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7.5: Endorreplicación - Biología

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La endoreplicación es la replicación del ADN durante la fase S del ciclo celular sin la posterior finalización de la mitosis y / o citocinesis. La endoreplicación ocurre en ciertos tipos de células tanto en animales como en plantas. Hay varias variaciones:

  • replicación del ADN con finalización de la mitosis, pero sin citocinesis.
  • Replicación repetida del ADN sin formar nuevos núcleos en la telofase. Esto puede resultar en:
    1. Poliploidía: los cromosomas replicados conservan su identidad individual.
    2. Polyteny: los cromosomas replicados permanecen en alineación precisa formando cromosomas "gigantes".
    3. varias condiciones intermedias entre 1 y 2

La microfotografía muestra los cromosomas politeno en una célula de la glándula salival de un Drosophila melanogaster larva. Estos cromosomas también se encuentran en otras células grandes y activas.

  • Cada uno de los 4 pares de cromosomas de Drosophila se ha sometido a 10 rondas de replicación del ADN.
  • Los homólogos maternos y paternos, así como todos sus duplicados, están alineados en registro exacto entre sí.
  • Entonces, cada cromosoma consiste en un cable que contiene 2048 hebras idénticas de ADN.
  • Son tan grandes que pueden verse durante la interfase; incluso con un microscopio óptico de baja potencia.

Función de polyteny

La respuesta probable: amplificación genética. Tener múltiples copias de genes permite un alto nivel de expresión genética; es decir, abundante transcripción y traducción para producir los productos génicos. Esto explicaría que la politenemia esté asociada con células grandes metabólicamente activas (como las glándulas salivales). Los cromosomas politénicos se subdividen en unas 5.000 bandas densas separadas por interbandas de luz. Las bandas se subdividen a su vez en:

  • bandas oscuras de heterocromatina donde el ADN está muy compactado y hay poca transcripción de genes;
  • bandas grises de eucromatina donde el ADN está más compactado y hay transcripción activa de genes.

Estas ocho microfotografías () muestran los cambios en el patrón de hinchamiento de segmentos equivalentes del cromosoma 3 en Drosophila melanogaster en el transcurso de unas 20 horas de desarrollo normal.

Tenga en cuenta que durante este período, cuando las larvas se preparaban para pupar, se formaron ciertas bocanadas, retrocedieron y volvieron a formarse. Sin embargo, el orden en que lo hicieron a menudo difirió. Por ejemplo, en la larva, la banda 62E se activa antes de 63E (c, dye), pero cuando comienza la pupación, ocurre lo contrario (g, h).

En general, las primeras bocanadas reflejan la activación de genes que codifican factores de transcripción. Estas proteínas luego se unen a los promotores de otros genes, activándolos y provocando que aparezca un soplo en sus loci.


Mecanismos celulares y moleculares que controlan la ploidía

Romain Donné,. Chantal Desdouets, en Módulo de referencia en Ciencias de la vida, 2018

Endoreplicación

La endoreplicación es un defecto específico del ciclo celular que implica un cambio del ciclo celular mitótico al endociclo (Fig.2 (A) Fox y Duronio, 2013). Esto permite la replicación del genoma nuclear sin cariocinesis ni citocinesis que conducen a la generación de contingentes poliploides mononucleados. Curiosamente, se describieron dos variantes de endorreplicación (Fig. 2 (A)): endociclado y endomitosis. Durante el endociclado, la célula alterna las fases G y S, mientras que en la endomitosis, la célula presenta características de mitosis como la condensación cromosómica, pero omite la citocinesis. Clásicamente, para llevar a cabo la alternancia de las fases G y S, hay una activación / inhibición cíclica de CDK2 / Ciclina E, y para escapar de la mitosis, se debe inhibir CDK1 / Ciclina B1 (Fox y Duronio, 2013). La endoreplicación se ha caracterizado ampliamente durante la embriogénesis en diferentes organismos. En el ratón, durante la implantación de blastocistos, las células gigantes del trofoblasto (TGC) realizan ciclos de endorreplicación y acumulan ADN hasta 1000 conjuntos de cromosomas. Esta endorreplicación se desencadena por la inhibición de la actividad de CDK1 mediada por p57 (CKI) (Ullah et al., 2008). Los megacariocitos (MKC) son otro ejemplo de poliploidización regulada por el desarrollo en mamíferos. Mientras que los TGC omiten la mitosis, los MKC se vuelven poliploides por endomitosis (omiten una parte de la anafase y la telofase). Se ha demostrado que la regulación a la baja del factor de intercambio de guanidina ECT2 previene la activación de RhoA y la ingresión del surco de escisión, lo que se combina con una disminución en la expresión de ciclina B1 (Gao et al., 2012 Nguyen y Ravid, 2010). Después de muchas rondas de este defecto del ciclo celular, MKC alcanza un estado poliploide (con cromosomas 128n) importante para la formación de plaquetas (Raslova et al., 2007). Curiosamente, los ciclos de endorreplicación también se encuentran en entornos patológicos bajo la activación de la respuesta al daño del ADN (DDR) que bloquea las células en G2 / M y protege el tejido de la proliferación de células dañadas que contienen inestabilidades cromosómicas. Este proceso se ha descrito en trastornos hepáticos durante la división de hepatocitos esteatóticos (Gentric et al., 2015). Otros estudios han demostrado que la endorreplicación puede promover la aneuploidía y la tumorigénesis. La crisis de los telómeros en los fibroblastos conduce al acortamiento de los telómeros y al fallo de la mitosis. Posteriormente, la reactivación de la telomerasa induce la expansión de los clones y su transformación (Davoli y de Lange, 2012).


Química y Biología (Curso 5-7)

Los Requisitos del Instituto General incluyen un Requisito de Comunicación que está integrado tanto en el Requisito HASS como en los requisitos de cada especialización; consulte los detalles a continuación.

