmalógenos son parte de ese paisaje diverso. Los plasmalógenos constituyen más del 20% de los fosfolípidos en humanos y son particularmente abundantes en el sistema nervioso1. En los pacientes con EA, los niveles de plasmalógenos disminuyen hasta en un 40% .2,3

La identificación de esta reducción significativa de plasmalógenos es importante en dos aspectos de la EA: la detección temprana de la enfermedad y la intervención terapéutica.

En primer lugar, estas pérdidas de plasmalógenos pueden ser biomarcadores útiles que señalan la aparición de la EA. La ventaja de identificar los niveles de plasmalógenos, a diferencia de otros métodos de detección, es que se pueden ver plasmalógenos reducidos en la sangre y no requieren alternativas costosas y a veces invasivas4. en niveles se correlaciona con la gravedad de la enfermedad.2 Esto presenta una oportunidad para desarrollar estos lípidos como biomarcadores para la EA y otras demencias.5

En segundo lugar, restaurar los niveles de plasmalógeno puede ser una forma importante de mejorar la función cognitiva en pacientes con EA y potencialmente retrasar o prevenir la aparición de la enfermedad. El papel de los plasmalógenos en biología no se comprende completamente, pero está claro que los plasmalógenos son importantes para la capacidad de las células de sobrevivir en condiciones estresantes, particularmente cuando hay altos niveles de moléculas químicamente reactivas que pueden dañar los componentes celulares. No se sabe cómo los plasmalógenos protegen a las células en estas condiciones, pero está claro que cuando no hay plasmalógenos, las células mueren con más frecuencia.1,6 El papel de los plasmalógenos en la protección de las células del daño predice que la reposición de los plasmalógenos en los pacientes sería beneficiosa.

En resumen, una disminución de los plasmalógenos puede ser una forma eficaz de identificar la EA antes de que los síntomas se noten en los pacientes. Podemos medir el agotamiento de plasmalógeno e intervenir mucho antes de lo que sería posible de otra manera. Una de las formas de intervenir y prevenir la progresión de la enfermedad es reemplazar los plasmalógenos que se pierden en estos pacientes.

Los suplementos dietéticos mejoran la función cognitiva
A diferencia de otras macromoléculas como las proteínas y el ADN, la composición de los lípidos se puede alterar mediante cambios en la dieta, lo que presenta una oportunidad única de intervención. Los estudios en ratones y otros modelos demostraron un beneficio terapéutico al proporcionar plasmalógenos a la dieta para mitigar la pérdida de memoria.7 Debido a la facilidad y seguridad del uso de suplementos dietéticos, un estudio clínico recientemente agregó plasmalógenos a las dietas de pacientes con EA temprana y mostró mejoría cognitiva en casos leves8.

Ese estudio clínico evaluó a 328 pacientes de 60 a 85 años con EA leve y deterioro cognitivo leve, estos pacientes obtuvieron de 20 a 27 puntos en el Mini Examen del Estado Mental en Japón, donde se llevó a cabo el estudio. Recibieron 1 mg / día de plasmalógenos purificados de vieiras o un placebo. En los pacientes con EA leve, las medidas de memoria (prueba WMS-R) mejoraron significativamente en el grupo de tratamiento entre las mujeres y los menores de 77 años. No hubo una mejora estadísticamente significativa en los pacientes más avanzados, lo que sugiere que la intervención temprana es fundamental.

Debido a que se han observado efectos beneficiosos de la suplementación con plasmalógenos en la EA, se han realizado esfuerzos para identificar las fuentes de plasmalógenos en los alimentos. En el estudio de 2016, el nivel más alto de plasmalógenos se encontró en ascidias (también llamadas ascidias), mejillones y vieiras.9 También existen niveles significativos de plasmalógenos en la carne de cerdo y de res. Los plasmalógenos son un grupo de lípidos que pueden variar en los ácidos grasos y los grupos de cabeza que son componentes de los lípidos. Los estudios aún no han determinado si determinados tipos de plasmalógenos tendrían un beneficio mayor que otros.

La función de los plasmalógenos
Los plasmalógenos se identificaron accidentalmente hace más de cien años. Estos lípidos tienen un enlace que es sensible al ácido, y en los primeros protocolos para teñir células para obtener imágenes, la adición de ácido reaccionaba con estos lípidos, produciendo artefactos que parecían plasma.10 A pesar de su identificación temprana, se sabe relativamente poco sobre su función biológica. . Es probable que su función sea multifacética, ya que las personas que carecen de la capacidad para producir plasmalógenos tienen un trastorno de biogénesis peroxisomal y rara vez sobreviven más allá de la edad de 1. Estos pacientes tienen una serie de síntomas, que incluyen deterioro cognitivo, retrasos en el desarrollo y una esperanza de vida muy reducida. 1

Junto con los estudios de estos pacientes, los experimentos con animales y sistemas modelo han sugerido una serie de funciones potenciales de los plasmalógenos. Una de las características destacadas de la deficiencia de plasmalógeno es la intolerancia al estrés. Esto sugiere que los plasmalógenos pueden desempeñar un papel como antioxidantes de sacrificio, por lo que se dañan de una manera que mitiga el daño general a la célula.1 Un modelo alternativo es que los plasmalógenos pueden funcionar en las vías de señalización para activar la respuesta adecuada al daño elevado en el interior. las celdas. Estudios de Caenorhabditis elegans, un sistema de nematodos desarrollado recientemente como modelo para la deficiencia de plasmalógenos, están en marcha para determinar el papel de estos plasmalógenos en la respuesta al estrés, así como en otros aspectos de la biología11,12.

Sin plasmalógenos, es más probable que todas las células mueran. No está claro por qué es así, pero se sabe que las células pueden sobrevivir mejor al estrés con la cantidad adecuada de plasmalógenos.

Cambios de membrana en el envejecimiento natural
Los cambios de membrana no son específicos de la EA y se han observado en otras enfermedades neurodegenerativas, así como en diversas enfermedades relacionadas con el envejecimiento.13 Los cambios de membrana también ocurren durante el curso del envejecimiento natural, donde los tipos de lípidos que se encuentran en nuestras membranas cambian a medida que envejecemos. En comparación con las personas jóvenes y sanas, las membranas de las personas mayores tienen significativamente más ácidos grasos saturados y más ácidos grasos dañados.14

Se han realizado varias observaciones interesantes sobre las conexiones entre la composición de la membrana y el envejecimiento. Por ejemplo, las membranas de los nonagenarios tienden a tener membranas que contienen significativamente menos ácidos grasos poliinsaturados.15 Los estudios en animales también han encontrado correlaciones entre la longevidad y la composición saludable de la membrana.16 Sin embargo, aún no se ha establecido si los impactos en la composición de la membrana pueden mejorar el envejecimiento, y en particular, conducir a un envejecimiento saludable.

Estudios futuros
Los estudios clínicos completados hasta ahora se han limitado al uso de suplementos de plasmalógeno general purificados de vieiras.8 Existe un potencial significativo para mejorar el protocolo de suplementación probando combinaciones de plasmalógeno más específicas. Debido a que los estudios clínicos son costosos y requieren una cantidad significativa de tiempo, los sistemas modelo pueden ser útiles para determinar la suplementación con el mayor potencial antes de pasar a los ensayos clínicos.

Además de definir los protocolos más eficaces, también se están utilizando sistemas modelo para determinar las vías genéticas que dan como resultado deficiencias de plasmalógenos. Saber más sobre la base genética generaría dianas potenciales que, a su vez, identificaría dianas farmacológicas que pueden permitir una mejora aún mayor y rápida de los niveles de plasmalógeno en pacientes en los que se ha observado una reducción de plasmalógeno.

Finalmente, se necesita más comprensión sobre el papel de los plasmalógenos en biología para saber cómo su agotamiento puede causar la aparición y progresión de la EA y otras enfermedades neurodegenerativas. Los estudios en sistemas modelo ayudarán a aclarar el papel de los plasmalógenos en la aparición y progresión de la EA. Además del cultivo de células humanas, un nematodo, C elegans, se ha establecido recientemente como un modelo para la deficiencia de plasmalógeno.11,12 Este modelo tiene varios beneficios. Los nematodos permiten estudios de cómo funcionan los plasmalógenos y proporcionan una plataforma para la detección rápida de protocolos de suplementación para determinar las opciones dietéticas más efectivas.

Una de las ventajas de estudiar membranas en C elegans es la capacidad de incorporar grandes cantidades de trazadores a la dieta del animal. Estos trazadores pueden luego detectarse en las membranas del animal mediante espectrometría de masas. La capacidad de incorporar trazadores en las membranas de C elegans nos permite medir la dinámica de los lípidos de membrana.17 Con este sistema, estamos proporcionando combinaciones individuales y diferentes de plasmalógenos para C elegans determinar qué régimen de suplementación tendrá el mejor resultado en la salud de las membranas.

Perspectiva del futuro
Existe un gran potencial para realizar cambios en la dieta que ayuden a las personas con EA leve a mejorar sus funciones cognitivas. Aumentar la ingesta de mejillones, vieiras y otros tipos de mariscos de un paciente con EA es una forma relativamente sencilla de comenzar hasta que la investigación aclare las intervenciones dietéticas más específicas que funcionarán para la mayoría de las personas.

- Carissa Olsen, PhD, profesora asistente Leonard P. Kinnicutt de Química y Bioquímica en el Instituto Politécnico de Worcester, está utilizando una subvención de los Institutos Nacionales de Salud para comprender mejor el papel que juegan los lípidos en la longevidad y la salud a largo plazo.


Referencias

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3. Marin R, Fabelo N, Martin V, et al.Las anomalías que ocurren en los perfiles de lípidos y la distribución de proteínas en las balsas lipídicas de la corteza frontal en la demencia con cuerpos de Lewy revelan rasgos neuroquímicos parcialmente compartidos por las enfermedades de Alzheimer y rsquos y Parkinson y rsquos. Envejecimiento de Neurobiol. 201749:52-59.

4. Jack CR Jr, Holtzman DM. Modelado de biomarcadores de la enfermedad de Alzheimer y rsquos. Neurona. 201380(6):1347-1358.

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12. Shi X, Tarazona P, Brock TJ, Browse J, Feussner I, Watts JL. Un modelo de Caenorhabditis elegans para la biosíntesis y función de éter-lípidos. J Lipid Res. 201657(2):265-275.

13. Fabelo N, Martin V, Santpere G, et al. Alteraciones severas en la composición de lípidos de las balsas lipídicas de la corteza frontal de la enfermedad de Parkinson y rsquos y la enfermedad de Parkinson y rsquos incidental. Mol Med. 201117(9-10):1107-1118.

14. Maeba R, Maeda T, Kinoshita M, et al. Los plasmalógenos en el suero humano se correlacionan positivamente con las lipoproteínas de alta densidad y disminuyen con el envejecimiento. J Atheroscler Thromb. 200714(1):12-18.

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16. Shmookler Reis RJ, Xu L, Lee H, et al. La modulación de la biosíntesis de lípidos contribuye a la resistencia al estrés y la longevidad de los mutantes de C. elegans. Envejecimiento (Albany NY). 20113(2):125-147.

17. Dancy BC, Chen SW, Drechsler R, Gafken PR, Olsen CP. Las estrategias de etiquetado de 13C y 15N combinadas con espectrometría de masas cuantifican de manera integral la dinámica de los fosfolípidos en C. elegans. Más uno. 201510 (11): e0141850.


2. La vía del mevalonato en C. elegans

2.1. Tronco principal

El tronco principal de la vía del mevalonato (ver Figura 1) consiste en los pasos a través de los cuales el acetil-CoA se transforma gradualmente en la molécula de 5 carbonos isopentenil-PP (IPP), luego en la molécula de 15 carbonos farnesil-PP (FPP). ). Las enzimas implicadas en estos pasos se han revisado exhaustivamente, véase, por ejemplo, la reciente encuesta de Miziorko [7].

Descripción general de la vía del mevalonato. Los círculos representan las enzimas enumeradas en la Tabla 1. Rojo: ARNi causa letalidad embrionaria Naranja: ARNi causa fenotipos graves Verde: ARNi causa fenotipos leves y Negro: ARNi no causa fenotipo. Los productos biosintéticos escritos en verde también son suministrados exógenamente por E. coli dieta.

