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¿Ecuaciones de tiempo de permanencia para ATP-sythase?

¿Ecuaciones de tiempo de permanencia para ATP-sythase?


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He leído que cada rotación de 120 grados del complejo F1 de ATP-sintasa se puede dividir en una rotación de 30 grados y una rotación de 90 grados. Entre estos dos están los tiempos de permanencia, el anterior a la rotación de 90 grados se denomina tiempo de permanencia de unión de ATP y el siguiente se denomina tiempo de permanencia provisional y ambos caen exponencialmente. Sin embargo, no puedo encontrar una derivación de la función de densidad de probabilidad de estos tiempos de permanencia, o su forma exacta. Si alguien conoce tal derivación o dónde encontrar una, se lo agradecería mucho.


Tiempo de permanencia de la unión de ATP

Aquí hay una derivación muy dudosa del tiempo de permanencia vinculante (tenga en cuenta que soy el OP). Para esto tenemos $$ E + S rightarrow ES $$ Donde $ E $ es la enzima y $ S $ es el sustrato (manteniendo esto general). Podemos escribir nuestra ecuación de tasa como: $$ tasa = k [E] [S] $$ Pero también podemos escribir la tasa como: $$ tasa = - frac {d [E]} {dt} $$ de modo que : $$ frac {d [E]} {dt} = - k [E] [S] $$ Ahora aquí está el bit que creo que es un poco dudoso, vamos a suponer que $ [S] $ es aproximadamente constante. De modo que: $$ [E] = Ae ^ {- k [S] t} $$ Podemos tomar $ n = [E] V $ para representar el número de enzimas restantes, donde $ V $ es el volumen, luego dejando $ n_0 = VA = constante $: $$ n = n_0e ^ {- k [S] t} $$ La probabilidad de estar dentro del tiempo $ t $ viene dada por: $$ F (t) = 1-e ^ {-k [S] t} $$ Cuál es nuestra función de distribución conmutativa. Al diferenciar esto, se obtiene nuestra función de densidad de probabilidad: $$ f (t) = k [S] e ^ {- k [s] t} $$

Tiempo de permanencia provisional

El tiempo de permanencia intermedio (también llamado tiempo de permanencia catalítico) implica dos pasos [7]: 1. La escisión del ATP unido a la enzima. 2. La liberación de los productos hidrolizados.

Cada uno de los cuales seguirá la distribución (análoga a la anterior) de:

$$ p_i (t) = k_i e ^ {- k_i t_i} $$ Para $ i = 1,2 $ respectivamente. La distribución de probabilidad conjunta se encuentra mediante la convolución de estos dos [8]: $$ p_T (t) = int ^ { tau} _0 p_1 (t) p_2 ( tau-t) dt $$ Lo que da: $$ p_T (t) = frac {k_1 k_2} {k_1-k_2} (e ^ {- k_2 tau} -e ^ {- k_1 tau}) $$

Editar

Aunque se parte de ecuaciones deterministas (que en realidad no importa), este método se mantiene y es simple. El tipo de reacción se llama reacción de pseudo 1er orden (o clase 2 de 2do orden), lo que explica mi aproximación para que $ [S] $ haya sido constante. Ver [9] y [10].

Fuentes de información adicional

  1. https://youtu.be/X_YXTWU2maY?list=PLbKSbFnKYVY3j6ubaW1zgTXj5C4443v8s
  2. http://www.nature.com/articles/srep08773
  3. http://www.ks.uiuc.edu/Research/atp_hydrolysis/
  4. http://www.pnas.org/content/85/17/6314.full.pdf
  5. https://books.google.co.uk/books?id=uIxwICNmLKEC&pg=PA199&lpg=PA199&dq=catalytic+dwell+time+distribution+%5Batp%5D&source=bl&ots=u8oBcVNCDc&sig=PKvdVAwT0WxdqTuVwMxhU3RfSwM&hl=en&sa=X&ved=0CCAQ6AEwADgKahUKEwiGhKDalufHAhXkadsKHc54ADs#v=onepage&q= catalítico% 20dwell% 20time% 20distribution% 20% 5Batp% 5D & f = false
  6. http://crystal.harvard.edu/PDFs/floyd_biophysj.2010.pdf
  7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16258036
  8. http://crystal.harvard.edu/PDFs/floyd_biophysj.2010.pdf
  9. http://glutxi.umassmed.edu/grad/GradKinetics.pdf
  10. http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Kinetics/Reaction_Rates/Second-Order_Reactions/Pseudo-1st-order_reactions

Análisis del tiempo de permanencia del patrón de haz para una matriz diversa de frecuencia plana

Hui Chen, Escuela de Ingeniería de la Información y la Comunicación, Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónica de China, No 2006, Xiyuan Ave, West Hi-Tech Zone, 611731, Chengdu, Sichuan, República Popular China.