Resumen de los requisitos de la asignatura Asignaturas
Requisito científico 6
Requisito de Humanidades, Artes y Ciencias Sociales (HASS) Al menos dos de estas materias deben ser designadas como de comunicación intensiva (CI-H) para cumplir con el Requisito de Comunicación. 8
Requisito de asignaturas optativas restringidas en ciencia y tecnología (REST) ​​[se puede cumplir con 5.12 y 7.03 en el programa departamental] 2
Requisito de laboratorio (12 unidades) [se puede satisfacer con 7.003 [J] o la combinación de 5.351, 5.352 y 5.353 en el Programa Departamental] 1
Total de asignaturas de GIR requeridas para el título de SB 17
Requisito de educación física
Requisito de natación, más cuatro cursos de educación física para ocho puntos.

Programa departamental

Elija al menos dos materias en la especialidad que estén designadas como intensivas en comunicación (CI-M) para cumplir con el Requisito de comunicación.


Resultados y discusión

La red reguladora global inferida para HalobacteriumNRC-1

Aplicamos nuestro método a la arqueona halófila. Halobacterium NRC-1. los Halobacterium El genoma contiene 2.404 genes no redundantes, de los cuales 124 están anotados como TF conocidos o putativos [28, 29]. El procedimiento de biclustering e inferencia de red se realizó en un conjunto de datos generado recientemente que contiene 268 mediciones de microarrays de ARNm de este arqueón bajo una amplia gama de perturbaciones genéticas y ambientales ('Kaur A, Pan M, Meislin M, El-Geweley R, Baliga NS' y 'Whitehead K, Kish A, Pan M, Kaur A, King N, Hohmann L, Diruggiero J, Baliga NS', comunicaciones personales), [30, 31]. Varios TF no cambian significativamente en sus niveles de expresión en el conjunto de datos de los 124 TF identificados, 100 exhibieron un cambio significativo en los niveles de expresión en todo el conjunto de datos y los 24 TF restantes se excluyeron del conjunto de influencias potenciales (ver Materiales y métodos, a continuación) [32]. Los TF fuertemente correlacionados (aquellos con una correlación superior a 0,85) se agruparon más, lo que arrojó 72 reguladores (algunos representan múltiples reguladores correlacionados). A estos 72 reguladores potenciales se agregaron 10 factores ambientales para un total de 82 posibles predictores para los 1.934 genes con señal significativa en el conjunto de datos. Además de este conjunto de datos principal, se utilizaron 24 nuevos experimentos (recopilados después del ajuste del modelo) para la estimación del error independiente posterior al procedimiento de inferencia de red.

El método cMonkey (Reiss DJ, Baliga NS, Bonneau R, datos no publicados) se aplicó a este conjunto de datos (268 condiciones originales) a genes y condiciones bicluster, sobre la base de los datos de expresión génica, una red de asociaciones funcionales y el ocurrencia y detección de cis-motivos reguladores que actúan en secuencias secuencia arriba bicluster. Biclustering resultó en 300 biclusters que cubrían 1.775 genes. CMonkey determinó que 159 genes adicionales, que exhibieron un cambio significativo en relación con la referencia común en todo el conjunto de datos, tenían patrones de expresión únicos y, por lo tanto, no se incluyeron en biclusters. Estos 159 genes se infirieron individualmente.

A continuación, se realizó el procedimiento de inferencia de la red reguladora en estos 300 biclusters y 159 genes individuales, lo que dio como resultado una red que contiene 1.431 influencias reguladoras (bordes de la red) de intensidad variable. De estas influencias reguladoras, 495 representan interacciones entre dos TF o entre un TF y un factor ambiental. Seleccionamos el modelo nulo para 21 biclusters (no se encontraron influencias o solo se encontraron influencias reguladoras débiles, como se describe en Materiales y métodos, a continuación), lo que indica que estamos excluyendo estrictamente genes y biclusters subdeterminados de nuestro modelo de red. La relación entre los puntos de datos y los parámetros estimados es de aproximadamente 67 (una constante de tiempo más tres influencias reguladoras, en promedio, de 268 condiciones). Nuestro conjunto de datos no está completo con respecto al repertorio fisiológico y ambiental completo para Halobacterium NRC-1, y varios TF tienen su actividad modulada por factores no observados (por ejemplo, modificaciones postraduccionales y la unión de ligandos no observados), por lo tanto, las relaciones reguladoras para muchos genes no son visibles, dado el conjunto de datos actual. La figura 1 muestra la red resultante para Halobacterium NRC-1 en Cytoscape, disponible como inicio web de Cytoscape / Gaggle [33, 34].

La red reguladora inferida de Halobacterium NRC-1, visualizado usando Cytoscape y Gaggle. (a) La red reguladora inferida completa. Los reguladores se indican como círculos, con bordes negros no dirigidos a biclusters (rectángulos) de los que son miembros. Las flechas verdes y rojas representan la represión (β & lt 0) y activación (β & gt 0) bordes, respectivamente. El grosor de los bordes de regulación es proporcional a la resistencia del borde según lo determinado por el Inferelador (β para ese borde). Las interacciones se muestran como triángulos conectados a reguladores por bordes azules. Influencias débiles (|β| & lt 0.1) no se muestran. (B) Ejemplo de regulación de Bicluster 76. Los cuatro factores de transcripción (TF) sirR, kaiC, VNG1405C, y VNG2476C fueron seleccionados por el Inferelador como los reguladores más probables de los genes en bicluster 76 del conjunto de todos los (82) reguladores candidatos. Los pesos relativos, β, por el cual se predice que los reguladores se combinan para determinar el nivel de expresión de los genes del bicluster 76, se indican junto a cada borde de regulación. Los TF VNG2476C y kaiC se combinan en una relación Y lógica. phoU y prp1 son TF que pertenecen a bicluster 76.