De la Tabla 1 se desprende claramente que la vía del mevalonato en C. elegans es esencial en el laboratorio: la eliminación del ARNi de cualquiera de las ocho enzimas que pertenecen al tronco principal de la vía causa letalidad embrionaria (1-8 en la Tabla 1). Esta es una información valiosa ya que indica que la dieta de laboratorio de E. coli la cepa OP50 no proporciona cantidades suficientes de ninguno de los metabolitos que van desde acetoacetil-CoA hasta FPP. De manera constante, la inhibición de la vía del mevalonato en el paso limitante de la velocidad de la HMG-CoA reductasa (HMGR) usando estatinas también causa letalidad embrionaria, que puede rescatarse proporcionando mevalonato de forma exógena (de hecho, esencialmente, todos los efectos de las estatinas en C. elegans son prevenidas por el mevalonato, lo que demuestra la ausencia de efectos fuera del objetivo) [6].

Desafortunadamente, además de los enfoques de ARNi de genoma completo, la mayoría de las enzimas del tronco principal no se han estudiado genéticamente: la isopentil difosfato isomerasa es la única enzima del tronco principal para la cual existe un mutante, llamado idi-1. Este mutante es probablemente un hipomorfo ya que su fenotipo es más leve que la letalidad embrionaria observada en animales tratados con RNAi, y consiste en parálisis larvaria y letalidad, y defecto en la absorción de cadáveres apoptóticos [8].

Si bien las enzimas en el tronco principal de la vía son esenciales, la evidencia experimental revisada a continuación hasta ahora sugiere que ninguna de las subramas es en sí misma estrictamente esencial para la viabilidad en el laboratorio; es probable que las funciones esenciales dentro de estas vías sean robustas debido a a la redundancia genética. Por ejemplo, la isoprenilación de proteínas se puede lograr mediante tres tipos de complejos de prenil transferasa que pueden exhibir cierta promiscuidad en sus especificidades de sustrato. Ahora dirigimos nuestra atención a cada una de las cinco vías biosintéticas que se ramifican desde el tronco principal de la vía del mevalonato.

2.2. Isopentil adenosina

El fosfato de isopentenilo, cuya síntesis es catalizada por la difosfomevalonato descarboxilasa, se puede añadir a la adenosina, produciendo isopentenil adenosina. Cuando están presentes en el ARNt, los derivados de isopentenilo (i6A) se encuentran en la posición 37 de los ARNt que leen codones que comienzan con U [9]. Los nucleótidos modificados en los ARNt desempeñan un papel importante en la estabilización de las interacciones codón-anticodón durante la traducción, lo cual es necesario para evitar cambios en el marco de lectura de la traducción. Por ejemplo, el nucleósido hipermodificado 2-metiltio-N6 isopentenil adenosina en la posición 37 (ms2i6A37) en tRNA Phe GAA estabiliza las interacciones mRNA-tRNA en los tres sitios de unión del tRNA [9, 10]. En C. elegans, gro-1 es el homólogo del gen humano tRNA isopentenildifosfato transferasa (TRIT1). Las mutaciones en este gen dan como resultado tasas de desarrollo, comportamiento y reproducción desreguladas, así como un aumento de la esperanza de vida [11]. Una interpretación probable de estos fenotipos es que la fidelidad reducida de la traducción provoca la ineficacia de varios procesos, lo que resulta en una ralentización variable de los eventos celulares, lo que puede contribuir al aumento de la esperanza de vida. Esta explicación está respaldada por la observación de que las mutaciones en otras enzimas modificadoras de ARNt también causan retrasos en el desarrollo y disminución de la capacidad reproductiva, especialmente a la alta temperatura de crecimiento de 25 ° C, lo que debería debilitar aún más las interacciones codón-anticodón durante la traducción [12]. En resumen, la modificación del ARNt parece ser un proceso importante pero no estrictamente esencial, cuya función principal es mejorar la fidelidad de la traducción en los casos en que la interacción codón-anticodón implica un emparejamiento U-A.

2.3. Coenzima Q

La enzima trans-prenil transferasa convierte FPP en poliprenil-PP y es el paso limitante en la síntesis de Coenzima Q (CoQ), también conocida como ubiquinol. La CoQ consiste en un anillo de benzoquinona modificado que se puede reducir y oxidar de manera reversible, y una cola de isoprenilo hidrófoba que contiene 6-10 unidades de isoprenilo (Figura 2). La longitud de la cola de isoprenilo de CoQ es específica de la especie, siendo 10 (CoQ10) en humanos, nueve (CoQ9) en roedores y C. elegansy ocho (CoQ8) en E. coli. CoQ es una molécula activa que funciona como un portador de electrones en la cadena de transporte de electrones mitocondrial. La transferencia de electrones a través de CoQ implica la formación de radicales semiubiquinona, que provocan la generación de radicales superóxido al reaccionar con oxígeno. En la forma reducida, CoQH2 funciona como un antioxidante soluble en lípidos y protege a las células de la peroxidación de lípidos. Por tanto, la CoQ también es importante como regulador lipófilo del estrés oxidativo [1]. La inhibición de la HMG-CoA reductasa usando estatinas en humanos provoca una disminución medible de los niveles séricos de CoQ, que se correlaciona con una disminución de la función cardíaca que puede revertirse proporcionando CoQ como suplemento dietético [13, 14].

Descripción general de la vía biosintética de la coenzima Q. El paso clave en la vía es la reacción de condensación de la cadena lateral poliisoprenoide de la vía del mevalonato con el 4-hidroxibenzoato, que es el producto de una vía separada de múltiples etapas a partir de los precursores tirosina o fenilalanina. Dado que estos precursores están en exceso en comparación con los poliisoprenoides, la velocidad de síntesis de ubiquinol está determinada por la disponibilidad del poliisoprenoide: la conversión de Farnesil-PP en poliprenil-pp que es catalizada por la enzima trans-preniltransferasa es el paso limitante de la velocidad en la síntesis de ubiquinol. El ubiquinol consiste en un anillo de benzoquinona modificado unido a una cola de isoprenilo hidrófoba que contiene de 6 a 10 unidades de isoprenilo según la especie. Las líneas punteadas representan pasos enzimáticos adicionales en la ruta.

CoQ es esencial para el desarrollo y la supervivencia de C. elegans porque mutantes incapaces de sintetizar CoQ y cultivados en una fuente de alimento bacteriana que carece de detención de CoQ durante la embriogénesis o emergen de dauers como adultos estériles [15, 16]. El papel de la CoQ en la regulación del tiempo de los eventos del desarrollo se hizo evidente por primera vez cuando el gen clk-1 Se demostró que codifica el homólogo de gusano de COQ7, una enzima importante para la biosíntesis de CoQ [17]. clk-1 los mutantes cultivados en OP50, que proporciona cierta cantidad de CoQ nutricional, han desregulado el tiempo de desarrollo, lo que da como resultado, en promedio, un desarrollo más lento y una mayor longevidad. De manera similar, la eliminación del ARNi de varias enzimas involucradas en la síntesis de CoQ también causa una mayor vida útil en los gusanos [18, 19]. Desde entonces se ha hecho evidente que la inhibición de la respiración mitocondrial o la producción de ubiquinol en C. elegans provoca un aumento de la expresión de genes metabólicos y protectores de las células, así como una mayor abundancia de ADN mitocondrial, lo que resulta en una ralentización de las tasas de comportamiento y una vida útil prolongada [20]. Estos cambios en la expresión génica se han denominado "respuesta retrógrada", ya que se basan en una inversión en la dirección normal del flujo de información entre las mitocondrias y el núcleo [21]. La respuesta retrógrada puede ser una reacción compensatoria a la disminución normal de la función mitocondrial que se observa con la edad, ya que se observa típicamente en células más viejas [21].

Además de sus efectos sobre las tasas biológicas y la longevidad, la CoQ contribuye a la robustez de procesos de desarrollo específicos [22]. Por ejemplo, la hipodermis es anormal en coq-8 mutantes, con evidencia de degeneración de la matriz extracelular. La gónada también se desarrolla de manera anormal, y la viabilidad de la línea germinal y el desarrollo embrionario exhiben tasas de falla con una penetrancia que varía del 2 al 40%, lo que sugiere que la CoQ proporciona una función auxiliar en lugar de crítica. Los niveles deprimidos de CoQ podrían resultar en niveles limitados de ATP y pirimidinas con consecuencias en varios procesos [22].

2.4. Dolichols

Los alcoholes poliisoprenoides (dolicoles y poliprenoles) se encuentran en todos los organismos vivos, desde las bacterias hasta los mamíferos [23]. En células animales y de levadura, los poliisoprenoides se derivan de la vía citoplasmática del mevalonato [24, 25], y la mayoría de los poliisoprenoides en animales son dolicoles: un grupo de compuestos orgánicos de cadena larga, en su mayoría insaturados, que se componen de un número variable de unidades de isopreno que terminan en un Grupo isoprenoide α-saturado, que contiene un grupo funcional alcohol. Las enzimas clave de la síntesis de dolicol son cis-preniltransferasas (CTP), responsables de la construcción del esqueleto largo de hidrocarburos. Los CPT alargan un precursor corto, FPP, mediante la adición secuencial del número deseado de moléculas de IPP que da como resultado la formación de un tramo de unidades cis.

Se postula que los dolicoles, que pueden considerarse superlipidos extremadamente hidrofóbicos, están implicados en el tráfico intracelular de proteínas y en la defensa celular contra condiciones ambientales adversas. Los dolicoles también juegan un papel en la N-glicosilación de proteínas: el ensamblaje de oligosacáridos unidos a N en eucariotas se inicia mediante la transferencia de GlcNAc 1-P de UDP-GlcNAc a un dolicol-fosfato (Dol-P específicamente dolichil-fosfato) que forma GlcNAc -PP-Dol (Ver Figura 3) [26]. La propia Dol-P es producida por la poliprenol reductasa y, como era de esperar, existe un vínculo directo entre la vía biosintética del dolicol y los trastornos congénitos de la glicosilación [27-30]. Durante la N-glicosilación, Dol-P funciona como un ancla de membrana para la formación del oligosacárido Glc3-Man9-GlcNAc2 (donde Glc es glucosa, Man es manosa y GlcNAc es N-acetilglucosamina). Este oligosacárido se transfiere del donante de dolicol a ciertos residuos de asparagina de cadenas polipeptídicas recién formadas. Los dolicoles también participan en la transferencia de monosacáridos al portador Glc3-Man9-GlcNAc2-Dolichol que se forma. Además, los dolicoles pueden ser aducidos a proteínas como una modificación postraduccional donde actúan como cofactores para la glicosilación de proteínas en eucariotas específicamente para la biosíntesis de N- y O-glicoproteínas y anclaje de GPI [23].

Estructura del Dolichol y su función durante la N-glicosilación de proteínas. (A) Estructura de Dolichol, donde norte depende de una cis-preniltransferasa particular. El fosfato de dolicol es un compuesto isoprenoide (90-100 carbonos en total) elaborado a partir de dolicol por fosforilación. El fosfato de dolicol desempeña funciones importantes en la síntesis de glicoproteínas ligadas a N, como se ilustra en (B). El fosfato de dolicol es la estructura sobre la que se forma el oligosacárido complejo antes de transferirlo a la proteína diana. La adición del primer resto, N-acetilglucosamina de UDP-N-acetilglucosamina, puede bloquearse con el antibiótico tunicamicina. Una vez que se completa el ensamblaje del oligosacárido, la estructura de carbohidrato se transfiere de dolicol fosfato a un residuo de asparagina de una proteína diana que tiene la secuencia Asn-x-Ser / Thr, donde × es cualquier aminoácido. Como también se muestra en (B), el fosfato de dolicol también puede actuar como un portador de azúcares para el ensamblaje de síntesis de cadena de oligosacáridos, tales azúcares activados incluyen dolicol-P-manosa y dolicol-P-glucosa.

La importancia de la biosíntesis de dolicol en C. elegans no está muy claro. No hay datos disponibles para mutaciones o eliminación de ARNi de la deshidrodolicil difosfato sintasa, que convierte FPP en poliprenil-PP y es el primer paso de la rama de biosíntesis de dolicol que emerge del tronco principal de la vía del mevalonato. La eliminación del ARNi de la siguiente enzima, la poliprenol reductasa, no causa un fenotipo detectable (Tabla 1). ¿Significa eso que la glicosilación de proteínas no es importante en C. elegans? No. Unos 1465 norteSe han identificado sitios glicosilados en 829 proteínas únicas en un enfoque proteómico [31]. Muchas de estas proteínas N-glicosiladas son esenciales (por ejemplo, la tirosina proteína quinasa let-23) o darían fenotipos visibles si se inhibieran (por ejemplo, genes de guía celular como unc-5 y saxo-7), y simplemente no es realista imaginar que las N-glicosilaciones no contribuyan a funciones importantes en ninguna de estas proteínas. Además, el ARNi contra las enzimas involucradas en los pasos posteriores de N-glicosilación causan fenotipos graves. Por ejemplo, eliminación de ARNi del homólogo de gusano de la subunidad de oligosacárido transferasa STT3B (correspondiente a la C. elegans ORF T12A.2) causa embriones anormales, algunos de los cuales se convierten en adultos delgados o largos [32-34]. Es posible que los resultados de RNAi contra la poliprenol reductasa proporcionen una imagen incompleta con respecto a la importancia de la glicosilación de proteínas en C. elegans porque existen vías alternativas para la síntesis de dolicoles [27].

