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3.7: Visualización de ejemplos - Visualización molecular de LibreFest 2000 (cambio de nuevo a Péptidos y proteínas) - Biología

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3.7: Visualización de ejemplos: visualización molecular de LibreFest 2000 (cambio de nuevo a péptidos y proteínas)

La alteración de la poliglutamina del extremo N del exón 1 de la huntingtina desencadena un mecanismo de agregación complejo

Agregado de péptidos de poliglutamina simple (polyQ) in vitro a través de una vía de crecimiento nucleada que produce directamente agregados de tipo amiloide. Mostramos aquí que la secuencia flanqueante de 17 aminoácidos (HTT NT) N-terminal al poliQ en el fragmento tóxico del exón 1 de la huntingtina imparte a este péptido un mecanismo de agregación alternativo complejo. De forma aislada, el péptido HTT NT es una espiral compacta que resiste la agregación. Cuando polyQ se fusiona con esta secuencia, induce en HTT NT, de una manera dependiente de la longitud de repetición, una conformación más extendida que mejora en gran medida su agregación en oligómeros globulares con núcleos de HTT NT y polyQ expuesto. En un segundo paso, se forma un nuevo agregado similar al amiloide con un núcleo compuesto de HTT NT y polyQ. Los resultados indican una complejidad sin precedentes en cómo la secuencia primaria controla la agregación dentro de un péptido sustancialmente desordenado y tiene implicaciones para el mecanismo molecular de la enfermedad de Huntington.


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Introducción

Dado que la resistencia a los antibióticos sigue siendo un problema de salud en aumento, la investigación de nuevos antibióticos como los péptidos antimicrobianos catiónicos (AMP) es de gran interés. A diferencia de los antibióticos no basados ​​en péptidos, que normalmente inhiben la pared celular y la biosíntesis de proteínas o la replicación del ADN, los AMP actúan predominantemente sin unirse a receptores específicos, pero interactúan directamente con la matriz lipídica de las membranas celulares bacterianas [1]. Los péptidos catiónicos se dirigen principalmente a los lípidos cargados negativamente expuestos en la superficie de las membranas bacterianas. Recientemente informamos los diferentes efectos de los péptidos derivados de lactoferricina, no acilados y N-acilados, en E. coli membranas y en modelos de liposomas compuestos de lípidos bacterianos [2]. Perturbación de la organización lipídica en liposomas compuestos por lípidos cargados negativamente como fosfatidilglicerol o total E. coli Se demostró que los lípidos y la unión a lipopolisacáridos (LPS) se potencian mediante modificaciones hidrófobas del péptido mediante N-acilación. Sin embargo, los lípidos de ion híbrido como la fosfatidilcolina o la fosfatidiletanolamina (PE) también se vieron parcialmente afectados por tales derivados peptídicos [2] [3]. La envoltura celular de las bacterias gramnegativas, como E. coli, consta de una membrana citoplasmática o interna (MI), una capa de peptidoglicano y una membrana externa (MO) [4]. El propio OM alberga proteínas, fosfolípidos y LPS [4]. Varios AMP (por ejemplo, taquiplesina, magainina y cecropina A) primero interactúan con el LPS cargado negativamente para formar un complejo [5], luego transfiéralo a través del OM al espacio periplásmico [6], y finalmente realizar su efecto letal mediante la interacción con el MI, que está compuesto principalmente por PE, PG y cardiolipina (CL) [7]. Numerosos estudios demostraron que los AMP interfieren con la integridad de las membranas bacterianas a través de diversos mecanismos (para revisiones, ver [5] [8] [9]). Los modos de acción discutidos con más frecuencia incluyen la formación de poros toroidales [10] [11] y la cobertura de la superficie de la membrana por péptidos (modelo de alfombra [12]). La capacidad de los AMP para agrupar lípidos aniónicos también se describe como un mecanismo aplicado por péptidos catiónicos [13] & # x02013 [15]. Sin embargo, el mecanismo del paso final de destrucción parece depender de la concentración y el tipo de péptido [16] así como en su estructura en presencia de membrana [17] & # x02013 [20]. Por ejemplo, se demostró que la estructura del centro antimicrobiano de lactoferricina bovina (LFcinB - RRWQWR-NH2) unida a las micelas de dodecil sulfato de sodio (SDS) es anfipática con las cadenas laterales de Trp separadas de los residuos de Arg [19]. A concentraciones por debajo de la concentración inhibitoria mínima (MIC), se observaron ampollas en la membrana y desprendimiento de MI y MO en presencia del péptido LL-37 y cecropina B, mientras que la lisis de la membrana de E. coli ocurrió en su MIC [16]. En el caso de los derivados de la lactoferricina humana (hLFcin), informamos previamente el desprendimiento de OM e IM y protuberancias en la CIM, y establecimos que este efecto de membrana severo conducía a la muerte bacteriana antes de la lisis visible de la membrana [2]. Se demostró que los fragmentos de LFcinB se localizan en el citosol de E. coli [21], donde afectaron la síntesis de proteínas y ADN [22]. Después de una hora de exposición a LFcinB en MIC, un profundo efecto sobre la morfología celular de E. coli fue observado. Las células expuestas a LFcinB se volvieron filamentosas y alargadas y no parecían dividirse de manera regular [22]. Se observaron efectos similares cuando E. coli se incubó con el antibiótico biciclomicina, que inhibe la formación del tabique y convierte las células en formas filamentosas. El antibiótico también indujo una alta ondulación y numerosas ampollas de la membrana externa [23]. Tal formación de filamentosas E. coli También se observó en el presente estudio, aunque sólo en presencia de péptidos N-acilados.

Además de las proteínas que se ha informado que son necesarias en el proceso de división celular y formación del tabique en procariotas [24] [25], también se ha investigado la participación específica de los fosfolípidos en este proceso asociado a la membrana [26] & # x02013 [29]. Por ejemplo, se propuso que la PE desempeñara un papel directo o indirecto importante en alguna etapa del ciclo de división celular, ya que E. coli mutante pss-93, que carece de PE crece como células filamentosas y aparentemente tiene defectos en la división celular [27]. En este mutante, los anillos de FtsZ se localizaron correctamente en los sitios de división pero no se contrajeron [27]. El PE es un lípido capaz de experimentar una transición de bicapa a no bicapa, una propiedad que podría ser esencial en los procesos de división celular [30] [31]. De manera similar, se informa que CL juega un papel en la división celular, p. a través de la formación de dominios de membrana que parecen participar en este proceso [28]. Sin embargo, aunque CL también puede experimentar una transición de bicapa a no bicapa en presencia de cationes divalentes, se demostró que no compensa completamente la PE en la PE que carece de mutante pss-93 [32]. Para obtener más información sobre los múltiples mecanismos de acción de los péptidos antimicrobianos, el impacto de los derivados de hLFcina no acilados y N-acilados en la morfología y la división celular de E. coli fue investigado y correlacionado con sus efectos sobre los fosfolípidos PE y CL. Los resultados indican que los péptidos N-acilados actúan mediante la interacción con estos lípidos mediante un mecanismo diferente al de su péptido original no acilado. El primero provoca una perturbación más fuerte de la organización de los lípidos de la membrana y también inhibe el proceso de división celular.