En la Figura 1b se muestra un ejemplo de la regulación prevista de un solo bicluster, bicluster 76 (que contiene genes implicados en el transporte de Fe y Mn, Tabla 1). Entre los 82 posibles reguladores, cuatro fueron seleccionados como los reguladores más probables de este bicluster. La función aprendida de estos TF permite la predicción de los niveles de expresión del gen bicluster 76 en condiciones novedosas, incluidas las perturbaciones genéticas (por ejemplo, para predecir los niveles de expresión en un kaiC deformación knockout, la influencia de kaiC puede eliminarse de la ecuación estableciendo su peso en cero). Discutimos el modelo regulatorio previsto para bicluster 76 más adelante.

Evaluamos la capacidad del modelo de red inferida para predecir el estado de expresión de Halobacterium NRC-1 sobre una base de todo el genoma. Para cada condición experimental, hicimos predicciones de cada estado biclúster, basándonos en los niveles de reguladores y factores ambientales, y comparamos los valores de expresión pronosticados con el estado medido correspondiente (usando la desviación cuadrática media [RMSD] para evaluar la diferencia o error, como se describe en Materiales y métodos, a continuación). De esta manera, evaluamos el rendimiento predictivo de la red inferida tanto en experimentos en el conjunto de datos de entrenamiento como en los 24 experimentos en el conjunto de prueba independiente (al que nos referimos como el conjunto de datos recién recopilado). El nivel de expresión de un bicluster se predice a partir del nivel de TF y los factores ambientales que lo influyen en la red, en el punto de tiempo anterior (para condiciones de curso temporal) o la condición actual (para condiciones de estado estacionario). Las estimaciones de error para los 300 biclusters y 159 genes únicos se muestran en las Figuras 2 y 3. Para los biclusters, el error medio de 0,37 es significativamente menor que el rango de razones observado en los datos (porque todos los biclusters se normalizaron para tener variaciones de aproximadamente 1.0 antes del ajuste del modelo), lo que indica que el estado de expresión global general está bien predicho. Nuestro poder predictivo sobre los nuevos datos (Figuras 2 y 3, paneles de la derecha) es similar al de los datos de entrenamiento (el RMS medio sobre el conjunto de entrenamiento está dentro de 1 desviación estándar del RMS medio sobre los nuevos datos), lo que indica que nuestro El procedimiento consiste en imponer una parsimonia razonable a los modelos (utilizando la contracción L1 junto con una validación cruzada de diez veces [CV], como se describe en Materiales y métodos, a continuación) y estimar con precisión el grado en el que podemos predecir los niveles de expresión de biclusters en función de Niveles de FT y factores ambientales.

Poder predictivo de la red inferida en biclusters. (a) El error de la desviación cuadrática media (RMSD) de la respuesta prevista en comparación con la respuesta real para los 300 biclusters previstos evaluados en las 268 condiciones del conjunto de entrenamiento. (B) El error RMSD de los mismos 300 biclusters evaluados en nuevos datos (24 condiciones) recopilados después del ajuste del modelo / construcción de la red.

Poder predictivo sobre genes con perfiles de expresión únicos. Histogramas de la desviación cuadrática media (RMSD) de la respuesta pronosticada frente a la respuesta medida, como se calcula en la Figura 2. (a) El error RMSD de respuesta predicha a verdadera para los 159 genes que cMonkey identificó como con patrones de expresión únicos y, por lo tanto, no se incluyeron en ningún bicluster. (B) El mismo error sobre los nuevos datos recopilados después del ajuste del modelo / construcción de la red para estos 159 aislamientos.

Aunque la mayoría de biclusters tienen nuevos valores de RMS de datos que coinciden con los valores de RMS del conjunto de entrenamiento, también hay nueve biclusters (biclusters 1, 37, 77, 82, 99, 137, 161, 165 y 180) con valores de RMS significativamente más altos. en los nuevos datos que en los de entrenamiento. No pudimos identificar ninguna característica de estos biclusters periféricos (coherencia de bicluster, tamaño de bicluster, variación dentro y fuera de la muestra para los biclusters, etc.) que los distinga de otros biclusters. También investigamos el rendimiento predictivo de los 159 genes que cMonkey no incluyó en biclusters. Encontramos un buen rendimiento predictivo (sobre los nuevos datos y sobre los datos de entrenamiento) para aproximadamente la mitad de estos genes, una tasa de éxito mucho menor que la observada para los genes representados por biclusters. Hay varias explicaciones posibles para esta capacidad disminuida para predecir genes que también eluden el biclustering. El promedio de los niveles de expresión sobre genes que están co-regulados dentro de biclusters puede considerarse como un promedio de señal y, por lo tanto, los genes individuales son más propensos a errores sistemáticos y aleatorios que los niveles de expresión bicluster. Otra posible explicación es que estos genes esquivos están bajo la influencia de TF que interactúan con factores no observados, como los metabolitos. También hay alrededor de cinco condiciones que no podemos predecir bien en relación con las otras 264 condiciones (valores RMS grandes en el entrenamiento y nuevos datos en las Figuras 2 y 3). No es sorprendente que estas cinco condiciones estén situadas directamente después de grandes perturbaciones en series de tiempo, cuando el sistema fluctúa drásticamente a medida que restablece la estasis.