2.5. Proteínas isopreniladas

El FPP se puede convertir en difosfato de geranilgeranilo (GGPP) mediante la enzima trans-prenil transferasa. Muchas proteínas deben su asociación de membrana a su conjugación con restos FPP o GGPP en su extremo carboxilo, una reacción catalizada por farnesil-proteína-transferasas diméricas (FT) y geranilgeranil-proteína transferasas (GGT1 y GGT2), respectivamente [35].

Isoprenilación de muchos polipéptidos en C. elegans se ha documentado químicamente [36]. Además, la isoprenilación es esencial en C. elegans: el tratamiento con gliotoxina, un inhibidor de la prenilación [37, 38], causa letalidad en 20 horas [36]. Consultando PRENbase, una base de datos para la farnesilación de proteína CaaX, geranilgeranilación de CaaX y geranilgeranilación de Rab, para todos los datos conocidos o probables C. elegans proteínas preniladas por FT, GGT1 o GGT2 produce una lista de 49 C. elegans proteínas que se dividen en 9 grupos (consulte el archivo adicional 1, tabla S1). Como era de esperar, los tres tipos más grandes de proteínas preniladas en C. elegans son pequeñas GTPasas: similares a rab (28 proteínas), similares a ras (9 proteínas) y similares a rho / rac (6 proteínas). Se predice que las proteínas de tipo rab están en su mayoría geranilgeranilpreniladas por GGT2, mientras que las de tipo ras y de tipo rho / rac pueden estar preniladas por GGT1 o FT. Muchas de las proteínas de tipo rab son esenciales para la embriogénesis y la viabilidad, cuatro de las proteínas de tipo rho / rac son esenciales (CED-10, CDC-42, RHO-1 y RAC-2) y solo dos de las de tipo ras las proteínas son esenciales (LET-60 y RHEB-1). El hecho de que muchas pequeñas GTPasas implicadas como oncogenes en cánceres humanos sean dependientes de la farnesilación o geranilgeranilación para su actividad ha llevado a la sugerencia de que las estatinas podrían ser agentes anticancerígenos eficaces ya que la inhibición de la HMG-CoA reductasa agotaría la disponibilidad de las fracciones lipídicas [35 , 39]. En tono rimbombante, C. elegans También es un modelo relevante en este contexto, ya que el tratamiento con estatinas resultó en la pérdida de prenilación de un reportero de GFP marcado con CaaX, además de causar una detención del crecimiento como se mencionó anteriormente (6).

Ninguno de los ARN contra las subunidades alfa o beta de FT, GGT1 o GGT2 causa individualmente la letalidad (Tabla 1), mientras que el ARNi contra las pequeñas GTPasas preniladas específicas a menudo causa letalidad (Archivo adicional 1, Tabla S1). Esto significa que la prenilación de pequeñas GTPasas no es esencial para sus actividades o que las preniltransferasas pueden actuar de forma redundante sobre sustratos importantes.

Además de las pequeñas GTPasas, una pequeña cantidad de otras proteínas pueden ser preniladas por FT o GGT1 en C. elegans (Archivo adicional 1, Tabla S1), pero esto no se ha demostrado experimentalmente a excepción de la lamina nuclear. Envejecimiento C. elegans exhiben cambios característicos en la morfomlogía nuclear que dependen de la lamina nuclear prenilada, y que se evitan mediante el uso de inhibidores de prenilación gliotoxina o manumicina [40].

2.6. Colesterol

El colesterol es un componente importante de muchas membranas animales, donde tiene efectos significativos sobre las propiedades de la membrana, y también es un precursor de muchos derivados de esteroides, incluidas varias hormonas. C. elegans es un auxótrofo del colesterol y no tiene homólogo de la enzima escualeno sintasa (también conocida como farnesil-difosfato farnesiltransferasa 1 o FDFT1). Por lo tanto C. elegans no utiliza la vía del mevalonato para sintetizar el escualeno o su derivado, el colesterol. Aunque el colesterol no es sintetizado por C. elegans, es esencial para su supervivencia y se requiere para varios procesos biológicos, a saber, muda, reproducción, formación de dauer y metabolismo [41-44]. En la naturaleza, C. elegans obtiene el colesterol de su dieta en condiciones de laboratorio, los gusanos lo obtienen de las bacterias y del medio de cultivo, que se suplementa con colesterol. En condiciones de privación de colesterol, la primera generación de una madre alimentada con colesterol crece y produce progenie normalmente, mientras que la siguiente generación se detiene como larvas L2 [42, 45]. Estas larvas detenidas se recuperan y siguen un desarrollo normal cuando se les proporciona el producto final de esterol por la vía de biosíntesis, pero no si se les suministran intermedios, lo que demuestra nuevamente que C. elegans carecen de maquinaria de síntesis de colesterol [46]. Estos hallazgos también indican que se requiere esterol en cantidades menores para la supervivencia del gusano y que se proporciona a la progenie a través de los ovocitos. Las principales proteínas transportadoras de esteroles en C. elegans son vitelogeninas, homólogas de apolipoproteínas de mamíferos, estas proteínas son necesarias para transportar esteroles desde el intestino hasta los ovocitos a través de RME-2, un receptor de vitelogenina [47, 48]. los C. elegans La distribución de esteroles se ha estudiado utilizando dehidroergosterol (DHE), un análogo fluorescente del colesterol, que puede reemplazarlo funcionalmente. La DHE se acumula sólo en pequeños subconjuntos de células, a saber, células del anillo nervioso, células de la faringe, células de la glándula excretora, células intestinales, ovocitos y espermatozoides [45, 49, 50]. Se estima que los esteroles en C. elegans los extractos de lípidos son 20 veces menos abundantes que en las células de mamíferos [51]. Esta cantidad reducida puede ser suficiente para la membrana celular de estas células especializadas, y es posible que las células restantes no tengan colesterol en sus membranas. Sin embargo, tenga en cuenta que la caveolina-1, un De buena fe La proteína caveolae típicamente presente en microdominios ricos en colesterol en la membrana plasmática, se encuentra en C. elegans extractos de membrana, lo que indica que se forman balsas lipídicas en este organismo [52].

La evidencia de que los esteroles en C. elegans son necesarios como precursores de hormonas y otros compuestos biológicamente activos debido al hecho de que los gusanos privados de colesterol tienen defectos de muda y se asemejan a las larvas de dauer, una etapa de diapausa adaptada a las duras condiciones. El homólogo de la proteína gp330 / megalina / LRP-2 de vertebrados en gusanos, lrp-1, es necesaria para la muda y probablemente funciona como receptor de esteroles en las células hipodérmicas, ya que la megalina es una proteína relacionada con el receptor de LDL necesaria para la absorción de vitamina D [53].

Finalmente, trabaja en dos C. elegans genes, daf-9 y daf-12, sugiere que los esteroles también participan en la formación de dauer. daf-9 codifica un citocromo P450 de la subfamilia CYP2 que produce el ácido dafachronic que promueve la entrada de dauer inhibiendo daf-12, un receptor de hormonas nucleares [54-57]. Las mutaciones en otros dos genes también indican un papel de los esteroles en la regulación de la formación de dauer: el ncr-1 y ncr-2 (C. elegans Se prevé que los homólogos 1 y 2 de la proteína Niemann-Pick C1) estén implicados en el tráfico de esteroles intracelulares, al igual que sus homólogos humanos, que son necesarios para la homeostasis del colesterol intracelular [58]. ncr-1ncr-2 los mutantes dobles forman constitutivamente dauers.


3 Conclusiones

3.1. Relaciones entre los cambios relacionados con la edad

Un logro importante de los estudios de los cambios relacionados con la edad en C. elegans es la definición de relaciones entre diferentes cambios. Se han documentado cambios relacionados con la edad en la morfología y función de los tejidos en muchos animales, pero pocos estudios han abordado las relaciones entre estos cambios. Las ventajas experimentales del C. elegans El sistema ha permitido abordar estos problemas mediante rigurosos estudios longitudinales. La Tabla 2 resume las relaciones definidas experimentalmente. Existe una fuerte correlación positiva entre la disminución del bombeo faríngeo, el movimiento corporal y la probabilidad de supervivencia. Además, existe una correlación positiva entre la disminución del movimiento corporal y la aparición de músculos de la pared corporal desorganizados y la acumulación de lipofuscina. Estos resultados sugieren que estos cambios relacionados con la edad pueden estar conectados causalmente. Por ejemplo, la desorganización de los músculos de la pared corporal relacionada con la edad puede provocar la disminución del movimiento corporal. Alternativamente, puede haber un mecanismo común que influya en el momento de cada uno de estos procesos. Las disminuciones de la reproducción autofértil y el ciclo de deserción no mostraron correlaciones con otros cambios relacionados con la edad. Una explicación de estos resultados es que la falta de correlaciones ocurrió porque los enfoques utilizados para medir estos procesos no fueron óptimos. Por ejemplo, el período reproductivo autofértil probablemente no sea una medida precisa de la disminución de la fertilidad relacionada con la edad, ya que los hermafroditas autofértiles cesan la producción de progenie como resultado del agotamiento de los espermatozoides. En general, estos resultados indican que los cambios relacionados con la edad en la morfología y función de los tejidos están controlados por mecanismos comunes y / o vinculados causalmente en series.

3.2. Caracterización de mutaciones que influyen en la longevidad

Un segundo logro importante de estos estudios es el análisis exhaustivo de los cambios relacionados con la edad en los mutantes que muestran una vida útil prolongada. Estos estudios son importantes para dilucidar los mecanismos que provocan que estas mutaciones retrasen el envejecimiento. La Tabla 3 resume este análisis de cinco genes que han sido caracterizados extensamente por muchos laboratorios. Mutaciones de pérdida de función de daf-2 y edad-1 que reducen la actividad de una vía de señalización de la insulina / IGF retrasan casi todos los cambios relacionados con la edad que se han informado, incluida la disminución del comportamiento neuromuscular, la morfología de los tejidos y los cambios bioquímicos. Por el contrario, daf-16 Las mutaciones con pérdida de función aceleran una amplia gama de cambios relacionados con la edad. Estos estudios indican que la vía de señalización de la insulina / IGF no afecta los aspectos selectivos del envejecimiento, sino que retrasa un amplio espectro de cambios relacionados con la edad. Del mismo modo, el comer-2 La mutación que da lugar a una restricción dietética retrasa un amplio espectro de cambios de comportamiento, morfológicos y bioquímicos. Estas observaciones son similares a los resultados de los estudios de restricción dietética en roedores, que han demostrado que la restricción calórica retrasa muchos cambios relacionados con la edad (Masoro, 2005). Estos hallazgos son consistentes con las correlaciones positivas entre diferentes cambios relacionados con la edad. Puede ser una propiedad general que las mutaciones que pueden extender la vida útil también pueden retrasar un amplio espectro de cambios relacionados con la edad.

3.3. ¿Los cambios degenerativos relacionados con la edad son especificados por un programa genético o son el resultado de la ausencia de un programa de mantenimiento continuo?

Un tema conceptual crítico en el campo del envejecimiento es el papel de los programas genéticos en el control de los cambios degenerativos relacionados con la edad. Aquí discutimos cómo el análisis de C. elegans contribuye a comprender este tema considerando dos teorías. La primera teoría es que los cambios degenerativos relacionados con la edad se especifican mediante un programa genético. La segunda teoría es que los cambios degenerativos relacionados con la edad son causados ​​por la ausencia de instrucciones codificadas genéticamente que permitan el mantenimiento continuo y la supervivencia del organismo.