RESULTADOS

Para visualizar la dinámica de los receptores de manosa 6-fosfato en células vivas, expresamos de manera estable en células HeLa una proteína de fusión hecha de GFP fusionada a los dominios transmembrana y citoplasmático del receptor Man-6-P / IGF II (o catión-independiente receptor de manosa 6-fosfato, CI-MPR). Se seleccionó un clon representativo para estudios adicionales. Los experimentos de persecución del pulso indicaron que el nivel de expresión de GFP-CI-MPR era entre 3 y 4 veces mayor que el del CI-MPR endógeno en estas células y que las dos proteínas tenían vidas medias similares (datos no publicados). Sin embargo, la expresión de GFP-CI-MPR no afectó significativamente el tráfico de las MPR endógenas porque no pudo detectarse una clasificación errónea significativa de enzimas lisosomales (datos no publicados). Finalmente, los experimentos de captación de anticuerpos indicaron que cantidades similares (hasta un 30% en 2 h) de GFP-CI-MPR y CI-MPR endógeno pasaron a través de la superficie celular y se reciclaron de nuevo al TGN, lo que indica que ambas proteínas trafican de manera similar ( datos no publicados).

Distribución celular del GFP-CI-MPR

Un primer examen de células HeLa que expresan GFP-CI-MPR mostró que esta proteína de fusión se distribuía a diferentes compartimentos intracelulares (Figura A). La mayor parte de la proteína fluorescente (90%) estaba presente en la región perinuclear donde generalmente se encuentran el TGN y los endosomas tardíos. También se detectaron cantidades significativas de GFP-CI-MPR en pequeñas estructuras tubulares esparcidas por todo el citoplasma. Este patrón de fluorescencia no se modificó después del tratamiento con cicloheximida, lo que indica que estas pequeñas estructuras tubulares eran diferentes del retículo endoplásmico (datos no publicados). Utilizando la expresión transitoria, primero introdujimos diferentes marcadores TGN en estas células, a saber, la sialiltransferasa etiquetada con VSVG (Rabouille et al., 1995) y la glicoproteína de la envoltura gpI del virus varicela-zoster, una proteína transmembrana que circula entre el TGN, la membrana plasmática y los endosomas (Alconada et al., 1996). La mayor parte de GFP-CI-MPR presente en la región perinuclear se colocalizó casi por completo con sialiltransferasa, gpI y el CI-MPR endógeno en el nivel de fluorescencia (Figura, B – D). Curiosamente, los procesos tubulares largos marcados con GFP-CI-MPR que sobresalen de este compartimento perinuclear en varias células. Si estos elementos tubulares también podían decorarse con anticuerpos anti-gpI o anti-CI-MPR, parecían excluir la sialiltransferasa marcada con VSVG. Las criosecciones descongeladas de células HeLa que expresan GFP-CI-MPR y la sialiltransferasa marcada con VSVG también se marcaron con un anticuerpo policlonal contra GFP y un mAb contra el epítopo VSVG seguido de oro coloidal. La microscopía electrónica (Figura F) muestra que la mayor parte de GFP-CI-MPR se encontró en estructuras vesiculares tubulares que recuerdan al TGN, ubicadas en las proximidades de las pilas de Golgi que contienen la sialiltransferasa. No se detectó un marcaje significativo en los compartimentos endocíticos tardíos (datos no publicados). También internalizamos transferrina marcada con fluorescencia durante 10 min a 37 ° C para identificar los primeros compartimentos endocíticos. La transferrina internalizada se pudo detectar en aproximadamente el 30% de las estructuras periféricas marcadas con GFP (Figura E). En conjunto, estos datos indican que la mayor parte de GFP-CI-MPR se localiza en el TGN y que están presentes cantidades pequeñas pero significativas en los endosomas tempranos que contienen transferrina endocitosada, así como en estructuras periféricas desprovistas de este marcador.

Distribución de la proteína quimérica GFP-CI-MPR. (A) Las células HeLa que expresan de forma estable GFP-CI-MPR se fijaron y examinaron mediante microscopía de fluorescencia. (B y C) Células HeLa que expresan de manera estable GFP-CI-MPR (verde) y que expresan transitoriamente marcadores de la red trans-Golgi, a saber, gpI (B) o una sialiltransferasa etiquetada con epítopo VSVG (ST C). Las células se fijaron e inmunomarcaron con un mAb contra el epítopo VSVG o el mAb anti-gpI SG1 seguido de un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con Texas Red (rojo). (D) Las células HeLa que expresan GFP-CI-MPR (verde) se fijaron y marcaron con un anticuerpo policlonal contra el dominio luminal de CI-MPR (rojo). (E) A estas células también se les permitió internalizar la transferrina marcada con Alexa594 durante 10 min a 37 ° C (Tf-Alexa594 E). (B – D) La señal de GFP en la región de Golgi (E) Señal de GFP en la periferia de la célula. Las imágenes fusionadas se presentan en la columna de la derecha. Las flechas indican túbulos largos que emanan de la región perinuclear. Las puntas de flecha en E indican ejemplos de superposición entre ambas señales. Barras, 10 μm. (F) Secciones delgadas descongeladas de células HeLa que expresan de manera estable GFP-CI-MPR y que expresan transitoriamente la sialiltransferasa etiquetada con epítopo de VSVG se inmunomarcaron doblemente con un anticuerpo policlonal anti-GFP (oro coloidal de 5 nm, flecha) y un anticuerpo monoclonal anti-VSVG (Oro coloidal de 10 nm). Bar, 0,2 μm.

Dinámica de GFP-CI-MPR en el TGN

Mediante videomicroscopía de lapso de tiempo, visualizamos la dinámica de la GFP-CI-MPR ubicada en el TGN. Las Figuras A y 4A ilustran que el GFP-CI-MPR se clasifica del TGN en estructuras tubulares de diversas longitudes. Estos túbulos son elementos muy dinámicos. Con el tiempo, se alargaron con una velocidad promedio de ~ 0,9 μm / s, a veces formando estructuras ramificadas en la punta. Los fragmentos tubulares más pequeños podrían desprenderse de los túbulos en crecimiento y moverse hacia la periferia celular con una velocidad promedio de ~ 0,9 μm / s (Figura B). Estos procesos tubulares largos, que ocasionalmente alcanzaron una longitud de 10 μm, podrían desprenderse del TGN y romperse en varios fragmentos tubulares más pequeños que se movieron hacia la periferia celular con una velocidad promedio de ~ 0,9 μm / s, muy probablemente a lo largo de los microtúbulos. El análisis estadístico del estado dinámico de estos túbulos conectados a TGN (Tabla) muestra que ≈4 elementos tubulares con una longitud promedio de 6 μm podrían formarse en 2 min. La formación de túbulos, que ocurre con frecuencia en los mismos dominios restringidos del TGN, generalmente tiene lugar con un tiempo de duración promedio de 20 s.

Formación de elementos tubulares a partir del TGN. (A) Las células HeLa que expresan GFP-CI-MPR se examinaron mediante videomicroscopía. Las imágenes se tomaron a intervalos de tiempo de 2 s. Se muestran imágenes invertidas en los intervalos de tiempo indicados. Las puntas de flecha o cuadrados indican las puntas de los túbulos TGN, las flechas indican el desprendimiento de elementos tubulares largos del TGN y los puntos de rotura en elementos tubulares más pequeños. La línea corta indica un etiquetado de GFP más intenso que se mueve a lo largo del túbulo hacia la punta y luego se desprende de él. (B) Movimiento de los túbulos derivados de TGN hacia la periferia celular. Las imágenes se recogieron a intervalos de 1 s durante 1 min. Las rutas de diferentes túbulos derivados de TGN se trazaron como líneas coloreadas. Los círculos indican fusión con estructuras que contienen GFP-CI-MPR. Barras, 10 μm.