También realizamos varias pruebas para determinar qué tan bien se desempeñó la formulación de nuestro modelo y el procedimiento de ajuste en comparación con tres formulaciones simplificadas, como se describe en detalle en el archivo de datos adicional 1. Brevemente, estas pruebas adicionales muestran que nuestra formulación actual para el modelado temporal es esencial para el rendimiento de este procedimiento (RMSD media sin modelado temporal 0,40 significancia de la comparación con el modelo completo PAG & lt 10-10, por emparejamiento t test) y produce modelos significativamente más parsimoniosos. También muestran que los modelos restringidos a un solo predictor por bicluster tienen un rendimiento significativamente peor que los nuevos datos (RMSD media con un solo predictor por bicluster 0,43 PAG & lt 10-16). Finalmente, las pruebas adicionales muestran que nuestra inclusión de interacciones en la formulación del modelo actual mejora el poder predictivo (RMSD media sin interacciones 0.41, PAG & lt 0,03).

Control homeostático de procesos biológicos clave por parte de los previamente no caracterizados trhfamilia

los trh familia de reguladores en Halobacterium (incluso trh1 para trh7) son miembros de la LrpA/AsnC familia, reguladores que están ampliamente distribuidos entre especies de bacterias y arqueas [35]. Su papel específico en la regulación de Halobacterium NRC-1 genes era, antes de este estudio, desconocido. Predecimos que cuatro de las proteínas trh juegan un papel importante en la coordinación de la expresión de diversos procesos celulares con procesos de transporte competidores. La Figura 4 muestra un diseño de Cytoscape de la subred que rodea trh3, trh4, trh5, y trh7. Existe una similitud significativa en las funciones representadas por los biclusters regulados por cada una de las proteínas trh, lo que da alguna indicación de que las influencias aprendidas tienen importancia biológica. Además, cada proteína trh regula un conjunto único de biclusters. Usando la subred predicha podemos formar hipótesis altamente dirigidas en cuanto a la regulación que media el equilibrio homeostático de diversas funciones en la célula. Nuestra predicción para trh3, por ejemplo, es que es un represor de los sistemas de captación de fosfatos y aminoácidos y que está corregulado con (y por tanto un posible activador de) diversos procesos metabólicos que implican el consumo de fosfato. Trh3 por lo tanto parece ser clave para Halobacterium NRC-1 homeostasis del fosfato (un factor limitante en la Halobacterium entorno natural). Se pueden extraer declaraciones / hipótesis similares de la red aprendida para otros reguladores de función previamente desconocida de esta manera, la red representa un primer paso para completar la anotación del componente regulador del proteoma. La Figura 5 muestra el perfil de expresión predicho para 12 de los biclusters mostrados en la Figura 4.

Regulación / homeostasis del proceso central, incluido el proceso de transporte diverso, por trh3, trh4, trh5, trh7, tbpD, y kaiC. Los biclusters (rectángulos con altura proporcional al número de genes en el bicluster y ancho proporcional al número de condiciones incluidas en el bicluster) se colorean por función, como se indica en la leyenda. En los casos en los que hay varias funciones en un solo bicluster, se enumeran las funciones más representadas.

Rendimiento predictivo en biclusters que representan procesos clave. Cada gráfico muestra un biclúster con un tema funcional dominante de la Figura 4. La línea roja indica el perfil de expresión medido y la línea azul muestra el perfil predicho por el modelo de red. Las condiciones en la región más a la izquierda de cada gráfico se incluyeron en el bicluster, las regiones del medio muestran las condiciones excluidas del bicluster y la región más a la derecha de cada gráfico corresponde a las 24 mediciones que no formaban parte del conjunto de datos original. Las dos regiones más a la derecha de cada gráfico, por lo tanto, demuestran poder predictivo sobre condiciones que no están en el conjunto de entrenamiento. Los parámetros del modelo de estimación se realizaron utilizando solo condiciones verdes / más a la izquierda.

Verificación experimental de influencias regulatorias

A continuación, describimos brevemente tres casos en los que las influencias reguladoras previstas fueron respaldadas por una mayor experimentación.

VNG1179Cactiva una ATPasa de tipo P1 transportadora de Cu

Predecimos que el bicluster 254, que contiene una ATPasa de tipo P1 transportadora de Cu putativo, está regulado por un grupo de TF correlacionados que contienen VNG1179C y VNG6193H - dos reguladores con dominios de unión a metales putativos [28]. Estos reguladores se convirtieron en objetivos atractivos para una mayor investigación. El Inferenciador predice que VNG1179C y / o VNG6193H son activadores transcripcionales de yvgX (miembro de bicluster 254). VNG1179C es un Lrp/AsnC regulador familiar que también contiene un dominio BASURA de unión a metales [35, 36]. Cepas con deleciones de un solo gen en el marco de ambos VNG1179C y yvgX (uno de los objetivos propuestos y transportador de cobre conocido) resultó en un crecimiento similar disminuido en presencia de Cu. Además, el análisis reciente de microarrays confirmó que, a diferencia del tipo salvaje, yvgX Los niveles de transcripción no están regulados al alza por Cu en el VNG1179C cepa eliminada. Esta falta de activación de yvgX en el VNG1179C La cepa de deleción dio como resultado un crecimiento deficiente en presencia de Cu para las cepas con una deleción en cada uno de los dos genes (Kaur A, Pan M, Meislin M, El-Geweley R, Baliga NS, comunicación personal).