Según la primera teoría, los cambios degenerativos relacionados con la edad deberían ser relativamente reproducibles, similares a los cambios del desarrollo relacionados con la edad, ya que ambos tipos de eventos están genéticamente especificados. Además, debería ser posible identificar mutantes que no sufren cambios degenerativos específicos relacionados con la edad, mediante la mutación de genes que especifican estos cambios. Según la segunda teoría, los cambios degenerativos relacionados con la edad deberían ser relativamente caóticos y menos reproducibles que los cambios en el desarrollo. Además, no debería ser posible identificar mutantes que no sufran cambios específicos relacionados con la edad, ya que estos cambios no están especificados por un programa genético.

Primero, consideraremos el grado en que los cambios relacionados con la edad son reproducibles versus caóticos y estocásticos. Esta revisión ha enfatizado los aspectos reproducibles de los cambios degenerativos relacionados con la edad, incluido el hallazgo de que la mayoría de los cambios se vuelven progresivamente más severos y que la mayoría de los cambios ocurren durante un período de tiempo característico. Por ejemplo, la reproducción cesa típicamente antes de que cese el bombeo faríngeo. Por otro lado, Herndon et al. (2002) concluyó que el patrón de cambios relacionados con la edad sugiere que estos cambios están mediados por eventos estocásticos. La evidencia de que los cambios relacionados con la edad están mediados por eventos estocásticos es el grado de variabilidad que muestran los animales que envejecen. Por ejemplo, en un grupo de animales que tienen la misma edad cronológica, puede haber una amplia variación en la capacidad para realizar una función como el movimiento corporal. Además, a nivel celular, Herndon et al. (2002) señalaron que existe una variabilidad sustancial en los cambios degenerativos. Por ejemplo, examinar un par de células que son simétricas de izquierda a derecha podría revelar que la célula izquierda estaba muy degenerada, mientras que la derecha estaba intacta. Estos estudios documentan de manera convincente el grado de variabilidad de los cambios por envejecimiento. Sin embargo, los eventos del desarrollo que están programados muestran cierta variabilidad. Si bien parece que los cambios relacionados con la edad a nivel celular son más variables que los eventos del desarrollo, la cantidad de esta variabilidad adicional no se ha definido y es difícil cuantificar la variabilidad. A pesar de estas advertencias, la observación de que los cambios degenerativos relacionados con la edad son muy variables y es probable que estén mediados por procesos estocásticos es un descubrimiento significativo que sugiere que los cambios relacionados con la edad son el resultado de la ausencia de un programa genético.

En segundo lugar, consideramos cómo C. elegans las mutaciones que influyen en el envejecimiento abordan estas dos teorías. Se han identificado un gran número de mutaciones que se extienden C. elegans esperanza de vida. Estas mutaciones suelen retrasar los cambios degenerativos relacionados con la edad, pero normalmente no afectan la naturaleza de estos cambios. En otras palabras, los mutantes de larga vida y los animales de tipo salvaje muestran cambios relacionados con la edad muy similares, siendo la principal diferencia el retraso en el tiempo de estos cambios en los mutantes. No se han descrito bien los mutantes que no experimentan cambios específicos relacionados con la edad. Por lo tanto, los genes que influyen en la vida útil parecen controlar los procesos que determinan la tasa de cambios degenerativos relacionados con la edad y no parecen especificar la naturaleza de los cambios degenerativos relacionados con la edad. Interpretamos estos hallazgos como los más consistentes con la teoría de que los cambios degenerativos relacionados con la edad no están especificados por un programa genético, sino que son el resultado de la ausencia de un programa genético para el mantenimiento continuo.

3.4. La evolución del envejecimiento reproductivo

La evolución del envejecimiento es un tema importante, y los estudios sobre el envejecimiento reproductivo en C. elegans han llevado a una nueva teoría para explicar este fenómeno. La historia reproductiva de un C. elegans hermafrodita implica (1) el inicio de la producción de progenie como resultado de la madurez sexual, (2) cierto nivel de producción de progenie durante el período fértil y (3) el cese de la producción de progenie como resultado del envejecimiento reproductivo. Estos tres procesos determinan la tasa de producción de progenie y el número total de progenie generada por un individuo. Debido a que la reproducción exitosa es el propósito último de la vida animal, es probable que los tres procesos sean esculpidos por selección natural durante la evolución. Por tanto, es probable que la comprensión del envejecimiento reproductivo proporcione conocimientos fundamentales sobre la evolución del envejecimiento.

Si se retrasara el envejecimiento reproductivo, se predeciría que un animal generaría más progenie. Debido a que el envejecimiento en general y el reproductivo en particular parecen disminuir la producción de progenie, estos rasgos han sido un tema de debate para los teóricos de la evolución. La teoría moderna de la evolución del envejecimiento fue propuesta por Medawar y postula que la mortalidad extrínseca es la causa de la evolución del envejecimiento porque da como resultado una disminución relacionada con la edad en la fuerza de la selección natural (Medawar, 1952). Esta teoría propone que la selección natural no puede favorecer los rasgos que prolongan la longevidad más allá del momento en que la mayoría de los individuos han muerto como resultado de la mortalidad extrínseca. La elaboración de Williams de esta idea básica, la teoría de la pleiotropía antagónica, postula que los rasgos que promueven la reproducción temprana a costa de disminuir la reproducción tardía serán favorecidos por la selección natural (Williams, 1957). Esta teoría propone que existen compensaciones entre la reproducción temprana y tardía y la selección para una reproducción temprana mejorada es la causa del envejecimiento. Estas teorías asumen que el envejecimiento reproductivo confiere una desventaja selectiva porque disminuye la producción de progenie. Una suposición alternativa es que la producción de progenie es ventajosa inicialmente pero en algún momento la producción continua de progenie confiere una desventaja selectiva basada en esta suposición, el envejecimiento reproductivo confiere una ventaja selectiva porque detiene la producción de progenie.

Los resultados de Hughes et al. (2007) abordan las relaciones entre la producción temprana de progenie y el envejecimiento reproductivo y son relevantes para las predicciones de la teoría de la pleiotropía antagónica. La teoría de la pleiotropía antagónica predice que el aumento de la producción de progenie al final del período reproductivo debería ir acompañado de una disminución de la producción de progenie al comienzo del período reproductivo (Williams, 1957). Hughes y col. (2007) demostraron que la temperatura fría, la restricción dietética y una daf-2 (lf) la mutación aumenta la reproducción tardía y disminuye la reproducción temprana, de acuerdo con esta predicción de la teoría. Por el contrario, un fármaco anticonvulsivo aumenta la reproducción tardía pero no disminuye la reproducción temprana, y esto no es consistente con esta predicción de la teoría. En general, estos resultados sugieren que no existe una relación consistente entre la producción de progenie temprana y la producción de progenie tardía. Por lo tanto, la selección durante la evolución para niveles altos de reproducción temprana puede no ser una causa de envejecimiento reproductivo en C. elegans .

Hughes y col. (2007) proponen una hipótesis alternativa para la evolución del envejecimiento reproductivo. Es decir, esa selección para un número óptimo de progenie puede determinar el momento del envejecimiento reproductivo. Dos observaciones importantes apoyan esta propuesta. Primero, C. elegans los hermafroditas que no están limitados en espermatozoides sufren un cese completo de la producción de progenie como resultado del envejecimiento reproductivo antes del final de la vida útil. Estos hallazgos sugieren que la degeneración relacionada con la edad de los sistemas somáticos que sustentan la vida puede no limitar la reproducción, sino que el sistema reproductivo está diseñado para fallar antes de que falle el soma. Segundo, C. elegans los hermafroditas tienen la capacidad de generar una mayor cantidad de progenie total y una mayor cantidad de progenie más adelante en la vida, y estas capacidades no se utilizan normalmente (Hughes et al., 2007). Juntos, estos hallazgos indican que C. elegans no está diseñado para generar el máximo número posible de progenie. Hughes y col. (2007) proponen que existe un número óptimo de progenie F1, y el envejecimiento reproductivo contribuye a la capacidad del animal para generar el número óptimo de progenie. Si una especie encuentra presión selectiva para un aumento en el número de progenie, entonces puede evolucionar un envejecimiento reproductivo retrasado. Si una especie encuentra presión selectiva para una disminución en el número de progenie, entonces puede evolucionar un envejecimiento reproductivo acelerado. Según esta teoría, los factores ambientales que establecen el número óptimo de progenie serán críticos para la evolución del envejecimiento reproductivo. Limitar la producción de progenie a un número óptimo podría actuar en dos niveles para maximizar el éxito reproductivo. A nivel del individuo, generar el número óptimo de progenie puede limitar la competencia por los recursos entre la progenie y maximizar la probabilidad de que el número óptimo de progenie F1 madure para convertirse en adultos reproductivos. A nivel de la población, generar el número de progenie óptimo puede ayudar a lograr el número máximo sostenible de animales en la población y evitar oscilaciones en el número de animales en la población que podrían aumentar la vulnerabilidad a la extinción. De acuerdo con esta propuesta, la selección del número óptimo de progenie establece el momento del envejecimiento reproductivo. Una vez que haya cesado la reproducción, no habrá ventaja selectiva para la supervivencia continua del soma, y ​​el envejecimiento somático podría resultar de esta ausencia de selección para el mantenimiento somático continuo.


Métodos

Cepas y condiciones de crecimiento

Peso C. elegans (N2), CF1038 (daf-16 (mu86) yo), TG38 (aak-2 (gt33)), CF1553 (muIs84 ((pAD76) sod-3p:: GFP +rol-6)), CF1580 (daf-2(e1370) III muIs84 ((pAD76) sod-3p:: GFP +rol-6)), HT1890 (daf-16 (mgDf50) I daf-2 (e1370) III) y CB1370 (daf-2 (e1370) III) cepas se obtuvieron de la Caenorhaditis Centro de Genética. Los gusanos se manipularon de acuerdo con métodos estándar 57. Las cepas se cultivaron en placas de agar con medio de crecimiento de nematodos (NGM) a 20 ° C, excepto daf-2 cepa, que se cultivó a 15 ° C hasta la etapa L4. E. coli Se cultivaron bacterias OP50 durante la noche en LB y se esparcieron 50 µl sobre las placas de agar. Las placas se incubaron durante ~ 20 ha 25 ° C y luego durante al menos 1 ha 20 ° C antes de que se transfirieran los gusanos a ellas.

Para los experimentos de ARNi, los huevos se aislaron mediante el tratamiento de hermafroditas adultos con hipoclorito alcalino y se les permitió desarrollarse y crecer durante dos generaciones en cepas bacterianas específicas que expresan ARNi antes de usarse o analizar la vida útil y la resistencia al estrés. La primera generación se usó solo en caso de gusanos alimentados con bacterias que expresan gspd-1 ARNi, ya que no se desarrolla la segunda generación. E. coli HT115 cepas que albergan plásmidos que expresan ARNi de doble hebra contra C.elegans gsy-1, pyg-1, gsr-1 y gspd-1 Se adquirieron genes de la colección Thermo Scientific y se purificaron y secuenciaron aislados de una sola colonia para demostrar la presencia del inserto correcto. Culturas nocturnas de E. coli Se cultivaron bacterias HT115 que albergaban el plásmido que expresa ARNi o el control del vector del plásmido vacío (pL4440) en LB con 100 m kg ml -1 de carbenicilina, se concentraron 4 veces y se esparcieron 50 μl sobre placas de agar NGM suplementadas con 100 μg ml -1 de carbenicilina y IPTG 1 mM. Las placas sembradas se incubaron durante al menos 1 ha 20 ° C antes de que los gusanos se transfirieran a ellas.

Análisis de vida útil

La esperanza de vida se monitorizó a 20 ° C como se describió anteriormente 58,59. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces y se utilizaron aproximadamente 100 gusanos para cada experimento. En todos los casos, se utilizaron gusanos en estadio L4 en t= 0 para análisis de vida útil.Se juzgó que los gusanos estaban muertos cuando cesaron el bombeo faríngeo y no respondieron al pinchazo con un alambre de platino. Los gusanos con eclosión interna se eliminaron de las placas y no se incluyeron en los cálculos de vida útil. Se analizaron los datos y se generaron las curvas de supervivencia sigmoidea de Boltzmann utilizando el paquete de software de análisis estadístico SciDAVis. La esperanza de vida media se comparó en Microsoft Excel utilizando la t-prueba, asumiendo una distribución de una cola y una varianza igual de dos muestras. Todas las gráficas de vida útil representan los compuestos de todos los experimentos independientes tabulados en la Tabla complementaria 2.