Los túbulos de TGN en células que expresan GFP-CI-MPR se analizaron en las condiciones indicadas (para más detalles, ver MATERIALES Y MÉTODOS y RESULTADOS). Los valores corresponden a medias ± desviación estándar. n en las columnas "Número de túbulos" y "Velocidad" indica el número de células y eventos de crecimiento de los túbulos, respectivamente, mientras que n en las columnas "Longitud" y "Rango de duración" indica el número de túbulos observados. Los valores marcados con un asterisco se subestiman debido a limitaciones de tiempo y tamaños de fotogramas en las diferentes condiciones de grabación. n.d., no se detectaron túbulos.

El estado dinámico de los elementos tubulares depende de varios factores (Tabla). Primero, estos eventos dependen de la temperatura. Cuando las células que expresan GFP-CI-MPR se mantuvieron a 20 ° C, una temperatura que se sabe que reduce drásticamente la clasificación de proteínas en el TGN, solo se observaron unos pocos elementos tubulares (≈1 por 2 min) con una longitud más corta (≈2,8 μm) . En esas condiciones, la velocidad de alargamiento también se redujo (0,5 µm / s). En segundo lugar, la formación de túbulos requiere la presencia de elementos del citoesqueleto. Esto podría controlarse cuando las células HeLa que expresan GFP-CI-MPR se tratan con nocodazol, un fármaco conocido por desestabilizar los microtúbulos. En las células tratadas con nocodazol, el aparato de Golgi se fragmentó rápidamente en elementos más pequeños dispersos en el citoplasma como se describió anteriormente (Scheel et al., 1990). Sin embargo, AP-1 y clatrina permanecieron en gran parte asociados a estos elementos dispersos (datos no publicados). Los túbulos marcados con GFP no pudieron crecer a partir de estos elementos de Golgi dispersos. De manera similar, la formación de túbulos se abolió casi por completo cuando las células se pretrataron con citocalasina D, un fármaco que desestabiliza la red de actina. La citocalasina D no afectó la distribución de los componentes del pelaje como AP-1 y clatrina (datos no publicados). En conjunto, estos resultados muestran que la formación de túbulos depende de la temperatura, requiere la presencia tanto de una red de microtúbulos intacta como de filamentos de actina.

La ARF-1 GTPasa, pero no las PI-3 quinasas sensibles a la wortmanina, regula la formación de túbulos derivados de TGN

Varios estudios han demostrado ahora que ARF-1 GTPasa regula la translocación en las membranas de AP-1 y GGA, dos componentes de la capa implicados en el tráfico de MPR (Stamnes y Rothman, 1993 Traub et al., 1993 Le Borgne et al., 1996 Zhu et al., 1998 Meyer et al., 2000 Nielsen et al., 2001 Puertollano et al., 2001a Takatsu et al., 2001 Zhu et al., 2001). Por lo tanto, expresamos ARF-1Q71L, un mutante alterado en la hidrólisis de GTP, en células HeLa que expresan GFP-CI-MPR utilizando un virus recombinante de vaccinia. En esas condiciones, el Golgi apareció como un grupo de elementos más pequeños marcados con GFP, aún concentrados en la región perinuclear (datos no publicados). Como se ilustra en la Tabla, no se pudo formar ningún túbulo a partir de estos compartimentos marcados con GFP, lo que indica que la hidrólisis de GTP por ARF-1 regula la formación de túbulos.

Por el contrario, la brefeldina A (BFA), que bloquea la translocación de ARF-1 en las membranas (Klausner et al., 1992) y la posterior unión de AP-1 (Robinson y Kreis, 1992 Wong y Brodsky, 1992) y GGA (Boman et al., 2000 Dell'Angelica et al., 2000 Hirst et al., 2000), da como resultado la formación de una red tubular que contiene tanto TGN como marcadores endosomales (Lippincott-Schwartz et al., 1991). Luego incubamos las células HeLa que expresan GFP-CI-MPR con BFA. La dinámica de los túbulos que emanan del TGN cambió rápidamente entre 1 y 3 min después de la adición de BFA (Figura), y después de 10 min, el tratamiento con BFA resultó en la formación de una red tubular que contenía GFP-CI-MPR y el receptor de transferrina. (datos no publicados). Los análisis estadísticos que se muestran en la Tabla indican que el número de túbulos que crecen a partir del TGN con una velocidad media de 0,9 µm / s aumentó en gran medida en las células tratadas con BFA. En promedio, las células tratadas con BFA podrían formar tres veces más túbulos que las células no tratadas. Además, estos túbulos inducidos por BFA eran más estables (tiempo de duración de 96 s) y más largos (longitud promedio de 14 μm) que en las células no tratadas porque no podían romperse en elementos más pequeños. Estos túbulos largos también mostraron una tendencia a formar estructuras ramificadas altamente dinámicas en sus puntas. La intensidad de fluorescencia de estos túbulos generalmente aumenta con el tiempo, probablemente reflejando la difusión libre de GFP-CI-MPR en estas estructuras tubulares, que de otra manera se habrían mantenido retenidas en el TGN. Como se esperaba de estudios previos (Lippincott-Schwartz et al., 1990), la formación de túbulos inducida por BFA se evitó mediante la adición de nocodazol, el agente disruptor de microtúbulos (datos no publicados). Por tanto, el tratamiento de células con BFA da como resultado una formación mejorada y una mayor estabilidad de los elementos tubulares que crecen a partir del TGN. En conjunto, estos resultados indican que la formación de túbulos derivados de TGN está controlada por la ARF-1 GTPasa. Por el contrario, el tratamiento de células que expresan GFP-CI-MPR con wortmanina, un inhibidor de PI-3-quinasas que se ha demostrado que afecta la clasificación de enzimas lisosomales en células de mamíferos (Brown et al., 1995 Davidson, 1995), no modificó significativamente la dinámica de los elementos tubulares derivados de TGN (Tabla). Por tanto, el crecimiento de los túbulos derivados de TGN probablemente no esté regulado por quinasas PI-3 sensibles a la wortmanina.

Efecto de la brefeldina A. (A) Se tomaron imágenes de células que expresan GFP-CI-MPR a intervalos de tiempo de 2 s durante el tratamiento con BFA. Se presentan imágenes invertidas en los intervalos de tiempo indicados (min: seg). El primer cuadro (0:00) muestra la celda inmediatamente después de agregar BFA. Barra, 10 μm. (B) Crecimiento de elementos tubulares en ausencia (BFA-) o presencia (BFA +) de brefeldina A. Se muestran cuatro ejemplos de túbulos TGN en crecimiento.