SirRregula los procesos clave de transporte

SirR fue descrito previamente como un regulador involucrado en la resistencia a la falta de hierro en Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus. SirR es posiblemente un regulador transcripcional dependiente de Mn y Fe en varios sistemas microbianos y un homólogo de dtxR [37]. Hay un fuerte homólogo de S. epidermidis sirR en el Halobacterium genoma, pero el papel de esta proteína en el Halobacterium No se ha determinado el circuito regulador. Predijimos que sirR y kaiC son reguladores centrales, involucrados en la regulación de biclusters asociados con el transporte de Mn / Fe, como bicluster 76 (Figura 1b). En este bicluster se incluyen tres genes, a saber zurA, zurM y ycdH, que juntos codifican un transportador ABC específico de Mn / Fe putativo, consistente con la observación reciente de que sirR es necesario para la supervivencia del estrés inducido por metales (Kaur A, Pan M, Meislin M, El-Geweley R, Baliga NS, comunicación personal). La Figura 6 muestra los niveles de expresión pronosticados y medidos para bicluster 76 en función de los reguladores inferidos (sirR, kaiC) para todas las condiciones, incluidas las series de tiempo, las medidas de equilibrio, los nocauts y los nuevos datos. Tenga en cuenta que las influencias regulatorias para este bicluster se infirieron solo utilizando las 189 condiciones (de un total de 268 posibles) que cMono incluidas en este bicluster, las condiciones excluidas eran de baja varianza o no mostraban una expresión coherente para los genes de este bicluster. SirR Los perfiles de ARNm de las 268 condiciones experimentales originales se correlacionan positivamente con los cambios en el nivel de transcripción en estos tres genes. Sin embargo, al eliminar SirR, los niveles de ARNm de estos tres genes aumentaron en presencia de Mn, lo que sugiere que SirR funciona como represor en presencia de Mn, en aparente contraste con nuestra predicción. De hecho, se ha observado un papel dual en la regulación de al menos una proteína de la familia de reguladores a la que SirR pertenece, que funciona como activador y represor en condiciones de Mn bajo y alto, respectivamente [38]. Aunque se necesita más investigación, The Inferelator identificó con éxito parte de esta relación regulatoria y la combinación correcta de regulador y objetivo.

Respuesta medida y prevista para procesos de transporte (bicluster 76). El rojo muestra la respuesta medida del bicluster 76 en 277 condiciones (niveles de expresión de ARNm medidos como se describe en Materiales y métodos, en el texto). Bicluster 76 representa los procesos de transporte controlados por los reguladores KaiC y SirR (Figura 1b). El azul muestra el valor predicho por la red de influencia del regulador. Condiciones en (a) corresponden a las condiciones incluidas en bicluster 76 (condiciones para las que estos genes tienen una alta varianza y son coherentes). (B) Muestra condiciones fuera del bicluster pero en el conjunto de datos original / de entrenamiento. (Estas regiones no se utilizaron para ajustar el modelo para bicluster 76, porque los modelos se ajustaron solo en condiciones de bicluster). (C) Contiene condiciones / mediciones que no formaban parte del conjunto de datos original y, por lo tanto, no estaban presentes cuando se llevaron a cabo el biclustering y los procedimientos de ajuste de modelo / inferencia de red posteriores. Las regiones B y C demuestran un poder predictivo fuera de la muestra.

TfbFactiva el componente proteico del ribosoma

Halobacterium NRC-1 tiene múltiples copias de componentes clave de su maquinaria de transcripción general (TfbA para TfbG y TbpA para TbpF). Los estudios en curso están dirigidos a determinar el grado en que estas múltiples copias de los TF generales son responsables de la regulación diferencial de los procesos celulares (Facciotti MT, Bonneau R, Reiss D, Vuthoori M, Pan M, Kaur A, Schmidt A, Whitehead K, Shannon P, Dannahoe S, comunicación personal), [39]. Predecimos que TfbF es un activador de genes que codifican proteínas ribosómicas. Los genes que codifican la proteína ribosómica se distribuyen en siete biclusters, se prevé que los siete estén controlados por TfbF. Esta predicción se verificó midiendo las interacciones proteína-ADN para TfbF por análisis de chips de chips como parte de un amplio estudio de sistemas de Tfb y Tbp patrones de unión en todo el genoma (Facciotti MT, Bonneau R, Reiss D, Vuthoori M, Pan M, Kaur A, Schmidt A, Whitehead K, Shannon P, Dannahoe S, comunicación personal).


DISCUSIÓN

Nuestros resultados muestran que la endorreplicación transitoria genera células poliploides (≥8C) que pueden volver a la división propensa a errores, lo que puede causar una inestabilidad grave del genoma al generar células aneuploides proliferativas. Aunque las CEI poliploides ensamblan husos multipolares que comienzan a experimentar anafase multipolar durante la RTM, con frecuencia hay cromosomas rezagados en el surco citocinético, lo que da como resultado una falla en la citocinesis. Esto puede dar lugar a dos células hijas con contenidos genómicos muy diferentes. Las iEC que regresaban a la mitosis tenían niveles más bajos de HSET, y su sobreexpresión rescató parcialmente la multipolaridad del huso en la división de las iEC, en consonancia con su papel conocido en la agrupación del centrosoma. Sin embargo, la expresión de HSET condujo a solo una reducción modesta en la CIN, lo que sugiere que genes adicionales regulados a la baja en las iEC probablemente contribuyan a la CIN durante la RTM. Tomados en conjunto, nuestros estudios proporcionan un modelo para comprender los mecanismos por los cuales los ciclos celulares alternativos conducen al desarrollo de poliploidía y cómo estas divisiones propensas a errores finalmente conducen a la inestabilidad genómica.