En todos los experimentos, se permitió que los gusanos se desarrollaran hasta la etapa L4 en placas NGM a 20 ° C (con la excepción de daf-2, que se desarrolló a 15 ° C) y luego se transfirió a las placas con los aditivos indicados. Cuando se indique, se mezcló glucosa (concentración final al 2%) en placas NGM. Los oxidantes se distribuyeron uniformemente en placas húmedas de NGM (o NGM con glucosa) para alcanzar una concentración final de: diamida 5 mM, paraquat 0,2 mM o acetaminofeno 5 mM. Se prepararon soluciones madre de diamida y paracuato en agua, se disolvió acetaminofeno en etanol y se usó la misma concentración del disolvente en las placas de control. Las placas se secaron durante 30 minutos antes de sembrar con bacterias. Como todos los oxidantes tienen algún efecto bacteriostático, los cultivos bacterianos de la noche a la mañana se concentraron 8 veces y se esparcieron 50 µl sobre placas de agar.

Ensayos de resistencia al estrés

La resistencia a diamida o paraquat se evaluó esencialmente como se describe 60. Se permitió que los gusanos se desarrollaran y crecieran en placas de agar a 20 ° C hasta que alcanzaron la etapa L4 y luego se transfirieron a placas de NGM + 50 μg ml -1 de kanamicina con sorbitol o glucosa al 2% y se incubaron durante ~ 20 ha 20 ° C. Era importante agregar sorbitol en el control para igualar la osmolaridad de una dieta alta en glucosa. La kanamicina previene el consumo de sorbitol y glucosa por parte de las bacterias. Los gusanos (40-80 animales por cada condición experimental) se recogieron en tubos de microcentrífuga con 0,25 ml de tampón M9 con sorbitol o glucosa suplementada con oxidante. La concentración final de diamida fue 125 o 150 mM y paraquat, 125 mM. Los tubos se incubaron a 20 ° C con agitación durante 1 a 2 h. Para eliminar el oxidante, los gusanos se lavaron en tampón M9 tres veces y luego se transfirieron a placas NGM sembradas con bacterias. Las placas se incubaron durante 48 ha 20 ° C y luego se contaron los gusanos vivos y se calculó la tasa de supervivencia como una relación de los vivos al número total de gusanos transferidos a la placa después del tratamiento oxidante. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces y el promedio ± desviación estándar. presentado en las Figs.

Determinación del contenido de glucógeno en C. elegans

Se permitió que los gusanos se desarrollaran y crecieran en placas de agar a 20 ° C hasta que alcanzaron la etapa L4 y luego se transfirieron a placas NGM con o sin glucosa. A determinadas edades, los gusanos se recogieron en tubos microcentrífugos, se lavaron rápidamente dos veces con agua destilada, se eliminó la mayor parte del líquido y los gusanos se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su posterior análisis. Para el análisis, los gusanos se resuspendieron en ∼ 70 μl de dH2O e inmediatamente se hierve durante 5 min para inhibir la degradación enzimática del glucógeno. Los tubos se enfriaron en hielo y los gusanos se trituraron con un mortero desechable y se separaron por centrifugación las proteínas agregadas y otro material insoluble. Se utilizó un kit de ensayo de glucógeno (Sigma, MAK016-1KT) para determinar el contenido de glucógeno en el sobrenadante. Como la mayoría de las proteínas precipitan después de hervir, los sedimentos se disolvieron en M9 con guanidina HCl 8 M, se separaron del material insoluble y se determinó la cantidad de proteína en el sobrenadante. La cantidad total de glucógeno informada en las Figuras se normalizó en relación con la proteína total en la muestra. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces y el promedio ± desviación estándar. presentado en las Figuras. Los resultados detallados de los experimentos individuales se presentan en la Tabla complementaria 3.

Determinación del contenido reducido de tiol

Los tioles celulares reducidos totales se cuantificaron por reacción con ácido 5,5'-ditiobis- (2-nitrobenzoico) (DTNB) 61. Se permitió que los gusanos se desarrollaran y crecieran en placas de agar a 20 ° C hasta L4 y luego se transfirieron a placas NGM con o sin glucosa. Para cada condición experimental, se recolectaron 100 gusanos en tubos microcentrífugos, se lavaron rápidamente 3 veces con tampón M9 y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente en tampón M9 con o sin diamida 100 mM. Todos los animales sobreviven a un tratamiento tan corto con diamida. Los gusanos se lavaron tres veces para eliminar la diamida. Después de eliminar la mayor parte del líquido, los gusanos se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Para el análisis, se añadieron ∼ 150 µl de tampón M9 con DTNB 2 mM a los tubos con gusanos, los animales congelados se trituraron con un mortero desechable y se lisaron mediante dos ciclos de congelación-descongelación. Los materiales insolubles se eliminaron por centrifugación y los lisados ​​se clarificaron usando un filtro giratorio MWCO de 10 kDA. Se determinó la absorbancia a 412 nm en el flujo continuo. La concentración de tiol en las muestras se calculó de acuerdo con una curva estándar generada por reacción de DTNB con GSH y luego se ajustó a una concentración de proteína en los lisados.

Ensayos de reportero fluorescente

Gusanos que expresan GFP bajo el control de sod-3 (CF1553 y CF1580) se alimentaron en placas NGM sembradas con E. coli HT115 que alberga un vector vacío o un bicatenario que expresa plásmido gsy-1 ARNi. Se anestesiaron gusanos adultos de uno (A1) y 3 (A3) días en una gota de azida sódica al 2% y las imágenes se capturaron inmediatamente usando un microscopio Zeiss AxioZoom v16 equipado para iluminación de fluorescencia. La intensidad de la fluorescencia se cuantificó utilizando el paquete de software Zeiss ZEN.

Tinción de glucógeno in vivo

Para visualizar el glucógeno, se tiñeron gusanos vivos sobre una lata con yodo como se describe en la ref. 62. Algunos gusanos de la placa de control y suplementada con glucosa se transfirieron rápidamente a una placa nueva, que se invirtió inmediatamente y se colocó sobre una botella de yodo de 100 g durante 2 min. Las imágenes se obtuvieron con un tiempo de exposición fijo utilizando un microscopio estereoscópico Zeiss Discovery equipado con una cámara a color (Optixcam). El espejo de la etapa del iluminador se ajustó para maximizar la transparencia del gusano para una mejor visualización del glucógeno.

Tinción de lípidos

La tinción Oil-Red-O se realizó esencialmente como se describe en la ref. 9. Se recogieron gusanos de tres días, se lavaron con M9 y se fijaron en isopropanol al 60% en PBS. La solución madre de Oil-Red-O (Sigma, O1391) se diluyó con agua al 60% y el precipitado se eliminó mediante un filtro de 0,2 µm. Los gusanos se tiñeron durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con M9 + tritón X100 al 0,5% y se colocaron en placas NGM y las imágenes se capturaron usando un microscopio Zeiss AxioZoom v16.

Contenido de ATP

Se utilizó el kit de ensayo colorimétrico / fluorométrico de ATP (Sigma, MAK190-1KT) para determinar la concentración de ATP en los lisados ​​de gusanos. Se recogieron aproximadamente 100 gusanos, se lavaron con tampón M9 y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Los sedimentos se trituraron con morteros en 100 µl de tampón de lisis y se diluyeron con 200 µl de tampón de lisis. Las células se lisaron mediante dos ciclos de congelación-descongelación y se desproteinizaron utilizando un filtro giratorio MWCO de 10 kDA. La concentración de ATP se midió en el flujo continuo.

Cultivo celular, transfección y tinción de glucógeno

Se cultivaron células HepG2 (ATCC, HB-8065) ​​en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10% (v / v) y glutamina 10 mM, pH 7,4. Las células se cultivaron hasta un 70-80% de confluencia en placas de 100 mm y luego se transfectaron transitoriamente mediante nlucleofección (Lonza) con ARNip dirigido a GYS2 siguiendo el protocolo del fabricante. Las células de control se transfectaron con ARNip no dirigido (SiNt). Cada transfección de ARNip se realizó con un cóctel de dos ARNip. Y se utilizaron dos combinaciones para asegurar la especificidad (Si (2 + 3), Si (1 + 3)). Para obtener la lista de ARNip, consulte la Tabla complementaria 5. La eficiencia de transfección excedió el 85%. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se privaron de alimento durante 2 h en DMEM sin suero bovino fetal antes de añadir medio con glucosa 12,5 mM. Veinticuatro horas después del tratamiento con glucosa baja, el medio se reemplazó por DMEM que contenía glucosa 2 5 mM y se añadió insulina humana recombinante hasta una concentración final de 25 µM.

El glucógeno en los hepatocitos se tiñó con ácido periódico-Schiff (PAS) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sigma). Se obtuvieron imágenes de células teñidas con PAS usando el sistema de imágenes de células EVOS y las imágenes se prepararon usando el software Image J. El porcentaje de glucógeno se cuantificó usando absorbancia a 594 nm para medir la intensidad de PAS y normalizándolo a la intensidad de la tinción nuclear 4,6-diamidino-2-fenilindol a 350 nm.

Ensayo de resistencia al estrés oxidativo en cultivo celular

Las células HepG2 se trataron durante 30 min con 50 μM de H2O2. El h2O2-se retiró el medio que contenía y se reemplazó con medio fresco a 37 ° C. La viabilidad celular se ensayó después de 24 h midiendo la incorporación de NucGreen Dead 488 y la intensidad de la fluorescencia se normalizó a la tinción de Hoechst.

Análisis de secuenciación y expresión diferencial

Se permitió que los gusanos se desarrollaran y crecieran en placas de agar a 20 ° C hasta que alcanzaron la etapa L4 y luego se transfirieron a placas NGM con o sin glucosa y se incubaron durante ~ 20 ha 20 ° C. Aproximadamente, se recolectaron 300 gusanos y se lavaron en tampón S, y se aisló el ARN total como se describe en la ref. 63. Se utilizó un kit de preparación de muestras de ARN TrueSeq v2 (Illumina) para preparar 1 μg de ARN total para ARN-seq. Se realizaron tres réplicas biológicas independientes para cada condición experimental. El genoma de referencia y los datos de anotación para C. elegans (Ensambl de conjunto basado en la compilación WS220) se descargaron del sitio web de Illumina (ftp: // igenome: [email protected]/Caenorhabditis_elegans/Ensembl/WS220/Caenorhabditis_elegans_Ensembl_WS220.tar.gz). Para estimar el nivel de expresión de las transcripciones y probar la expresión diferencial entre diferentes condiciones experimentales, se utilizó la tubería Tophat / Cufflinks / Cuffdiff 64. Brevemente, las lecturas de RNA-seq se recortaron de las secuencias adaptadoras y luego se mapearon a la C. elegans transcriptome con el paquete de software Tophat 65 utilizando el alineador bowtie2 y los parámetros predeterminados. Se reunieron las transcripciones y se estimó su abundancia utilizando el paquete Gemelos 66. Se realizó una prueba estadística para la expresión diferencial de genes utilizando la herramienta Cuffdiff en el paquete Cufflinks con un q valor (PAG valor ajustado para pruebas múltiples) umbral de 0,05). El análisis y visualización de los datos de expresión diferencial se realizó con el paquete de software R (versión 2.15.1) utilizando la biblioteca cummeRbund (versión 2.0).

Disponibilidad de datos

Los datos de RNA-seq generados en este estudio se han depositado en el NCBI GEO con el código de acceso GSE98576.


Expresiones de gratitud

Agradecemos a Tony Belicard por su ayuda durante la recolección de manzanas que se utilizaron para cultivar aislados bacterianos naturales Isabelle Nuez para la secuenciación 16S de algunas cepas bacterianas Jonah Larkins-Ford y Annie Conery por su ayuda con los experimentos de clasificación de gusanos Chris Carr por su ayuda técnica con la secuenciación de Ion Torrent Fred Ausubel por las cepas y sugerencias útiles Sarah Marsh por los comentarios sobre el manuscrito miembros del GR laboratorio, el laboratorio F. Ausubel y el laboratorio J. Kaplan por su apoyo y sugerencias durante todo el proyecto y C. elegans Centro de existencias genéticas para cepas, financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). B.S.S. fue financiado por una beca posdoctoral senior Charles King Trust y una beca posdoctoral del Premio del Servicio Nacional de Investigación Ruth L. Kirchstein (DK838852). Este trabajo también fue apoyado por NIH Grant AG16636 (a G.R.).


6. Control transcripcional en el intestino

los C. elegans intestino es uno de los pocos linajes celulares donde se puede proponer una secuencia plausible de interacciones moleculares directas a lo largo del ciclo de vida, comenzando con factores de origen materno en el citoplasma del cigoto fertilizado, progresando a través de un pequeño número de factores de transcripción cigóticos y terminando con la transcripción de genes de vitelogenina en el intestino adulto para proporcionar alimento a la próxima generación. En la sección actual, enfatizamos los pasos que ocurren después de la especificación del endodermo, es decir, los factores de transcripción involucrados en la diferenciación, función y mantenimiento intestinal.