Destino de los túbulos derivados de TGN

Las secuencias de lapso de tiempo ilustran el movimiento saltatorio de elementos tubulares derivados de TGN marcados con fluorescencia a lo largo de los microtúbulos hacia la periferia celular (Figuras y). Sin embargo, algunos de estos procesos tubulares desprendidos a veces invierten la dirección, lo que sugiere que ocasionalmente podrían fusionarse con el TGN. Por lo tanto, examinamos con más detalle el destino de estos túbulos marcados con GFP que emanan del TGN. La figura muestra una secuencia de video tomada a tres cuadros / s de un elemento tubular que se desprende del TGN, se mueve hacia la periferia de la celda, permanece estacionario durante unos segundos y luego se mezcla con otras pequeñas estructuras periféricas también etiquetadas con GFP-CI-MPR. La estructura resultante también fue muy dinámica. Se fragmentó rápidamente en dos elementos más pequeños que se fusionaron nuevamente. Finalmente, la estructura resultante marcada con GFP sufrió una fragmentación para dar lugar a dos estructuras distintas (una vesicular y otra más tubular) que se mueven hacia diferentes direcciones. Estas estructuras periféricas etiquetadas con GFP también son elementos muy dinámicos. El registro rápido presentado en la Figura B muestra que podrían hacer contactos entre sí, probablemente reflejando eventos de fusión, antes de fragmentarse en estructuras separadas. Esta observación podría apoyar la idea de que forman una red dinámica que se fusiona y se rompe continuamente para mezclar / intercambiar su contenido. Luego preguntamos si estas estructuras periféricas marcadas con GFP estaban conectadas dinámicamente con compartimentos endocíticos. Para visualizar esto, se permitió que las células HeLa se internalizaran durante 10-15 min. Alexa594-transferrina unida a la superficie celular. La Figura C muestra elementos tubulares que contienen GFP-CI-MPR y estructuras positivas para transferrina que establecen contactos estrechos, dando lugar a estructuras en las que los dos marcadores fluorescentes se superponen. En unos pocos segundos, los dos marcadores se vuelven a segregar y cada uno se empaqueta en estructuras separadas. Por lo tanto, estos datos sugieren fuertemente que los túbulos desprendidos de TGN pueden fusionarse con estructuras periféricas que contienen GFP-CI-MPR y que estas últimas estructuras pueden intercambiar su contenido con compartimentos endocíticos que contienen transferrina internalizada.

Destino de elementos tubulares desprendidos del TGN. (A) Los elementos tubulares derivados de TGN se mezclan con estructuras periféricas marcadas con GFP. Se seleccionó un área de una célula HeLa que expresa GFP-CI-MPR como se indica en el panel izquierdo y se examinó mediante videomicroscopía. Las imágenes se tomaron a alta velocidad (3 fotogramas por segundo). Se presentan imágenes invertidas. Las secuencias de imágenes tomadas en los intervalos de tiempo indicados se muestran en B. La flecha indica un elemento tubular que se desprende de un túbulo de TGN y se fusiona con un compartimento periférico etiquetado con GFP. (B) Las estructuras periféricas marcadas con GFP son muy dinámicas. Las células se examinaron como en A. La flecha y el asterisco indican diferentes estructuras periféricas que contienen GFP-CI-MPR. (C) Mezcla de estructuras positivas para GFP-CI-MPR con compartimentos endocíticos. Las células que expresan GFP-CI-MPR se incubaron a 4 ° C con Alexa594-transferrina durante 30 min y luego se lavaron y se volvieron a incubar a 37 ° C durante 10-15 min. Las células se examinaron mediante microscopía confocal. Las imágenes se registraron cada segundo. La flecha indica la superposición entre los dos marcadores fluorescentes. Barra, 2 μm.

Dinámica de las capas AP-1

Los resultados descritos anteriormente nos llevaron a investigar si los elementos tubulares marcados con GFP que se forman en el TGN podrían contener la maquinaria necesaria para la clasificación de MPR, en particular la capa de AP-1 cuya función en el tráfico de MPR sigue sin estar clara en la actualidad.

Las células que expresan GFP-CI-MPR se marcaron primero con anticuerpos contra la subunidad γ de AP-1 o contra clatrina y se examinaron mediante microscopía confocal. La figura muestra que muchos túbulos marcados con GFP podrían decorarse con anticuerpos anti-AP-1 y anticlatrina. Sin embargo, vale la pena señalar que tanto la AP-1 como la clatrina no se distribuyen uniformemente sobre los túbulos, sino que se detectan en dominios que parecen contener cantidades más altas de GFP-CI-MPR. Como se esperaba, AP-1 también se detectó en el TGN, así como en varias de las estructuras periféricas que contienen GFP-CI-MPR (Figura, A y C). En segundo lugar, se coexpresaron una CFP-CI-MPR y una subunidad γ de AP-1 fusionada a YFP en células HeLa. Esta subunidad γ de AP-1 fusionada a YFP se incorporó a un complejo (datos no publicados) capaz de unirse a membranas in vivo (Figura A).

Distribución de componentes endógenos del pelaje. (A – C) Se fijaron células HeLa que expresaban GFP-CI-MPR (verde), se marcaron con el mAb 100.3 contra γ-adaptina (rojo AP-1 A y C) o un anticuerpo policlonal contra clatrina (rojo B), y examinado por microscopía confocal láser. (A y B) las señales en la región de Golgi (C) señales en la periferia de la célula. Tenga en cuenta que las señales de AP-1 o clatrina aparecen como puntos concentrados a lo largo de los túbulos de TGN (puntas de flecha).

Distribución en estado estacionario de la γ-adaptina marcada con YFP. (A y B) Las células HeLa que expresan tanto CFP-CI-MPR (verde) como YFP-γ-adaptina (rojo YFP-AP1) se trataron sin (A) o con BFA (B) durante 10 min y se fijaron. (C) Las células Hela que expresan YFP-γ-adapttin (verde) también se marcaron con anticuerpos contra clatrina (rojo). (D) Se permitió que las células HeLa que expresaban GFP-γ-adaptina (verde GFP-AP1) internalizaran la transferrina marcada con Alexa594 durante 10 min a 37 ° C (rojo Tf-Alexa594). Las imágenes fusionadas se presentan en la columna del medio. Barras, 10 μm

Los experimentos de transferencia Western (datos no publicados) indicaron que el AP-1 marcado con YFP se distribuyó entre un grupo citosólico (60% del total) y un grupo unido a la membrana (40% del total) como AP-1 endógeno. El YFP-AP-1 unido a las membranas se volvió soluble tras el tratamiento con BFA (Figura B). En general, este YFP-AP-1 exhibió una distribución similar sobre el TGN y las estructuras tubulares periféricas que contienen transferrina internalizada, como el AP-1 endógeno, y se detectó en dominios de membrana también recubiertos con clatrina (Figura C). En conjunto, los datos sugieren fuertemente que la etiqueta YFP en la subunidad γ de AP-1 no afecta las propiedades de unión a la membrana de AP-1 o su interacción con la clatrina. Las células HeLa que coexpresan CFP-CI-MPR e YFP-AP-1 se examinaron luego usando microscopía confocal de lapso de tiempo para investigar la dinámica de AP-1 y CI-MPR en células vivas.