Escuela de Ingeniería de la Información y la Comunicación, Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónica de China, Chengdu, Sichuan, China

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Laboratorio clave de tecnología de sistemas de radar de medición de precisión de la provincia de Sichuan, Guangyuan, Sichuan, China

Hui Chen, Escuela de Ingeniería de la Información y la Comunicación, Universidad de Ciencia y Tecnología Electrónica de China, No 2006, Xiyuan Ave, West Hi-Tech Zone, 611731, Chengdu, Sichuan, República Popular China.

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¿Ecuaciones de tiempo de permanencia para ATP-sythase? - biología

El tiempo que pasa una molécula browniana interactuando dentro de un microdominio delimitado tiene muchas aplicaciones en biología celular, porque el número de límites es una señal cuantitativa, que puede iniciar una cascada de reacciones químicas y por lo tanto tiene consecuencias fisiológicas. En el presente artículo, proponemos estimar el tiempo medio que pasa una molécula browniana dentro de un microdominio $ Omega $ que contiene pequeños agujeros en el límite y moléculas agonistas ubicadas en su interior. Descubrimos que el tiempo medio depende de varios parámetros, como la tasa de unión hacia atrás (con las moléculas agonistas), el tiempo medio de escape del microdominio y el tiempo medio que una molécula alcanza los sitios de unión (tasa de unión hacia adelante). Además, estimamos la media y la varianza del número de límites hechos por una molécula antes de que salga de $ Omega $. Estas estimaciones se basan en un análisis de la capa límite de un tiempo medio de primer paso condicional, solución de una ecuación diferencial parcial singular. En particular, aplicamos los presentes resultados para obtener una estimación del tiempo medio empleado (tiempo de permanencia) por un receptor browniano dentro de un dominio sináptico, cuando se mueve libremente por difusión lateral en la superficie de una neurona e interactúa localmente con moléculas de andamiaje.


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Torsión y rotación de subunidades en F simpleOF1-ATP sintasa

FOF1-ATP sintasas son enzimas ubicuas de membrana impulsadas por protones o iones que proporcionan ATP para todo tipo de procesos celulares. La mecanoquímica de la catálisis es impulsada por dos nanomotores rotativos acoplados dentro de la enzima. Sus diferentes tamaños de paso se han observado mediante microscopía de una sola molécula, incluida la videomicroscopía de nanoperlas fluctuantes unidas a enzimas individuales y la transferencia de energía de resonancia de Förster de una sola molécula. Aquí revisamos los desarrollos recientes de enfoques para monitorear el tamaño del paso de la rotación de la subunidad y el mecanismo de almacenamiento de energía elástica transitoria en un solo FOF1-ATP sintasas.

1. Introducción

El trifosfato de adenosina (ATP) es la moneda de energía universal de la célula. Cuando se hidroliza a difosfato de adenosina (ADP) y fosfato inorgánico (PI), su estándar bioquímico de energía libre. ΔG 0 ’(ATP) de −30 kJ mol −1 [1-3] se puede utilizar para una variedad de reacciones bioquímicas. Sin embargo, en condiciones fisiológicas, la energía libre de la hidrólisis de ATP es incluso mayor, alrededor de -50 a -60 kJ mol -1 [4]. Como la cantidad de ATP es limitada, por ejemplo, nuestro cuerpo humano contiene alrededor de 50 g, debe reciclarse constantemente ya que consumimos 1000 veces más ATP del que tenemos [5,6]. Hace unos 4.500 millones de años, una clase de enzimas llamadas ATP sintasas evolucionó para regenerar ATP a partir de ADP y PI. Dependiendo de las propiedades estructurales de las subunidades y la función fisiológica primaria en diferentes células o compartimentos celulares, se discriminan tres tipos principales de enzimas [7,8]. FOF1Las -ATP sintasas se encuentran en la membrana tilacoide de los cloroplastos, en la membrana mitocondrial interna y en la membrana plasmática bacteriana. Su función es la síntesis de ATP. Por el contrario, VOV1-Las ATPasas son bombas de protones impulsadas por ATP [9,10]. Archaeal AOA1-ATP sintasas son enzimas productoras de ATP con estructuras similares a las de VOV1-ATPases.

Síntesis de ATP en FOF1-ATP sintasas se alimenta de una diferencia de potencial electroquímico de protones (o Na + en algunas células), sobre las respectivas membranas [11]. Hace unos 50 años, el mecanismo principal de la ATP sintasa fue postulado por Peter Mitchell en su teoría quimiosmótica en 1961 [12]. Afirmó que el ATP no es sintetizado por un intermedio fosforilado en las mitocondrias, sino por una enzima integrada en la membrana mitocondrial interna, utilizando la diferencia en las concentraciones de protones (ΔpH) en los dos compartimentos más el potencial eléctrico (Δψ) a través de la membrana de separación [12]. Ambos componentes comprenden la fuerza motriz del protón, PMF. los ΔEl pH se genera durante la fotosíntesis en cloroplastos o durante la fosforilación aeróbica en mitocondrias o bacterias. Aunque pasó más de una década antes de que la teoría quimiosmótica fuera comúnmente aceptada, este mecanismo ahora forma parte de todos los libros de texto de bioquímica. Sin embargo, la forma en que los protones individuales impulsan el ciclo de reacción catalítica dentro de la enzima aún tenía que ser descifrada a nivel atómico.