6.1. Análisis de promotores específicos del intestino

Comenzando con el trabajo inicial sobre los genes de la vitelogenina realizado por Blumenthal y colaboradores, los promotores de los siguientes genes, expresados ​​exclusiva o principalmente en el intestino y en una variedad de etapas de desarrollo, se han analizado hasta el punto en que cis -se han mutado los sitios que actúan: vit-2 (MacMorris y Blumenthal, 1993 MacMorris et al., 1994) cpr-1 (Britton et al., 1998) ges-1 (Egan et al., 1995 Marshall y McGhee, 2001) mtl-1 y mtl-2 (Moilanen et al., 1999) pho-1 (Fukushige et al., 2005) spl-1 (Oskouian et al., 2005) elo-6 (Pauli et al., 2006) y tres genes que codifican las enzimas de síntesis de poliaminas (Luersen et al., 2004). Para todos los genes investigados, un sitio extendido similar a GATA es de vital importancia para la transcripción específica del intestino. Esta conclusión ha sido confirmada por análisis computacionales de promotores de genes intestinales (McGhee et al., 2007 Pauli et al., 2006). Sólo un pequeño número de sitios no GATA han sido implicados experimentalmente en el control de la transcripción de genes intestinales: los elementos VPE1 / TGTCAAT en los promotores de vitelogenina (MacMorris et al., 1992 MacMorris et al., 1994), sitios de unión MAB-3 en promotores de vitelogenina (Yi y Zarkower, 1999) y un sitio de unión SKN-1 en el promotor de la gcs-1 gen (An y Blackwell, 2003). En el caso de la gcs-1 gen, el sitio crítico SKN-1 se superpone con un sitio GATA por lo que sigue siendo posible que un factor GATA también esté involucrado aquí también. A continuación se discutirá una interacción plausible entre los sitios MAB-3 y GATA en la regulación de la transcripción de vitelogenina.

6.2. Factores GATA intestinales y predominio de ELT-2

los C. elegans El genoma codifica once factores relacionados con GATA de dedos de zinc, en comparación con seis factores GATA en vertebrados (Lowry, 2000 Patient, 2002). La participación crucial de varios de estos factores GATA en la especificación del endodermo será discutida en el futuro capítulo de WormBook por J. Rothman y M. Maduro y solo se resume brevemente aquí.

Especificación de la C. elegans El endodermo comienza con el factor SKN-1 similar a bZIP derivado de la madre que determina el destino del blastómero EMS del embrión de cuatro células (ver Figura 2 Bowerman et al., 1992 Bowerman et al., 1993). El blastómero EMS luego se divide asimétricamente para producir la célula anterior de MS (mesodermo) y la célula E posterior (endodermo), el progenitor clonal del intestino. La asimetría crucial de esta división es introducida por una señal que pasa a la celda E desde la celda posterior adyacente P2 (Goldstein, 1992 Goldstein, 1993) esta señal basada en la vía Wnt-MAPK-Src (Rocheleau et al., 1997 Thorpe et al., 1997) conduce a una disminución de la concentración nuclear de la proteína HMG POP-1 (Lin et al., 1995 Lin et al., 1998 Lo et al., 2004), aliviando así la represión de la vía del endodermo y, al mismo tiempo, convirtiendo POP-1 (o una fracción de POP-1) en un activador del gen del endodermo. (Maduro et al., 2005 Shetty et al., 2005). Junto con POP-1 en su función de activador transcripcional, SKN-1 también activa directamente la transcripción de genes que codifican los dos factores GATA que especifican el endodermo END-1 y END-3 (Zhu et al., 1997 Zhu et al., 1998 Maduro et al., 2005 Maduro et al., 2005 Shetty et al., 2005). En el blastómero EMS, SKN-1 también es responsable de activar la transcripción de genes que codifican dos pequeños factores GATA redundantes altamente divergentes llamados MED-1 y MED-2 (Maduro et al., 2001) aunque importante para el destino del blastómero MS (Maduro et al., 2001). al., 2001 Broitman-Maduro et al., 2005), los factores MED-1 y MED-2 parecen mucho menos importantes para determinar el destino de las células E (Goszczynski y McGhee, 2005 Captan et al., 2006 Maduro et al., 2006 ). La proteína homeobox PAL-1, cuya principal función materna es especificar el destino de los blastómeros C y D (Hunter y Kenyon, 1996), también contribuye a fin-1 / fin-3 activación (Maduro et al., 2005) pero quizás solo en la situación inducida experimentalmente en la que se eliminó SKN-1. Expresión de la fin-1 y fin-3 Los genes son transcripciones transitorias que pueden detectarse en la etapa de la célula 1E pero han decaído en gran medida por la etapa de la célula 8E (Zhu et al., 1997 Baugh et al., 2005) en este momento, no hay evidencia ni a favor ni en contra de la persistencia de Proteína END-1/3. El modelo actual es que END-1 y END-3 ponen en marcha toda la vía de especificación del endodermo, una de cuyas características centrales es la activación de genes que codifican la siguiente ronda de factores GATA, principalmente ELT-2.

los elt-2 gen (donde elt significa factor de transcripción similar a eritrocitos ( sic ) Spieth et al., 1991) codifica un factor de transcripción de tipo GATA con un solo dedo de zinc (Hawkins y McGhee, 1995) que, sugerimos, es el factor de transcripción predominante en el C. elegans intestino siguiendo los primeros pasos de la especificación del endodermo (McGhee et al., 2007) ver Figura 5. La expresión de ELT-2 comienza durante la etapa de la célula 2E y persiste hasta la edad adulta. elt-2 autorregulación genética (Fukushige et al., 1998 Fukushige et al., 1999). Supresión de elt-2 es letal: el lumen intestinal está bloqueado (el intestino obstruido o fenotipo Gob Fukushige et al., 1998) y los animales afectados mueren como larvas L1 eclosionadas, presumiblemente por inanición. No obstante, el elt-2 (- / -) el intestino está razonablemente bien formado y, a simple vista, casi normal. Por lo tanto, otros factores de transcripción (posiblemente solo END-1 y END-3) deben ser capaces de construir la mayor parte del intestino embrionario temprano. Sin embargo, ELT-2 probablemente contribuye a esta fase temprana del desarrollo intestinal porque es suficiente (aunque no necesario) para la expresión de marcadores endodermos tempranos como ges-1 , ifb-2 y gránulos intestinales (Fukushige et al., 1998). Las funciones esenciales de ELT-2 se revelan por primera vez más tarde en la embriogénesis. En particular, se ha demostrado que ELT-2 es necesario para la expresión de tres genes específicos del intestino que se expresaron por primera vez al final de la embriogénesis y se analizaron inmediatamente después de la eclosión: el mtl-2 gen de la metalotioneína (Moilanen et al., 1999), el spl-1 gen de la esfingosina fosfato liasa (Oskouian et al., 2005) y el pho-1 gen de la fosfatasa ácida intestinal (Fukushige et al., 2005).

Figura 5. Los roles propuestos del factor ELT-2 GATA en la vía general que forma el C. elegans endodermo. Las sucesivas etapas de la vida y los tiempos aproximados (horas a 25 ° C después de la fertilización) de la C. elegans El ciclo de vida está representado por el círculo de la izquierda (adaptado de (Wood et al., 1980).La primera etapa en la formación del endodermo ocupa

1.5 horas después de la fertilización, terminando con la producción de END-1 y END-3 en el blastómero E, el evento definitorio en la especificación del endodermo. La segunda fase (& # 8220Period of ELT-2 / END-1 / END-3 Redundancy & # 8221) comienza en la etapa de celda 2E cuando ELT-2 se produce por primera vez y termina en la etapa de celda 8E-16E (

4 horas después de la fertilización) cuando los niveles de END-1 y END-3 hayan decaído. Sugerimos que ELT-2, END-1 y END-3 participan en la activación transcripcional de los genes del intestino durante esta fase temprana del desarrollo del intestino. La tercera fase (& # 8220Period of ELT-2 Dominance & # 8221) comienza en la etapa celular 8E-16E y continúa a lo largo de todas las etapas larvarias posteriores, incluido el adulto. En esta fase, proponemos que ELT-2 está directa y necesariamente involucrado en todos los actos de transcripción en el intestino, incluida la transcripción de genes que codifican otros factores de transcripción (por ejemplo, ELT-4, ELT-7, TFx, TFy, etc.), que en turn puede cooperar con ELT-2 en el montaje de respuestas transcripcionales particulares. ELT-7 (y posiblemente ELT-4) puede proporcionar respaldo redundante para una fracción menor de genes regulados por ELT-2, es decir, un elt-7 elt-2 doble knockout tiene un fenotipo ligeramente más severo que un elt-2 knockout por sí mismo (resultados inéditos de K. Strohmaier y J. Rothman nuestros resultados inéditos). Figuras y leyendas de figuras reproducidas de McGhee et al. (2006) con permiso de Elsevier.

ELT-4 y ELT-7 (C18G1.2) son otros dos factores GATA expresados ​​en el intestino en desarrollo que comienza aproximadamente a la mitad de la embriogénesis (Fukushige et al., 2003) y los resultados no publicados de K. Strohmaier citados en (Maduro y Rothman, 2002) ). Sin embargo, ninguno de los factores parece tener una influencia importante en el desarrollo del intestino, es decir, los animales en los que el elt-4 gen (Fukushige et al., 2003) o el elt-7 gen (Fukushige et al., 2005 Oskouian et al., 2005 y resultados no publicados de Keith Strohmaier) o ambos elt-4 y elt-7 Los genes (McGhee et al., 2007) han sido eliminados o sus transcripciones eliminadas por ARNi son esencialmente de tipo salvaje. Sin embargo, elt-2 elt-7 los nocauts dobles muestran un fenotipo ligeramente más severo que el elt-2 nocaut único (resultados no publicados de Keith Strohmaier nuestros resultados no publicados), lo que sugiere que elt-7 es parcialmente redundante con elt-2 .

Por lo tanto, proponemos el modelo simple (ver Figura 5) que, siguiendo la especificación del endodermo, ELT-2 participa en todos los actos de transcripción en el intestino. Sin embargo, otros factores de transcripción están claramente presentes en el intestino (ver más abajo) y es probable que modulan la acción de ELT-2 en diferentes circunstancias ambientales o de desarrollo. La transcripción de los genes de la vitelogenina en el intestino hermafrodita proporciona un posible ejemplo de cómo podría ocurrir esto. Los genes de la vitelogenina (proteína de la yema) se expresan en el intestino hermafrodita adulto pero no en el intestino masculino (Kimble y Sharrock, 1983). Se sabía desde hacía algún tiempo que el mab-3 El gen está involucrado en la represión de la síntesis de vitelogenina masculina (Shen y Hodgkin, 1988) y Yi y Zarkower han demostrado que este efecto es directo (Yi y Zarkower, 1999). La proteína MAB-3 muestra similitud con Drosophila doble sexo , que, entre otras cosas, también es responsable de la regulación específica del sexo de la síntesis de proteína de la yema en moscas (Raymond et al., 1998). Se identificó la secuencia de unión de MAB-3 preferida in vitro y luego se identificaron secuencias relacionadas en los promotores de media docena de genes de vitelogenina (Yi y Zarkower, 1999). MAB-3 se une directamente a uno de esos sitios en un constructo de promotor-indicador abreviado de la vit-2 El gen y la mutación de este sitio provocan la desrepresión del gen informador en los intestinos masculinos. Un sitio GATA crítico (MacMorris et al., 1992 MacMorris et al., 1994) se encuentra inmediatamente adyacente a este sitio MAB-3, lo que sugiere que MAB-3 podría actuar en el intestino masculino reprimiendo la actividad de ELT-2. Los sitios similares a GATA también se encuentran en las proximidades de los sitios MAB-3 encontrados en otros promotores de genes de vitelogenina (MacMorris et al., 1992 MacMorris et al., 1994 Yi y Zarkower, 1999).