Se pueden ver varios tipos de eventos como se ilustra en la Figura. Primero, pequeños elementos tubulares recubiertos con YFP-AP-1 y que contenían el CFP-CI-MPR se desprendieron del TGN y se movieron hacia la periferia celular. Esto concuerda con los resultados informados por Sorkin y colaboradores (Huang et al., 2001). Con frecuencia, la capa de YFP-AP-1 no parecía estar distribuida uniformemente a lo largo de estos elementos tubulares, sino que aparecía como parches que se movían a lo largo de los túbulos marcados con CFP-CI-MPR, como se observa en el AP-1 endógeno en células fijas (Figura A). Ocasionalmente, los túbulos derivados de TGN que contienen CFP-CI-MPR que se mueven hacia la periferia celular parecían perder su capa de YFP-AP-1. En otros casos, sin embargo, esta capa permaneció asociada a estas estructuras, que, no obstante, podrían fusionarse con estructuras tubulares periféricas. Como se informó anteriormente, las estructuras tubulares periféricas recubiertas de YFP-AP-1 que contienen CFP-CI-MPR aparecieron como estructuras altamente dinámicas. Aunque estaban parcialmente recubiertos con YFP-AP-1, estas estructuras finalmente podrían fusionarse entre sí. Sin embargo, cabe señalar que algunos elementos tubulares que se forman en el TGN parecían estar desprovistos del complejo YFP-AP-1. La cuantificación indica que el 35% de los túbulos que contienen CFP-CI-MPR carecen de YFP-AP-1 cuando se desprenden del TGN. Como se muestra en la Figura, algunos de estos túbulos podrían adquirir una capa de YFP-AP-1 mientras se mueven hacia la periferia celular. En conjunto, estos datos muestran que AP-1 está presente en estructuras donde se produce la clasificación de CI-MPR, es decir, TGN y elementos periféricos, probablemente endosomas, así como en intermedios de transporte que llevan CI-MPR.

Dinámica de YFP-AP-1 y CFP-CI-MPR. Se observaron células HeLa que expresaban tanto CFP-CI-MPR (verde) como YFP-γ-adaptina (YFP-AP1 rojo) mediante microscopía de barrido láser de lapso de tiempo. Las imágenes se tomaron cada 1,5 s con el modo multipista. Un área seleccionada indicada en A se muestra en B y C en los intervalos de tiempo indicados. Las imágenes fusionadas se muestran en la parte inferior. (B) Un elemento tubular derivado de TGN (flecha) sin ninguna capa de AP1 se mueve hacia la periferia y adquiere una capa de AP1. (C) Otro elemento tubular con una capa AP1 (flecha) se desprende del TGN y parece fusionarse con el compartimento periférico (asterisco) que se ha formado en B. Barras, 10 μm.


Materiales y métodos

Detección de virus, aislamiento de ADN y clonación.

Las partículas de virus se purificaron mediante un gradiente de cloruro de cesio para obtener ADN viral para la clonación (detallado más adelante) a partir de la combinación, ∼500-g P. monodon-tejido infectado, obtenido de Vietnam. Después de la homogeneización en PBS y la extracción inicial con cloroformo / butanol (volumen 1: 1), se obtuvo un sobrenadante transparente que contenía partículas virales mediante centrifugación a baja velocidad. El stock de virus se concentró del sobrenadante mediante ultracentrifugación a 40.000 rpm en un rotor tipo 60Ti durante 2 ha 4ºC. Los sedimentos se resuspendieron en un pequeño volumen de PBS para extracción de ADN o análisis EM. El ADN viral se extrajo mediante el kit de ácidos nucleicos virales de alta pureza (Roche) y se eluyó en 40 μM de agua destilada. El ADN aislado se sometió a extremos romos utilizando la ADN polimerasa de T4 y el fragmento Large Klenow de la ADN polimerasa I (New England Biolabs) en presencia de 33 μM de cada dNTP y se clonó en el sitio de restricción EcoRV de un vector pBluescript KS +. Comenzando con los sitios del cebador M13 del vector, la secuencia del genoma de PmMDV podría determinarse mediante la caminata del cebador. Para obtener las secuencias de los extremos, se utilizaron varias enzimas de restricción de corte ricas en GC para liberar estructuras secundarias y los fragmentos se subclonaron y secuenciaron. Dos cortadores GC demostraron ser suficientes, a saber, ApaI y HaeIII, permitiendo la clonación en los sitios ApaI y EcoRV de los vectores pBluescript KS - y KS +, respectivamente. Usamos el seguro Escherichia coli cepa (Stratagene) e incubación a 30 ° C, tanto para la construcción de clones infecciosos como para la subclonación de ITR virales.

Líneas celulares, transfección y condiciones de cultivo.

Sf9 (ATCC CRL-1711), C6 / 36 (ATCC CRL-1660) y Schneider Drosophila La línea 2 (ATCC CRL-1963) se analizó para determinar la susceptibilidad al PmMDV; sin embargo, ninguno de ellos pudo mantener la replicación del PmMDV. Para realizar estudios de transcripción y expresión se utilizó el sistema de expresión Bac-to-Bac (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), que implica la transfección de células Sf9. Los cultivos de Sf9 se mantuvieron en medio SF900 II (Gibco) en un sistema sin suero a 28 ° C. Se utilizó el reactivo Cellfectin II (Invitrogen) para la transfección de ADN con 8 x 105 células por pocillo, sembradas previamente en una placa de cultivo de seis pocillos y se incubaron durante la noche a 28ºC. El medio de cultivo se aspiró y se reemplazó por medio de siembra de medio completo para insectos de Grace suplementado con 5% de FBS (Gibco) y medio para insectos sin suplementar de Graces, mezclado en una proporción de 1: 6, respectivamente. Después de agregar la mezcla de ADN y reactivo de transfección a los pocillos, las células se incubaron durante 5 h. El medio de transfección aspirado se reemplazó con medio SF900 II suplementado con FBS al 2%. Las células se revisaron diariamente para detectar signos de efectos citopáticos (CPE) y se recogió el cultivo completo cuando el 70% de las células se desprendieron de la placa o mostraron granulación. A esto le siguieron tres ciclos de congelación-descongelación en hielo seco y se transfirieron 200 μL de este stock del paso 1 (P1) a 25 ml de cultivo de células suspendidas Sf9 fresco en matraces Erlenmeyer de policarbonato (Corning) a una densidad de 2,5 × 10 6 células / mL, para crear el stock P2, cultivado en medio SF900 II sin suero sin antibióticos.

Estudios de transcripción.

Para estudiar el transcriptoma de PmMDV, clonamos todo el genoma viral, incluidos los ITR, en un vector dual pFB, donde tanto el p10 como el PH (polihedrina) promotores habían sido eliminados previamente por lo tanto, la transcripción de todo el genoma de PmMDV podría analizarse en el recombinante Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (NPV) genome without interference of the NPV promoters. This construct was designated PmMDV-Bac-complete. The yield of DNA, however, of bacmid minipreps from the DH10Bac (Invitrogen) cells was below 500 μg/mL hence, the large ITRs were removed. This yielded over 2 mg/mL bacmid DNA of each preparation. Total RNA was extracted using the Direct-zol RNA MiniPrep Kit (Zymo Research), where the denaturation step was executed by adding TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific). RNA was treated by digestion with the TURBO DNA-free Kit (Ambion) to get rid of residual DNA contamination, as well as subjected to a control PCR for the remaining DNA fragments. Reverse transcription was performed only on entirely DNA-negative preparations using the SuperScript IV or the SuperScript III enzymes (Thermo Fisher Scientific), supplemented with random nonamers (Sigma-Aldrich). To avoid false-detection of splicing, isolated and Dnase-treated RNA was dephosphorylated by adding Antarctic phosphatase (New England Biolabs) and incubated for 30 min at 37 °C. Primers were designed at the following positions of the PmMDV genome: 1,100 nt (reverse and forward), 2,300 nt (reverse and forward), 2,564 nt (reverse and forward), 3,038 nt (reverse), and 3,511 (reverse and forward).