La perturbación del ciclo celular puede inducir poliploidía

Las respuestas de las células a la perturbación del ciclo celular son muy heterogéneas, incluida la detención del ciclo celular, el deslizamiento mitótico o la muerte celular. Por ejemplo, los agentes que dañan el ADN, los inhibidores de la quinasa del ciclo celular y los agentes antimicrotúbulos pueden inducir poliploidización o deslizamiento mitótico (Roberts et al., 1990 Verdoodt et al., 1999 Erenpreisa et al., 2005, 2008 Puig et al., 2008). De nuestro trabajo se desprende claramente que las células pueden inducirse a ciclos celulares variantes, lo que da como resultado una ploidía alta con un nivel bajo de muerte celular. Estudios recientes indican que la insuficiencia mitótica suele ir seguida de una detención del ciclo celular dependiente de p53 o muerte celular a través de la activación de la vía del hipopótamo (Ganem y Pellman, 2012 Ganem et al., 2014). Por el contrario, encontramos que las células p53 + HCT-116 se sometieron a endorreplicación con el tratamiento con RO3306 o SU6656 en lugar de detenerse en un estado tetraploide, lo que indica que la endorreplicación puede ser una alternativa mediante la cual las células evitan la catástrofe mitótica. Además, nuestros datos demuestran que la mayor parte de la muerte celular se produce después de que las CEI vuelven a la mitosis en lugar del tratamiento inicial con el fármaco. Las células de endociclado pueden tener un umbral de apoptosis más alto (Zheng et al., 2012) y toleran altos niveles de daño en el ADN (Ullah et al., 2008, 2011 Davoli y de Lange, 2011). En Drosophila, las células de endociclado inducido y de origen natural no apoptose en respuesta al estrés genotóxico, porque reprimen la vía p53 (Mehrotra et al., 2008 Hassel et al., 2014 Zhang et al., 2014). Además, la red de respuesta al daño del ADN está regulada al alza para prevenir las respuestas al daño en fibroblastos embrionarios de ratón endorreplicantes inducidos, lo que también puede explicar cómo las células de endociclado pueden tener un umbral apoptótico más alto (Zheng et al., 2012). Juntos, estos estudios apoyan la idea de que los ciclos celulares variantes, como los que ocurren con la endorreplicación, pueden ser un factor importante pero subestimado para la supervivencia celular y la inestabilidad genómica.

Una pregunta sin respuesta es cómo las células eligen someterse al endociclo frente a la endomitosis. En algunos casos, esta es una opción de desarrollo. Por ejemplo, las células gigantes del trofoblasto en mamíferos y las células de las glándulas salivales en Drosophila Ambos reprimen fuertemente la función CDK1 y tienen oscilaciones de Cdk2 / ciclina E alternando con APC / Cdh1 (Palazón et al., 1998 Hattori et al., 2000 Edgar y Orr-Weaver, 2001). Por el contrario, los megacariocitos se vuelven poliploides a través de la endomitosis (Jackson, 1990) debido, al menos en parte, a niveles reducidos de Cdk1 / ciclina B (Ravid et al., 2002). Nuestro hallazgo de que altas concentraciones de RO3306 indujeron endociclos mientras que concentraciones más bajas indujeron endomitosis sugiere que Cdk1 es un mediador importante en la elección entre endociclo y endomitosis. Juntos, estos resultados apoyan la idea de que el endociclo y la endomitosis son variaciones en un continuo con diferentes grados de represión de los osciladores de quinasa mitótica.

La regulación a la baja de los jugadores mitóticos clave puede conducir a una segregación cromosómica defectuosa y a una citocinesis

La kinesina-14 HSET es esencial para la agrupación del centrosoma en células con amplificación del centrosoma (Kwon et al., 2008). En las células tetraploides, la agrupación de centrosomas en dos polos conduce a defectos en la división celular debido a uniones cinetocoro-microtúbulos inadecuadas que se forman en los husos multipolares transitorios (Ganem et al., 2009). Nuestros datos apoyan la idea de que las células poliploides tienen niveles aumentados de multipolaridad y una falla en la agrupación del centrosoma en comparación con las células tetraploides en división, lo que potencialmente amplifica la extensión de las conexiones defectuosas cinetocoro-microtúbulos (Fujiwara et al., 2005). De acuerdo con esta idea, encontramos que HSET estaba regulado a la baja en iEC y que la sobreexpresión de HSET reducía el grado de multipolaridad del huso. Además, nuestras observaciones sugieren que el aumento de los cinetocoros mal adheridos en las células poliploides puede conducir a un aumento de los cromosomas rezagados que dan como resultado un fallo de la citocinesis. De hecho, la kinesina-14 ncd fue uno de los genes regulados a la baja en Drosophila endociclado de células, y nuestros hallazgos actuales apoyan la idea de que la kinesina-14 humana, HSET, también puede ser un jugador importante en la fidelidad de la segregación cromosómica durante la RTM de células poliploides. Estudios anteriores también mostraron que un grupo similar de genes mitóticos está regulado negativamente en Drosophila y células de endociclado de ratón (Maqbool et al., 2010 Chen et al., 2012 Pandit et al., 2012). Un modelo atractivo es que este nivel más bajo de expresión génica mitótica contribuye a los múltiples defectos en la formación del huso, la segregación cromosómica y la citocinesis cuando las células endorreplicantes vuelven a la mitosis.

Una observación interesante es que tras la RTM, las iEC vuelven a un número cromosómico similar al de la población inicial inicial, lo que sugiere que estas células poliploides experimentan divisiones que reducen el contenido del genoma. Tales divisiones genómicas reductoras se describieron por primera vez en fibroblastos tetraploides y posteriormente se han encontrado en varios tipos de células (Duncan et al., 2010 Fox et al., 2010 Hassel et al., 2014 Schoenfelder et al., 2014). Estudios previos concluyeron que las divisiones de células multipolares en hepatocitos poliploides de ratón dieron como resultado una inversión de la ploidía en un solo paso a la progenie con contenido de genoma reducido a la mitad o en cuartos (Duncan et al., 2010). De acuerdo con esta observación, encontramos que nuestros iEC presentan husos multipolares y se someten a una anafase multipolar. However, due to cytokinesis failure, iEC RTM usually resulted in two or three daughter cells of different sizes and DNA contents. Kinetochore analysis of the first-generation progeny in these cells showed highly variable levels of chromosomes in the resulting daughter cell nuclei, suggesting that ploidy reversal is not a one-step process in the iECs. In addition, our FACS data suggest that ploidy reversal occurs over successive cell divisions, ultimately resulting in a DNA content that is similar to that in control cells. Of interest, it was recently shown in an analysis of tumors with numerical CIN that both diploid and tetraploid chromosomal populations converged on a near-triploid DNA content, suggesting that there is likely some type of selective advantage to maintaining a certain level of aneuploidy (Laughney et al., 2015).