TRANSPORTE DE LÍPIDOS A TRAVÉS DEL ORGANISMO

Lipoproteínas

Las lipoproteínas se han estudiado extensamente en mamíferos, donde son el medio por el cual los lípidos, fosfolípidos, triglicéridos, colesterol libre, ésteres de colesterol y vitaminas liposolubles se transportan desde el intestino donde han sido absorbidos a otros tejidos (Blasiole et al. ., 2007). Las lipoproteínas también sirven para distribuir lípidos, en particular colesterol, desde el hígado a los tejidos periféricos y desde los tejidos periféricos de regreso al hígado en un proceso denominado transporte inverso de colesterol (RCT Duffy y Rader, 2009). Este proceso se ha estudiado a fondo debido a la relación entre los niveles de algunas lipoproteínas circulantes y la aterosclerosis (véase más adelante Lusis, 2000). Las lipoproteínas más conocidas en C. elegans son las partículas de yema. Los restos proteicos de las partículas de yema son vitelogeninas, proteínas conservadas que cumplen esta función tanto en invertebrados como en vertebrados. En C. elegans hay 5 genes que codifican las vitelogeninas (vit-2 para vit-6 Spieth y Blumenthal, 1985). En los mamíferos, que no proporcionan yema a los huevos, no hay vitelogeninas. Sin embargo, la apo-lipoproteína B (ApoB), un homólogo distante de las vitelogeninas (Smolenaars et al., 2007), es la proteína principal en tres tipos de partículas de lipoproteínas: quilomicrones, que se secretan en el intestino, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL ), que son secretadas por el hígado, y lipoproteínas de baja densidad (LDL), que es en lo que se convierten las VLDL después de haber liberado parte de su carga lipídica (Blasiole et al., 2007). En los vertebrados también existe otra clase de lipoproteínas, las lipoproteínas de alta densidad (HDL), que participan en RCT (Duffy y Rader, 2009). Sin embargo, los homólogos o análogos de las apo-lipoproteínas de HDL, como la apo-lipoproteína A (ApoA), aún no se han encontrado en C. elegans.

Secreción y absorción de la yema

En C. elegans, el colesterol, los ácidos grasos y posiblemente otros nutrientes se transportan a los ovocitos en desarrollo por medio de partículas de yema (Grant y Hirsh, 1999 Matyash et al., 2001 Kubagawa et al., 2006 Fig. 2). La yema se ensambla en el intestino de los hermafroditas, se secreta en la cavidad del cuerpo, se transporta a la gónada y luego los ovocitos en etapa tardía la absorben (Kimble y Sharrock, 1983). Aunque no se sabe nada sobre el proceso de ensamblaje y transporte de la yema, el proceso por el cual es absorbido por los ovocitos ha sido bien estudiado. Usando una proteína vitelogenina etiquetada con gfp, Grant y Hirsh demostraron que la yema es captada por los ovocitos por una vía conservada de endocitosis mediada por receptores. Identificaron RME-2, un miembro de la superfamilia de receptores de lipoproteínas, como el receptor de la yema. En ausencia de proteínas endocíticas y, en particular, de RME-2, la yema se acumula en la cavidad corporal en lugar de en los ovocitos. Esto da como resultado ovocitos anormales, baja producción de embriones y muy baja viabilidad de los embriones (Grant y Hirsh, 1999). Hasta hace relativamente poco tiempo, este era el único sistema de transporte de lípidos descrito en C. elegans. Sin embargo, varias observaciones insinuaron que debe haber otros sistemas de transporte. Por ejemplo, los hermafroditas son capaces de transportar colesterol antes de que se expresen las vitelogeninas y los machos no expresan vitelogeninas, pero acumulan colesterol en los espermatozoides en desarrollo (Kimble y Sharrock, 1983 Blumenthal et al., 1984 Schedin et al., 1991 Matyash et al., 2001 ).

Un modelo de las vías de transporte de lípidos en Caenorhabditis elegans y las funciones de los lípidos transportados en el intestino y en la línea germinal. Después de la absorción, los lípidos como los esteroles y los PUFA se empaquetan en partículas de lipoproteínas en el intestino. Parece haber dos tipos de partículas, partículas de yema que contienen vitelogeninas (VIT) como sus apolipoproteínas centrales y partículas similares a VLDL, que requieren la actividad de DSC-4 / MTP en el RE para su producción. Las partículas de yema se internalizan mediante el receptor RME-2. La yema es necesaria para el desarrollo de los ovocitos, y los PUFA derivados de fuentes exógenas llegan a la línea germinal por medio de la yema u otras lipoproteínas. En la línea germinal, los PUFA son la fuente de una señal que atrae los espermatozoides hacia los ovocitos. El otro tipo de partícula de lipoproteína, la partícula similar a VLDL, afecta la tasa de defecación por un mecanismo desconocido. De manera similar, las partículas similares a VLDL afectan la tasa de desarrollo de la línea germinal, aunque se desconoce el receptor de la línea germinal para estas partículas. El estrés oxidativo durante la secreción de partículas similares a VLDL puede aumentar la retención y, por lo tanto, disminuir la secreción de estas partículas. VIT, vitelogenina PUFA, ácido graso poliinsaturado ROS, especies reactivas de oxígeno VLDL, lipoproteína de muy baja densidad ER, retículo endoplásmico MTP, proteína de transferencia de triglicéridos microsomales RME-2, el receptor de la yema.

Secreción de otras lipoproteínas

Una de las actividades necesarias para producir y secretar lipoproteínas en mamíferos es la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales (MTP Shoulders y Shelness, 2005). MTP es una proteína ER que ayuda tanto a plegar la proteína ApoB muy grande como a cargarla con lípidos, antes de que viaje por el resto de la vía secretora. El homólogo de MTP en C. elegans está codificado por el gen dsc-4 (Shibata et al., 2003). DSC-4 / MTP no parece ser necesario para la producción de yema, ya que los mutantes no tienen defectos en la maduración de los ovocitos ni en la producción de embriones, a diferencia de rme-2 mutantes. Sin embargo, la interrupción de dsc-4 por mutación o ARNi tiene varios efectos fenotípicos, incluso en la tasa de desarrollo de la línea germinal y en la duración del ciclo de defecación, un ritmo de comportamiento impulsado por la fisiología del intestino (Branicky y Hekimi, 2006). Esto sugiere que se requiere DSC-4 / MTP para la secreción de un tipo de lipoproteína que es distinta de la yema y que podría parecerse a la VLDL / LDL de mamífero en el sentido de que serviría para transportar lípidos entre tejidos (Fig. 2). Sin embargo, no está claro cuál podría ser la apoproteína central de esta hipotética lipoproteína. Una posibilidad es que DSC-4 pliegue y lipida las vitelogeninas, pero en una partícula distinta de la yema. De hecho, se ha descubierto que la MTP humana puede actuar sobre un Xenopus vitelogenina (Sellers et al., 2005). Además, hemos informado anteriormente que la eliminación de ARNi de algunas vitelogeninas, en particular vit-5, tiene efectos fenotípicos en la línea germinal que son similares a los de dsc-4 mutaciones (Shibata et al., 2003). Alternativamente, como DSC-4 / MTP está relacionado evolutivamente con vitelogeninas y ApoB (Smolenaars et al., 2007), podría ser la propia apoproteína. Una forma de explorar esta posibilidad en el futuro sería determinar si dsc-4 Tiene algún papel en los hermafroditas machos y larvas, que transportan colesterol, pero no expresan vitelogeninas.

A diferencia de la partícula de yema, no se sabe nada acerca de cómo las células pueden absorber la partícula de lipoproteína dependiente de MTP. Sin embargo, además de RME-2, el gusano expresa varios receptores que se asemejan a los receptores de LDL de vertebrados, incluidos LRP-1, LRP-2 y otros. También tiene receptores que se asemejan al receptor SR-BI del eliminador de vertebrados, que también reconoce las lipoproteínas (ver más abajo). Por tanto, podría haber uno o varios receptores implicados en la vía dependiente de MTP.

Oxidación de lipoproteínas

dsc-4 se identificó originalmente como una mutación que suprime la defecación lenta y el desarrollo lento de la línea germinal de clk-1 mutantes (Branicky et al., 2001). CLK-1 es una enzima mitocondrial que es necesaria para la biosíntesis de ubiquinona y clk-1 los mutantes son auxótrofos para la ubiquinona. Varias observaciones sugieren que dsc-4 suprime clk-1 reduciendo el nivel de secreción de un tipo de lipoproteína. Por ejemplo, la reducción de los niveles de colesterol en la dieta en mamíferos reduce los niveles plasmáticos de lipoproteínas basadas en ApoB. De manera similar, la reducción de la ingesta de colesterol en las lombrices imita los efectos de dsc-4 tanto en el desarrollo de la línea germinal como en la defecación (Shibata et al., 2003 Hihi et al., 2008).

¿Por qué una reducción en la secreción de lipoproteínas suprimiría los fenotipos de clk-1 mutantes? Tanto en gusanos como en ratones, clk-1 los mutantes parecen tener un bajo estrés oxidativo citoplasmático (Kayser et al., 2004 Stepanyan et al., 2006 Yang et al., 2007 Lapointe y Hekimi, 2008). En los mamíferos, el aumento del estrés oxidativo citoplasmático por la eliminación de la superóxido dismutasa citoplasmática de CuZn SOD1 conduce a una disminución de la secreción de ApoB (Uchiyama et al., 2006), porque las partículas de lipoproteínas dañadas oxidativamente se reconocen, retienen y eliminan antes de la secreción (Brodsky y Fisher, 2008). ). En clk-1 mutantes, el aumento del estrés oxidativo al derribar SOD-1 suprime los mismos fenotipos que dsc-4 mutaciones y colesterol dietético bajo (Shibata et al., 2003). Esto conduce a un modelo en el que el bajo estrés oxidativo citoplasmático en clk-1 mutantes aumenta la secreción de lipoproteínas dependientes de DSC-4 / MTP, y cualquier intervención, por ejemplo, colesterol bajo en la dieta, función disminuida de MTP o mayor estrés oxidativo, que pueda reducir la secreción de lipoproteínas dependientes de MTP, suprime clk-1 mutantes (Fig. 3). Sin embargo, actualmente no se sabe por qué los altos niveles de lipoproteínas ralentizan el desarrollo de la línea germinal y la tasa de defecación en C. elegans.

Un modelo de los factores y procesos que inciden en las tasas de desarrollo de la línea germinal y defecación en Caenorhabditis elegans. En los vertebrados, se retienen las partículas de lipoproteínas que se oxidan durante la secreción, lo que da como resultado una secreción reducida. Planteamos la hipótesis de que el lento desarrollo de la línea germinal y la lenta tasa de defecación de clk-1 mutantes se debe a niveles anormalmente altos de lipoproteínas secretadas, causadas por una reducción en la oxidación de lipoproteínas de tipo VLDL / LDL. El modelo está respaldado por el hallazgo de que las intervenciones que disminuyen la formación de lipoproteínas o aumentan la oxidación de lipoproteínas suprimen la clk-1 fenotipos. De hecho, reducciones en el colesterol de la dieta, en la actividad de DSC-4 / MTP, que es necesaria para la formación de lipoproteínas en el RE, en la expresión de vit-5, que codifica una vitelogenina, y en la expresión de sod-1, que codifica una enzima desintoxicante de ROS citoplasmático (superóxido dismutasa), todos suprimen los fenotipos de clk-1 mutantes. Además, los fármacos que estimulan el transporte inverso de colesterol en los vertebrados y, por lo tanto, reducen el nivel de lipoproteínas de tipo VLDL / LDL, también suprimen la clk-1 fenotipos. Finalmente, en los vertebrados, los PUFA parecen reducir el nivel de secreción de VLDL al aumentar el estrés oxidativo citoplasmático. Especulamos que las alteraciones en el metabolismo de los PUFA pueden afectar la defecación a través de un mecanismo similar. VLDL, lipoproteína de muy baja densidad LDL, lipoproteína de baja densidad MTP, proteína de transferencia de triglicéridos microsomal ER, retículo endoplásmico PUFA, ácido graso poliinsaturado.

Se ha sugerido que los efectos beneficiosos para la salud de consumir AGPI omega-3 en la dieta podrían resultar en parte de una elevación del estrés oxidativo en el Golgi que resulta en una menor secreción de VLDL (Pan et al., 2004). De interés, las alteraciones en la biosíntesis de PUFA en C. elegans resultante de mutaciones en grasa-3, en elo-1, y en elo-2 también afectan el ciclo de defecación (Kniazeva et al., 2003 Watts et al., 2003). Es tentador especular que estas mutaciones actúan en parte al afectar los niveles de lipoproteínas al afectar su susceptibilidad al daño oxidativo.