Anchored oligo(dT) primers were used together with the 2,300 forward and 3,511 forward primers for 3′ RACE (rapid amplification of cDNA ends). To perform 5′ RACE to map transcription start sites, we designed adaptors with the sequence of ATC​CAC​AAC​AAC​TCT​CCT​CCT​C’3. Dnase-treated RNA was subjected to dephosphorylation. by alkaline calf intestinal phosphatase (New England Biolabs) and after phenol-chloroform extraction to dephosphorization by tobacco acid pyrophosphatase (Ambion) to remove 5′ RNA caps. After the ligation of adaptors using T4 RNA ligase (New England Biolabs), reverse transcription was executed as described above. PCR was performed with the readaptor primers together with oligos 1,100 reverse and 2,564 reverse. All PCRs were performed using Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase (New England Biolabs) in a 25-μL final reaction volume, including 2 μL of purified cDNA target, 0.5 μL of both primers in 50-pmol concentration, 0.5 μL dNTP mix with 8 μmol of each nucleotide, 0.75 μL of 50 mM MgCl2 solution, and 0.25 μL of enzyme. PCR reactions were executed under a program of 5-min denaturation at 95 °C followed by 35 cycles of 30-s denaturation at 95 °C, 30-s annealing at 48 °C, and 1 or 2 min of elongation at 72 °C. The final elongation step was 8-min long at 72 °C. In case of the 5′RACE reactions, 0.5 μL of enzyme was used and the number of cycles was reduced to 25. For the 3′RACE, the reaction was supplemented with 1 μL of 50 mM MgCl2 and the annealing step was left out.

Protein Expression and Purification of VLPs.

The plasmids PmMDV-bac-complete and PmMDV-Bac-p47 were constructed by using a pFB dual vector (Invitrogen), from which both the polyhedrin (PH) and the p10 promoters had been removed, while PmMDV-Bac-ORF4 was of pFB1 backbone, driven by the PH promoter (Invitrogen). For the expression studies, the P2 baculovirus stock was used in the case of all three constructs detailed above. The P2 stocks were incubated for at least 7 d and monitored for CPE every third day. When at least 70% of the cells showed signs of CPE, the culture was collected, centrifuged at 3,000 × gramo, and the pelleted cells disrupted by three cycles of freeze–thaws on dry ice. This lysed cell pellet was then resuspended in 1 mL of 1× TNTM pH8 (50 mM Tris pH8, 100 mM NaCl, 0.2% Triton X-100, 2 mM MgCl2) and centrifuged again. Supernatant was mixed back together with the cell culture supernatant and was subjected to treatment with 250 units of Benzonase Nuclease (Sigma-Aldrich) per every 10 mL. The liquid was mixed with 1× TNET pH8 (50 mM Tris pH8, 100 mM NaCl, 0.2% Triton X-100, 1 mM EDTA) in a 1:1 ratio and concentrated on a cushion of 20% sucrose in TNET, using a type 60 Ti rotor for 3 h at 4 °C at 45,000 rpm on a Beckman Coulter S class ultracentrifuge. The pellet was resuspended in 1 mL of 1× TNTM pH8 and after overnight incubation purified on a 5 to 40% sucrose step gradient for 3 h at 4 °C at 35,000 rpm on the same instrument in a SW 41 Ti swinging bucket preparative ultracentrifuge rotor. The visible single band that formed at the 15 to 20% sucrose interface was then collected by needle puncture and a 10-mL volume syringe. In the case of constructs PmMDV-Bac-complete and PmMDV-Bac-p47, both expressed by the own promoters of PmMDV, sucrose gradient purification did not result in a visible band hence, the cushion-concentrated pellet after TNTM resuspension was purified in cesium chloride instead, dissolved in TNTM at a density of 1.38 g/cm 3 . After 24-h ultracentrifugation at 40,000 rpm at 16 °C in a SW 55 Ti rotor, the VLPs could be aspired using a needle and a 1-mL syringe. The aspirate was dialyzed into 1× HCB buffer (50 mM Hepes, 4.3 mM MgCl2 × 6H2O, 0.15 M NaCl) at pH 7.4 to remove the sucrose or the cesium chloride. As PmMDV demonstrated better stability at the higher pH of its natural extracellular environment, particles purified were dialyzed into 1× universal buffer (20 mM Hepes, 20 mM MES, 20 mM sodium acetate, 0.15 M NaCl, 3.7 mM CaCl2) at pH 8.2, which is equivalent with the pH of tropical marine water.

In Silico Analyses.

After obtaining the sequence of the ITRs and genome clones, the complete genome sequence of PmMDV was assembled using Staden package v4.11.2 (69). The assembled genome was annotated, as well as the transcripts assembled and splice sites investigated in Artemis Genome Browser by the Sanger Institute (70). Homology searching at amino acid levels was carried out two ways: To determine sequential similarity, the Blast algorithms were applied with different expectation value levels (71), whereas structural similarity was predicted by the genThreader, pDomThreader, and pGenThreader algorithms of the PSIpred web server (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) (72). To investigate the conserved motifs and domains with known homologs in the derived aa sequences, the DomPred algorithm of the PSIpred server as well as the SMART web application was used (73). Structural similarity of the resolved capsid structures with those available in the RCSB Protein Data Bank (PDB) was investigated using the DALI server (74). The tBLASTn algorithm was utilized to screen the RefSeq, Whole Genome Shotgun Contigs, High-Throughput Genomic Sequences, and Transcript Shotgun Assembly databases, targeting 5,000 hits with an expectation value of 10 (71).

For phylogenic inference, alignments, incorporating the outputs of pairwise, multiple, and structural aligners, were constructed using the Expresso algorithm of T-Coffee (75). Structural data were obtained using the PDB mode of this algorithm. The constructed alignment was further edited using Unipro Ugene (76). Model selection was executed by ProtTest v2.4, suggesting the LG + I + G + F substitution model based on both the Bayesian and Akaike information criteria (77). The distance matrix to the starting trees were constructed using the Prodist program of Phylip v3.695 with a Johns–Thorton–Taylor method and the starting tree was constructed from this using the Fitch–Margoliash method of the Fitch program with global rearrangements (78). Bayesian inference was executed by the BEAST v1.10.4 package, incorporating the predicted LG + I + G + F model, using a log-normal relaxed clock with a Yule speciation prior, throughout 50,000,000 generations (79). Convergence diagnostics were carried out using Tracer v1.7.1, which indicated the Markov-chain Monte Carlo runs to have converged (80). Phylograms were edited and displayed in the FigTree 1.4.1 program of the Beast package.

To investigate possible homologous VPs throughout the family, we used the Blast P and PSI Blast NCBI algorithms with an expect threshold of 1,000 targeting the maximum number of 5,000 sequences (81). As query, one VP-derived amino acid sequence was submitted for each recognized parvovirus species as well as one for each complete, unclassified entry. In the case of the PLA2-containing VPs, the N-terminal sequence, containing this conserved domain, was removed to avoid false hits. Screening was performed using the substitution matrices Blosum62 and PAM250. Two sequences were marked as homologs in case the search resulted in a hit. The search was limited to family Parvoviridae in order to filter out false positives.