Consequence of CIN after transient endoreplication

A potential shortcoming of genome reductive mitosis is that mitotic cells do not have enough genome content to buffer the deleterious effects of the massive aneuploidy that occurs in these divisions. Multipolar cell divisions in cells with excess centrosomes typically result in low viability of the progeny (Ganem et al., 2009). In contrast, the kinetochore distribution analysis of our polyploid cells suggests that progeny from these divisions have a larger number of kinetochores and thus likely have a higher probability to have at least one complete set of chromosomes. In addition, the high cytokinesis failure rate during RTM in polyploid cells results in only two or three daughter cells, decreasing the probability of cells containing incomplete chromosomal complements incompatible with life. Our studies also show that iEC daughters undergo multiple rounds of division to ultimately reduce the genome, but the fraction of cells that ultimately survive is not known. A future goal will be to assess the precise mechanisms by which polyploid cells return to a near-triploid state.

Aneuploidy after RTM in polyploid cells after transient endoreplication may lead to karyotype evolution and selective cellular advantage. Our FISH analysis of chromosomes 2 and 7 demonstrated that the chromosomes are not evenly distributed into daughter cells during polyploid divisions, suggesting that these cells have high levels of CIN and a different chromosome composition from the original cell population. It has been proposed that high levels of CIN allow for selective advantages in the subsequent daughter cells due to the selection of certain favorable chromosomal complements (Duncan, 2013). In contrast, error-prone divisions in tetraploid cells usually lead to loss or gain of only a few chromosomes in daughter cells, resulting in subclones with accumulated mutations (Storchova and Pellman, 2004 Fujiwara et al., 2005). A more striking example is that the aneuploid daughters that arise after polyploid divisions in mouse hepatocytes quickly adapt to external stress (Duncan et al., 2012). A future goal will be to understand whether and how these polyploid divisions lead to favorable karyotypes and the underlying molecular mechanisms that govern this selection.

Polyploid mitosis could contribute to cancer relapse

CIN followed by selection of aneuploid cells is proposed to play a major role in tumorigenesis (Storchova and Pellman, 2004 Fujiwara et al., 2005 Weaver et al., 2007 Williams et al., 2008 Davoli and de Lange, 2011 Varetti and Pellman, 2012 Silk et al., 2013). Our data suggest that transient iECs are a potent contributor to CIN and aneuploidy, suggesting that transient iECs may contribute to tumorigenesis. It is well known that many cancers are polyploid and that polyploidy often correlates with poor prognosis (Davoli and de Lange, 2011), but it is not clear what the mechanistic link is between these observations. Some studies suggest that polyploidy invariably leads to senescence or apoptosis (Verdoodt et al., 1999), consistent with our observation that a fraction of polyploid cell divisions result in cell death. It is well established that many chemotherapeutic agents target the cell cycle, resulting in a failure in cell cycle progression and a triggering of apoptosis. However, we propose that a fraction of the cells escape apoptosis and instead enter the alternative cell cycle state of endocycle or endomitosis (Figure 9). When cells undergo endoreplication, they are resistant to genotoxic stress, such as would be caused by radiation therapy. Thus a transient switch to endoreplication could provide a mechanism for therapy resistance. On discontinuation of the chemotherapy, these transient iECs would be competent to resume mitotic divisions, which are highly error-prone. In this sense, error-prone RTM would elevate rates of genome instability, with microselection of proliferative aneuploid daughters contributing to tumor regrowth. Taken together, our findings support the idea that a return to mitosis by polyploid iECs may be an underappreciated aspect of tumorigenesis and provide a novel inroad into the identification of new therapeutic strategies.

FIGURE 9: Model. After treatments that perturb cell cycle progression, a fraction of the cells escape apoptosis and instead enter the alternative cell cycle state of endoreplication (endocycle/endomitosis). Switching to endoreplication may provide a mechanism for therapy resistance. On discontinuation of the perturbation, many cells die, but a fraction of these polyploid cells resume mitotic divisions, which are highly error-prone, contributing to tumor heterogeneity and leading to cancer relapse.


Discusión

The results presented here show a central role for endogenous Myc in epidermal homeostasis. The reduction of the proliferative compartment led to premature differentiation both in vivo and in culture. However, keratinocytes were capable of cycling in vivo in the absence of Myc, and drastic cell-cycle phasing defects were not observed in proliferative cells, in agreement with observations in dmyc Drosophila mutants (Johnston et al., 1999). It is worth noting, though, that an upregulation of L-myc was detected in younger mice before the more severe phenotype arose. A possible compensatory effect by L-myc or other pathways supporting proliferation in KO epidermis, cannot be ruled out. However, keratinocytes continued to cycle in adult mice even when L-myc and B-myc were downregulated and N-myc was undetectable. In addition, neither a compensatory effect nor the presence of cells carrying undeleted Myc was detected in culture, as no growing clones were obtained from any KO mouse. Nevertheless, the hyperproliferation involved in wound healing, hair follicles and stratified cultures was consistently and severely compromised, indicating that Myc is required for rapid epidermal proliferative cycles.