A C. elegans Modelo de dislipidemia

Como se mencionó anteriormente, el metabolismo de las lipoproteínas se ha estudiado con gran detalle en mamíferos y en particular en personas debido a su importancia para la salud. De hecho, los niveles patológicamente elevados de LDL circulante (dislipidemia) son un factor de riesgo grave para el desarrollo de aterosclerosis (Lusis, 2000). Uno de los mecanismos en juego es la captación de LDL por los macrófagos en la pared de los vasos sanguíneos donde inician un proceso deletéreo que conduce a la formación de placa aterosclerótica. El proceso de captación del colesterol LDL por los macrófagos parece ser un proceso de depuración mediante el cual las partículas de LDL que han sido dañadas por oxidación u otros procesos se reconocen y eliminan de la circulación. La ingesta alta de grasas y colesterol aumenta el nivel de LDL, mientras que la reducción de la ingesta de colesterol o la reducción farmacológica de la síntesis o el transporte pueden reducir las LDL circulantes y tener efectos beneficiosos. Después de que se descubrió que la MTP era necesaria para la formación de VLDL, se han desarrollado inhibidores farmacológicos de la MTP, pero aún no han llegado al mercado como fármacos (Burnett y Watts, 2007).

El otro tipo de lipoproteína que es importante para la salud humana es el HDL. Los niveles altos de HDL ayudan a transportar el colesterol desde los tejidos periféricos al hígado, donde el HDL es captado por medio del receptor captador SR-BI, y donde el colesterol puede eliminarse mediante metabolización y excreción (Duffy y Rader, 2009). El aumento de los niveles de HDL en las personas se asocia con un mejor pronóstico de la aterosclerosis, aunque todavía se están debatiendo las mejores formas y los posibles beneficios de elevar el HDL farmacológicamente. Un tipo de fármaco que se está estudiando para este propósito son los agonistas de ciertos receptores de hormonas nucleares como LXR o PPARα que pueden alterar el equilibrio de todo el proceso para favorecer el transporte inverso del colesterol, lo que resulta en una disminución de LDL y un aumento de HDL (Duffy y Rader, 2009).

Parece haber un paralelismo entre la ruta del colesterol dietético a la aterosclerosis en las personas y la ruta del colesterol dietético a los efectos sobre la tasa de defecación y el desarrollo de la línea germinal en C. elegans (Fig. 3). Como se describió anteriormente, las alteraciones en la actividad de MTP, la captación de colesterol y la oxidación afectan los niveles de LDL en las personas y la tasa de defecación y el desarrollo de la línea germinal en C. elegans. Además, la regulación del transporte de lípidos parece estar suficientemente bien conservada entre humanos y C. elegans que los medicamentos que se han desarrollado para los seres humanos pueden actuar como supresores de la tasa de defecación lenta de clk-1 (Hihi et al., 2008). De hecho, al probar una colección de medicamentos, encontramos que los medicamentos clásicos para reducir el LDL, como las estatinas, el gemfibrozil y otros, podrían suprimir clk-1 mutantes. Además, compuestos previamente no caracterizados que se encontraron para suprimir la tasa de defecación lenta de clk-1 en una selección de compuestos de alto rendimiento se encontró posteriormente que reducen la secreción de ApoB de células humanas cultivadas y reducen los niveles de lipoproteínas plasmáticas en ratones (Hihi et al., 2008). Es interesante notar que los agonistas de LXR y PPARα, y un inhibidor de SR-BI que eleva los niveles de HDL en ratas (Nieland et al., 2007), fueron todos capaces de suprimir clk-1. Esto sugiere que también existe en los gusanos un proceso que es antagónico a la secreción de VLDL, y que es similar al transporte inverso de colesterol (Fig. 3).

Las estatinas son actualmente el principal tratamiento utilizado para reducir el colesterol en las personas. Las estatinas inhiben la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa, que convierte la HMG-CoA en mevalonato, el paso que limita la velocidad en la biosíntesis del colesterol. El mevalonato se convierte en isoprenoides que, además del colesterol, son precursores de varias moléculas importantes como el pirofosfato de farnesilo y el pirofosfato de geranilgeranilo, que prenilan proteínas, así como hemo, dolicol y ubiquinona. El tratamiento con estatinas conduce a una disminución dramática del colesterol LDL circulante en parte porque las células hepáticas reaccionan a la síntesis de colesterol endógeno disminuida regulando al alza la expresión del receptor LDL en las células hepáticas (Ma et al., 1986). Las estatinas también pueden tener efectos beneficiosos que son independientes de su efecto sobre la biosíntesis del colesterol (Albert et al., 2001 Ray y Cannon, 2004). A pesar de que C. elegans carece de las enzimas necesarias para la rama de la vía que convierte el isopreno en colesterol (Entchev y Kurzchalia, 2005), encontramos que el tratamiento con estatinas fue eficaz para suprimir clk-1 (Hihi et al., 2008). Como la HMG-CoA reductasa está presente en C. elegans, especulamos que el efecto podría deberse a algún otro proceso dependiente del mevalonato. Un estudio reciente que examina en detalle los efectos que tienen las estatinas en C. elegans (Morck et al., 2009) informa que el tratamiento con estatinas conduce a la detención de las larvas como consecuencia de una reducción en la prenilación de proteínas. También induce una respuesta de proteína desplegada en el RE, lo que sugiere que la falta de prenilación conduce a una acumulación de proteínas desplegadas. Como estos fenotipos se superponen con los producidos por la anulación del ARNi de otras enzimas implicadas en la prenilación de proteínas y pueden ser rescatados por el mevalonato, parecen estar provocados por la inhibición de la HMG-CoA reductasa. Es importante destacar que Morck et al. no observe una disminución en el contenido de lípidos. Posiblemente, entonces, el tratamiento con estatinas suprima clk-1 afectando la secreción de LDL sólo indirectamente o afectando un proceso completamente diferente.

Otras vías de transporte de lípidos

Vale la pena mencionar aquí que se han identificado vías adicionales de transporte de lípidos en contextos específicos. Por ejemplo, ndg-4, nrf-5, y nrf-6 los mutantes tienen huevos pálidos, lo que sugiere una disminución de las reservas de lípidos, son deficientes en el transporte de ácidos grasos y son resistentes a los efectos de la fluoxetina, un fármaco que inhibe la recaptación de serotonina liberada (Choy y Thomas, 1999 Choy et al., 2006 Watts y Browse, 2006). ndg-4 y nrf-6 se expresan en el intestino y codifican nuevas proteínas transmembrana multipaso nrf-5 codifica una proteína de unión a lípidos secretada similar a las proteínas de unión a éster de colesterol de mamíferos (Choy y Thomas, 1999 Choy et al., 2006). Se ha propuesto que estas proteínas actúan en una vía necesaria para el transporte de pequeñas moléculas lipofílicas como los ácidos grasos y la fluoxetina (Watts y Browse, 2006).

Los homólogos de gusanos de la proteína de tipo C de Neimann-Pick (NPC1) parecen funcionar en una vía de transporte de lípidos intracelular. NPC1 se ha implicado en el transporte de colesterol intracelular en seres humanos. Mutantes del C. elegans Homólogos de NPC1, ncr-1 y ncr-2, tienen fenotipos dauer causados ​​por una falta de producción de ácido dafachronic (Li et al., 2004 Motola et al., 2006 Patel et al., 2008 ver más abajo), y ncr-1 los mutantes son sensibles a la privación de colesterol y a la progesterona, un inhibidor del transporte de colesterol intracelular (Sym et al., 2000 Li et al., 2004). Además, recientemente se ha demostrado que NPC1 puede sustituir funcionalmente a NCR-1 en C. elegans, lo que sugiere que estas proteínas cumplen la misma función en el transporte intracelular (Smith y Levitan, 2007). Posiblemente, ncr-1 y ncr-2 actúan intracelularmente para distribuir el colesterol derivado de la lipoproteína dependiente de MTP extracelular, como sugieren los hallazgos en vertebrados (Chang et al., 2006), pero esto no ha sido probado en C. elegans.


Información del autor

Afiliaciones

Departamento de Biociencias, Universidad de Durham, Stockton Road, Durham, DH1 3LE, Reino Unido

Claire Maynard, Ian Cummins y el amplificador David Weinkove

Universidad del Medio Oeste, Illinois, Downers Grove, IL, 60515, EE. UU.

Instituto de Ciencias Biofísicas, Universidad de Durham, South Road, Durham, DH1 3LE, Reino Unido

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Contribuciones

Conceptualización: CM, DW. Metodología: CM, DW, IC. Investigación: CM, IC. Curación de datos: CM, IC. Escritura: CM, DW, IC, JG. Supervisión: DW. Adquisición de financiación: DW. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Autor correspondiente


Información de soporte

S1 Higo

Micrografías que muestran partes de los intestinos de gusanos vistos con óptica DIC (A-C) o de fluorescencia (D-F). Los animales en D-F se iluminaron con luz azul, que estimula la autofluorescencia de los LRO, un tipo de gránulo en el intestino. Los mutantes no tienen autofluorescencia reducida en comparación con el tipo salvaje. G. Gráfico que muestra la cuantificación de la autofluorescencia (en unidades arbitrarias) de los intestinos de hermafroditas adultos.

S2 Higo

Las imágenes de la izquierda muestran una superficie generada con el software correspondiente a gotitas teñidas con rojo Nilo en gusanos teñidos con el tinte en presencia de isopropanol. Los de la derecha, muestran superficies de los mismos gusanos generados con fluorescencia de fondo. Las superficies de la derecha permiten determinar los volúmenes totales de las porciones de los gusanos mostrados. Los de la izquierda permiten determinar el volumen total de las regiones teñidas con rojo Nilo dentro de estos volúmenes. Las superficies juntas se utilizaron para determinar los volúmenes combinados de gotitas teñidas con rojo Nilo por unidad de volumen. Para generar los gráficos de la Fig. 1, para cada genotipo, se analizaron de esta manera dos regiones separadas de seis gusanos adultos jóvenes que carecen de huevos.

S3 Higo

A. Micrografías de larvas de gusanos dauer teñidas con Sudan Black vistas con óptica DIC. aex-5 las larvas de dauer mutantes, como las larvas de dauer de tipo salvaje, acumulan grasa. B. Gráfico que muestra la tasa de bombeo de la faringe en animales de tipo salvaje y en y aex-5 mutantes. La tasa de bombeo faríngeo se midió como se describió anteriormente (Avery L (1993) La genética de la alimentación en Caenorhabditis elegans. Genética 133: 897 & # x02013917). C. Micrografías de fluorescencia que muestran partes del intestino de gusanos hermafroditas adultos alimentados con una mezcla de bacterias y perlas fluorescentes del tamaño de una bacteria. Las perlas se acumulan en el lumen del intestino en animales tanto de tipo salvaje como mutantes. La captación de perlas fluorescentes se analizó como se describió anteriormente (Kao G, et al. (2007) ASNA-1 regula positivamente la secreción de insulina en C. elegans y células de mamíferos. Celda 128: 577 & # x02013587).

S4 Higo

A. Micrografías de gusanos hermafroditas de 1 día de edad teñidos con Oil Red O vistos con óptica DIC. B. Micrografías de parte de los intestinos en gusanos hermafroditas de 1 día teñidos con Sudan Black y vistos con óptica DIC. En B, los contornos de los intestinos están marcados por líneas de puntos. Las flechas blancas grandes indican tinción del intestino con Sudán Negro. Un subconjunto de huevos fertilizados teñidos con Sudan Black está indicado por pequeñas flechas negras. Mientras que en N2, la tinción se observa a lo largo de todo el intestino, en el pbo, aex-4 y egl-8 mutantes, la tinción se limita a la parte anterior del intestino. Hemos notado que la tinción Sudan Black de los huevos es más intensa en cepas en las que la tinción intestinal es reducida o inexistente. C. Gráfico que muestra las proporciones normalizadas de triglicéridos totales a fosfolípidos totales. Las barras de error denotan intervalos de confianza del 95%. * denota una diferencia significativa en las medias determinadas por ANOVA unidireccional y la prueba de Fischer para la diferencia mínima significativa.

S5 Higo

A. Micrografías confocales de fluorescencia de gusanos hermafroditas adultos jóvenes fijadas con isopropanol y teñidas con rojo Nilo. B. Cuantificación de las regiones teñidas con rojo Nilo con el software Imaris. Se tomaron imágenes y se analizaron las regiones mediante los métodos descritos en la sección Materiales y métodos del texto principal, y en la leyenda de la Fig. S2. Las barras de error indican errores estándar de las medias. **** denota una diferencia significativa en las medias determinadas por ANOVA unidireccional y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (& # x003c3 = 0,05).


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