To construct the model of the eight stranded β-barrel jellyroll core, which could be docked into the PmMDV high-resolution structure density, the I-TASSER Standalone Package v5.1 was used (82). As a template search failed to detect structural similarity with any PV capsid structure, threading was restricted to the PstDV VP monomer (PDB ID code 3N7X) and incorporated secondary structure predictions, obtained by the PSIpred server (72). To achieve the best possible fit of the core, the N- and C-terminal regions up to and following the first and last β-sheets were removed from the amino acid sequence.

Structural Studies.

The statistics for each reconstruction and refinement are given in Apéndice SI, Table S3. Three-microliter aliquots of the PmMDV VLPs without/with EDTA (∼1 mg/mL) were applied to glow-discharged C-flat holey carbon grids with a thin layer of carbon (Protochips) and vitrified using a Vitrobot Mark IV (FEI) at 95% humidity and 4 °C. The quality and suitability of the grids for cryo-EM data collection was determined by screening with a 16-megapixel charge-coupled device camera (Gatan) in a Tecnai G2 F20-TWIN transmission electron microscope operated at 200 kV under low-dose exposure (∼20 e−/Å 2 ) prior to data collection. For collecting the low-resolution native and EDTA-treated PmMDV datasets, the same microscope was used at 50 frames per 10 s using a K2 direct electron detector (DED) at the University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research electron microscopy core.

High-resolution data collection was carried out at two locations: the Florida State University (FSU) for the EDTA-treated PmMDV dataset, and the University of California, Los Angeles (UCLA) for the native dataset. At both locations, a Titan Krios electron microscope (FEI) was used, operating at 300 kV, equipped with a DE64 DED (Direct Electron Detector) at FSU and Gatan K2 DED at UCLA. At UCLA, the scope also contained a Gatan postcolumn imaging filter (Gatan) and a free-path slit width of 20 eV. Movie frames were recorded using the Leginon semiautomated application at both sites (83). At FSU, the frame rate was 50 per 10 s with ∼60 e−/Å 2 electron dosage. At UCLA, images were collected at 50 frames per 10 s with an ∼75 e−/Å 2 electron dosage. Movie frames collected at both locations, as well as for the low-resolution data set collected at the University of Florida, were aligned using the MotionCor2 application with dose weighting (84).


Systems Biology of Bacteria

Andreas Otto , . Dörte Becher , in Methods in Microbiology , 2012

1.2 Gel-based proteomics

Gel-based studies rely on two-dimensional gel electrophoresis (2DE) for the resolution of complex protein mixtures according to the pagI and molecular weight (MW) of the individual proteins in a sample ( Neidhardt, 2011 ). A major asset of gel-based proteomics is the analysis of intact protein species providing direct access to post-translational modification (PTM) events, for example, changes in MW due to proteolytic processing/degradation or direct staining of phosphorylation events by ProQ Diamond ( Hecker et al., 2008, 2009 Rabilloud et al., 2009). Differential gel image analysis of 2D gels representing different proteomic snapshots delivers relative quantitative information solely based on the staining intensities of the protein spots found on the gels. Since the invention of 2DE, this technique has matured to become an exceedingly robust and relatively cheap technique in terms of equipment needed ( Westermeier and Marouga, 2005 Rabilloud et al., 2010 ). In microbiology, 2D gel-based proteomics is commonly used for assessment of adaptation responses to nutrient shifts ( Bernhardt et al., 1999 ), antimicrobial agents ( Wenzel and Bandow, 2011 ) or environmental stresses and starvation ( Budde et al., 2006). The advantages of 2D gels for the study of microbial physiology, namely, the visualization of the majority of the proteins involved in biosynthetic pathways and the main metabolic routes, have recently been reviewed for Gram-positive bacteria ( Völker and Hecker, 2005 Hecker et al., 2008). Elucidating changes in the amounts of key effectors in metabolism and cellular structure provides valuable insights into the main processes of life and is thus essential for systems biology approaches.


Lipase activity

In order to understand HDL metabolism, it is important to be aware that lipoproteins of each class are heterogeneous particles that heavily interact with, and often change into one another. A common factor influencing lipoprotein interaction is activity of lipase proteins. Lipases are water-soluble enzymes that hydrolyze ester bonds of water-insoluble substrates such as triglycerides, phospholipids, and cholesteryl esters (32). Endothelial lipase (LIPG), hepatic lipase (LIPC), and lipoprotein lipase (LPL) are three vascular lipase proteins that migrate to endothelial cells and anchor to the distal side via interaction with heparin sulfate proteoglycans (33-35). The exposed lipase proteins remodel circulating lipoproteins, generating important effects to lipoprotein metabolism and cholesterol homeostasis. Additionally, some lipase enzymes directly interact with lipoprotein receptors, such as the LDL receptor, enhancing metabolism of circulating lipoproteins.

The majority of the catalytic activity of LIPG is devoted to hydrolysis of phospholipids of VLDL, chylomicrons, and HDL (33). Interestingly, LIPG mediated phospholipid modulation of HDL inhibits cholesterol efflux from SR-BI, but enhances efflux from ABCA1, and HDL uptake in the liver (36). In 2006, Badellino and colleagues (37) established a correlation between LIPG and atherosclerosis, which underscores the importance of SR-BI cholesterol efflux and HDL longevity in ideal HDL function.

The LIPC protein is synthesized primarily by hepatocytes, and then secreted and bound to the extracellular matrix of hepatic endothelial cells (38). LIPC has powerful VLDL and IDL triglyceride hydrolysis capabilities (39), as well as the ability to catalyze conversion of α-HDL subspecies HDL2 to denser HDL3 (40) (Figure 1). The latter functionality has direct implications to RCT because HDL2 is more likely to interact with SR-BI for cholesterol efflux or endocytosis (41). Independently of RCT, LIPC appears to demonstrate pro-atherogenic effects by increasing artery wall retention of VLDL, chylomicrons, and LDL (42). Although mutations in human LIPC are associated with variations in HDL concentration, the connection with coronary artery disease is controversial (43, 44).

LPL is a critical enzyme involved in hydrolysis of triglyceride rich lipoprotein particles in muscle, adipose, and macrophages, a process which generates free fatty acids and glycerol for energy metabolism and storage (45). Expression of LPL has been implicated in atherosclerosis, citing the increased affinity for macrophage phagocytosis (and subsequent foam cell development) on LDL and chylomicron particles after LPL mediated remodeling (46).


Conclusiones

The coral reef is a highly competitive place, where the morphologically simple and sessile corals need to be able to “fight” in parallel on different fronts – catching prey, defending themselves against predators and competing in territorial aggressive encounters with other corals. We propose a conceptual model describing some physiological and molecular features of the two different tentacle types of Galaxea fascicularis, each of which has evolved to address a different ecological challenge. Our results suggest that the CTs are adapted to catch prey using paralytic toxins and hemolysins, likely injected through the MpM nematocytes, with spirocytes helping to entangle the prey. The prey is then transferred to the mouth using cilia combined with a mobile mucus layer, and the ciliary beating is controlled by the Histamine H2 system. The ST, in contrast, actively “search” for their long-distance targets, with the tentacle length and movement (and potentially the nematocyte discharge) controlled by the opsin and allostatin sensory systems. Once the target organism is identified, the ST deliver primarily enzymatic venom through the two different MbM nematocyte types, as well as (potentially) as part of the extensive non-nematocytic mucus secretion. We speculate that the ST mucus may have a higher relative composition of membrane-bound glycoproteins (such as mucins), thus being less of a “mobile” or flowing mucus cover. This mucus might also play a role in the recognition of self vs non-self tissue. This conceptual model is based on histological observations, functional toxicity assays and analyses of differential gene expression, and provides several hypotheses that can be tested using experimental tools currently available for non-model corals such as Galaxea fascicularis.