Myc, cell size and endoreplication

KO cells were significantly smaller, suggesting that cellular growth might be the primary defect in keratinocytes without Myc, causing the observed effects on the proliferation/differentiation balance. Suppression of Myc activity in epidermis also impaired keratinocyte endoreplication. Endoreplication has been often disregarded or poorly studied in mammalian organisms, in spite of the fact that it is found in various human tissues including epidermis (Gandarillas et al., 2000) (J.Z. et al., unpublished), and that it might have an important role in cellular growth (for example, see Edgar and Orr-Weaver, 2001). A correlation between DNA ploidy, cell-size and -differentiation has been observed in plants, Drosophila and mammals, but their interdependence is not clear. However, it has been shown that endoreplication allows plant cells to increase in size, also during epidermal differentiation (Traas et al., 1998 Kondorosi et al., 2000). Our present data suggest that endoreplication is not required for terminal differentiation to take place, but that it is necessary for the cell enlargement that occurs during normal post-mitotic differentiation (Banks-Schlegel and Green, 1981 Gandarillas et al., 2000).

Myc and stem cell function

A possible role of Myc in regulating stem cell biology has been recently proposed (Gandarillas and Watt, 1997 Waikel et al., 2001 Arnold and Watt, 2001). Our data show that Myc KO stem cells are unable to amplify and have a limited life span in culture, and give rise to a limited proliferative progeny in vivo. Reconciling the data reported for the exogenous and the endogenous gene on keratinocytes reveals that Myc pushes stem cells into clonal expansion along the differentiation programme when overactivated (Gandarillas and Watt, 1997 Waikel et al., 2001 Arnold and Watt, 2001), but causes stem cell daughters to enter premature differentiation when absent. Altogether our results suggest that the stem cell turnover is higher and that their compartment might be reduced, in adult Myc KO epidermis. A logical rationale to explain this seems that incapable to undergo rapid amplification and in order to sustain epidermis, stem cells are forced to divide and undergo differentiation more frequently and therefore, their compartment might be progressively reduced. This would explain why the difference observed in the replication index between KO and control epidermis at a given time was not drastic and yet the proliferative compartment (TAC) was reduced. According to this, Myc would not be required for stem cell divisions, nor `a switch' of the stem cell decision to enter the differentiation programme (Gandarillas et Watt, 1997), but it would be `an amplifier' of such a decision (Fig. 9). If this model is correct, the skin should have more difficulties to grow with time and indeed, a more severe phenotype appeared after 2 or 3 months of age. Another expectable consequence of forcing stem cells to divide more frequently is that the epidermis would age prematurely, and this seems to be the case of adult KO skin, since it appeared atrophic and slow regenerating. Altogether, a correct Myc activity appears essential for normal stem cell function and renewal.

Myc and cell growth

The tight and shiny skin and the reduced body size of epidermal Myc KO mice resemble the phenotype of epidermal-specific transgenics for the keratinocyte growth-inhibitory factor TGF-β (Sellheyer et al., 1993), which is known to downregulate Myc. These features are also reminiscent of the `tight skin contracture' human inherited lethal syndrome affecting newborns (Lowry et al., 1985 Lenz and Meschede, 1993 Abrahamson and Stone, 2002). Interestingly, this condition has been described by some authors as `generalised skin atrophy' or hypoplasia (Lenz and Meschede, 1993), and this is consistent with our observations.

A key remaining question is whether mammalian Myc function and cell growth are coupled to cell division. Johnston et al. (Johnston et al., 1999) concluded that Drosophila dmyc stimulates the G1/S transition independently of mitosis control, thus resulting in increased cell size. We made similar observations after constitutive activation of Myc in human keratinocytes, which resulted in cell size increase upon a cell division block (Gandarillas et al., 2000). This coincidence is consistent with the fact that dmyc and Myc share biological activities (Gallant et al., 1996 Schreiber-Agus et al., 1997). However, by reducing Myc expression in the whole mouse body, Trumpp et al. (Trumpp et al., 2001) found fewer cells of normal size in some organs. They suggested that Myc is not essential for cellular growth and instead controls the decision of cells to divide or not to divide, due to a tighter coupling of cell growth and cell division in mammals. Our results show that endogenous Myc controls mammalian epidermal cell size both in proliferative and especially, in postmitotic cells. Two possible reconciling explanations for such discrepancy are that the mice analysed by Trumpp et al. had some remaining Myc expression, and/or that the consequences of Myc function are tissue dependent and cell context dependent rather than species specific. Interestingly, Myc produced larger cells when overexpressed (Kim et al., 2000) and smaller cells when inactivated (Baena et al., 2005), in mouse liver, another endoreplicative tissue. Interestingly, two different groups have reported a requirement of dmyc in Drosophila endoreplication (Maines et al., 2004 Pierce et al., 2004). A selective advantage of cells overexpressing dmyc in Drosophila has also been recently reported by inducing apoptosis of cells with lower levels of dmyc (de la Cova et al., 2004 Moreno and Basler, 2004). Whether this effect is related or not to cell growth remains to be elucidated. A role for Myc in stem cell renewal has also been very recently reported by Wilson et al. (Wilson et al., 2004) in bone marrow. In agreement with our observations, the authors conclude that Myc is not required for stem cell proliferation, although in this case they find an accumulation of stem cells. Different tissue-regulatory mechanisms and cell contexts might account for the different consequences of Myc function (a similar conclusion has been drawn from overexpression of Myc in mouse liver by Beer et al.) (Beer et al., 2004).

The study presented here shows that at least in some tissues and as for dmyc in flies, mammalian Myc function and cell growth are not tightly coupled to cell division. This implies that in addition to cell growth control deregulation, oncogenic alterations may have to hit the mitosis checkpoint to trigger tumorigenesis. In all cases reported, nevertheless, endogenous or exogenous Myc function resulted in increased biomass production, an advantage that tumours would clearly not hesitate to select. Unifying Myc functions in the mammalian body and carcinogenesis should now be the challenge.