The venom of one organism – the coral - needs to produce three different functional outcomes – paralysis, pain and tissue degradation. The need for venom to fulfill different roles is not unique to corals – scorpions, cone snails and assassin bugs, for example, each produce multiple venom cocktails that nevertheless are injected through the same venom apparatus [25, 46, 90]. In the case of the coral, the morphological distinction between the CT and ST enable each to produce a unique chemical armament. However, it is also possible that within each tentacle type there may be more than one type of venom. For example, in Hydra, different nematocytes are discharged in response to prey and to predators [29, 84]. Additionally, many cnidarians also employ toxins that are not delivered through the stinging cells [19, 64, 83]. It remains to be tested whether, within each tentacle type, different effector molecules or toxins are delivered through different cell types. If so, this “division of labor” might enable a complex chemical armament to be delivered in a target- and time-specific manner.

Our results also leave many questions open. For example, the genes more abundantly expressed in the ST are enriched with the GO terms “oxygen binding” and “heme”, yet the relationship between these molecular functions and the biology of the STs is still unclear. Genes encoding RNAase, transcription factor binding and ubiquitin-protein transferase activities are also enriched in the ST, suggesting a constant dynamic remodeling of these tentacles, a process that has yet to be studied in detail. In contrast, despite the clear differences in cilia and flagella between the two tentacle types, no differences were observed in the expression of their structural genes. It is possible that post-translational regulation plays a role in the regulation of the development and function of these organelles. Finally, approximately 34% of the genes identified in the transcriptome could not be functionally annotated, including 4% of the genes differentially expressed between the CT and the ST. This highlights the richness of molecular functions still to be discovered that allow these corals to survive and thrive on the coral reef.


DESIGN OF CHIMERIC PROTEINS WITH ENGINEERED DOMAINS AND LINKERS

Nowadays, gene fusion techniques are indispensable tools in a variety of biochemical research areas. 32 Recombinant chimeric fusion proteins are routinely constructed to increase the expression of soluble proteins and to facilitate protein purification. 32 , 83 Other engineering approaches that link two proteins or protein domains by a peptide linker include immunoassays (e.g., using chimeras between antibody fragments and proteins 84 , 85 ), selection and production of antibodies, 86 and engineering of bifunctional enzymes. 87

In the respiratory chain, electron transfer protein domains of flavodoxin and cytochrome c553 from Desulfovibrio vulgaris and the heme domain of P450 BM3 from Bacillus megaterium have been used as molecular “Lego”-type building blocks in different combinations to build artificial redox chains having variable redox potentials. 88 Multidomain bacterial protein toxins have been used in designing potential carriers for targeted delivery of biomolecules. 89 Catalytically functional flavocytochrome chimeras 90 and modified cellular signaling circuits through modular recombination of domains 91 are some of the other recently reported chimeric proteins having additional functions introduced into them through engineered domains and linkers.

The selection of the linker sequence is particularly important for the construction of functional chimeric proteins. 32 A recent study on the streptococcal protein G-Vargula luciferase chimera suggested that the spatial separation of the heterofunctional domains of a chimeric protein by an appropriate linker peptide is important for the domains to work independently. 92 In a similar study, Arai et al. designed linkers to effectively separate the two domains of a chimeric protein. 83 The authors introduced helix-forming peptide linkers, (EAAAK)norte, between two green fluorescent protein (GFP) variants. Circular dichroism (CD) spectroscopic analysis suggested that the introduced linkers form an α-helix, and that the α-helical contents increase as the lengths of the linkers increase. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) observed between the two GFP variants also suggested that the distance between the two GFP domains increases as the lengths of the linkers' increase.

It is difficult to determine the orientation of the domains and the conformation of the linker of the chimeric proteins by FRET and CD analyses alone. Therefore, a direct visualization of the three-dimensional (3D) structures in solution is desirable. To gain information about the general shape, it is not necessary to solve structures at atomic resolution. Single particle cryo-EM routinely yields low-resolution (10–30 Å) shapes of particles larger than about 300 kDa molecular weight. 93 Synchrotron X-ray small-angle scattering (SAXS) has emerged in recent years as a complementary low-resolution alternative for the investigation of smaller chimeric proteins. Computational techniques 94-97 allow one to deduce the 3D shape from one-dimensional (1D) SAXS scattering profiles that correspond to the isotropically averaged reflections of X-rays on the randomly oriented particles in solution. In Ref. 32, the shapes and sizes of the chimeric proteins, consisting of GFP variants with the helical linkers (EAAAK)norte (norte = 2–5) and flexible linkers (GGGGS)norte (norte = 3, 4), were deduced from the SAXS diffraction pattern with an ab initio modeling procedure. Figure 5 shows two of the resulting models.

Modeling of atomic structures into 3D shapes from SAXS. 32 , 97 Variants of green and blue fluorescent protein 32 connected by (a) (EAAAK)4 and (b) (EAAAK)5 linkers (cartoon representation). The SAXS envelopes and fluorophores are shown in green. The β-sheets are shown in yellow and α-helices in blue.

The SAXS experiments demonstrated that short helical linkers (norte = 2, 3) cause multimerization, while the longer linkers (norte = 4, 5) solvate monomeric chimeric proteins. 32 Also, chimeric proteins with a helical linker assumed a more elongated conformation compared to those with a flexible linker. The elongation depends on the length of the helical linker element in agreement with the molecular ruler hypothesis (Absence of Flexibility section). The chimeric proteins with the flexible linker exhibited an elongated conformation as well, rather than the most compact side-by-side conformation expected from FRET analysis. Information about the global conformation of the chimeric protein is thus necessary for optimization of the linker design. 32

Linker engineering, with the aim to control the distance, orientation, and relative motion of two functional domains, will increase in importance with increasing emphasis on the de novo design of multidomain proteins. A number of recent databases and surveys aid in the design of linkers for chimeric proteins. 73 However, despite many empirical surveys, very little is known about the structural factors that govern interdomain flexibility. Such lack of knowledge is a limiting factor in de novo chimera design. Therefore, a number of recent studies focused on the structural principles governing the domain architecture and their assembly. 98-107 The emerging concepts, along with the bioinformatics tools that attempt to detect domains and their motions from sequence information alone, 108 may one day lead to a precise de novo engineering of interdomain flexibility, thereby helping achieve the desired functioning of synthetic chimeras. In the mean time, the successful use of feedback techniques such as CD, FRET, and SAXS suggests that gene fusion applications should be accompanied by geometric analysis for appropriate biophysical validation of the linker design process.


Ver el vídeo: Visualization - Information Visualization III: Visualization Systems and Visualization Design (Septiembre 2022).


Comentarios:

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