2. Los componentes de los dos motores rotativos de FOF1-ATP sintasa

Hoy en día, se encuentra disponible una gran cantidad de información estructural sobre la enzima. FOF1-ATP sintasa consta de dos dominios. En la enzima bacteriana, las subunidades α3β3γδɛ comprenden la F1 dominio (usaremos el Escherichia coli nomenclatura en la siguiente) mientras que las subunidades ab2Cnorte forman la membrana F incrustadaO dominio. El número de C Las subunidades varían entre especies y parecen depender de la fuerza motriz del protón (o Na +) disponible. El menor número de C las subunidades son ocho para la enzima mitocondrial del corazón bovino [13], y la más grande conocida hasta ahora es de 15 en enzimas de cianobacterias [14]. La enzima bacteriana de E. coli tiene 10 C subunidades [15].

La primera estructura cristalina pionera del F1 La porción de mitocondrias cardíacas bovinas fue descrita por John Walker y colaboradores en 1994 [16]. Las principales características fueron la disposición alterna de α3β3 subunidades, que formaron una estructura hexagonal, y un tallo central formado por la subunidad γ. Los sitios de unión de nucleótidos catalíticos se ubicaron principalmente en las subunidades β, en la interfaz con α. Subunidades denominadas βTP y βDP contenía AMP-PNP, un análogo de ATP no hidrolizable, o ADP, respectivamente, mientras que la tercera subunidad β (βmi) estaba vacio. Parecía que las subunidades β cambiaron su conformación dependiendo del nucleótido unido. Se localizaron tres sitios de unión de nucleótidos adicionales en las otras interfaces de αβ. Sin embargo, no eran catalíticos y todos contenían AMP-PNP. En consecuencia, la estructura cristalina se interpretó como una imagen fija de la enzima activa. Más tarde se demostró que se parecía a la permanencia catalítica (ver más abajo) [17, 18].

Otra característica de la subunidad β fue la secuencia de aminoácidos DELSEED, que aparentemente formó una palanca que puede actuar para abrir y cerrar el sitio de unión de nucleótidos asociado. Parecía que partes de la subunidad γ pueden interactuar con esta palanca y, por lo tanto, definir el estado conformacional de cada sitio de unión catalítica, porque γ cambia secuencialmente su orientación con respecto a las tres subunidades β en la enzima activa. Además, la subunidad γ consistía en un dominio globular que, junto con ε, se enfrentaba al F incrustado en la membranaO porción, y dos α-hélices N- y C-terminales que formaron una bobina enrollada y se extendieron hacia la cavidad central de la α3β3 hexágono.

Recientemente, la primera F1 estructura de la E. coli enzima fue publicado [19]. Con una alta similitud general con la mitocondrial F1 estructuras, se confirmó que el dominio globular de γ se encuentra en el lado de la membrana de F1 y probablemente interactúa con el C subunidades de FO (que no estaban presentes en esta estructura). La subunidad ε estaba unida a γ y, por lo tanto, también es parte del tallo central de E. coli F1. La subunidad δ no estaba presente en esta estructura, pero está ubicada en la parte superior de la enzima.

En la FO porción, un anillo de C subunidades está incrustado en la membrana. El anillo interactúa con las subunidades γ y ε de F1 [20,21] y con subunidades a [22,23] y B2 apagadoO [24,25]. Subunidad a forma los dos protones (o Na + en algunos organismos) que conducen los medios canales que terminan a cada lado de la membrana. Las subunidades diméricas B2 Forman una bobina en espiral a la derecha con una pequeña compensación de residuos [26, 27] que abarca toda la proteína desde la membrana hasta la parte superior de la α3β3 hexágono. los B Las subunidades se consideran como el tallo excéntrico unido estrechamente a F1 [28,29]. Esta conexión periférica de ab2 a F1 combinado con las tres posibles orientaciones de γ dentro de F1 da como resultado una estructura asimétrica de la enzima, con una orientación del eje central estocástica con respecto al periférico B2 subunidades. El modelo estructural de E. coli FOF1-ATP sintasa se muestra en la figura 1a. Se utilizaron modelos de homología basados ​​en las estructuras de enzimas mitocondriales y suposiciones sobre la localización de subunidades basadas en datos de enlace cruzado y triangulación de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) de una sola molécula.

Figura 1. (a) Modelo estructural de E. coli FOF1-ATP sintasa con una subunidad α (azul claro) y una β (azul oscuro) eliminadas para exponer la subunidad γ (roja) en el centro de la α3β3-seudohexágono. Juntos con ɛ (rosa) y δ en la parte superior (verde oscuro), forman la F1 parte. La membrana F incrustadaO porción consta de 10 C subunidades (amarillo / naranja), que forman una estructura de anillo dentro de la membrana. Subunidad a (verde claro) y dos B las subunidades (verde) forman un tallo excéntrico para mantener juntas ambas porciones. Subunidades γ, ε y la C10-anillo comprenden el rotor de FOF1 (colores rojizos), que gira en el sentido de las agujas del reloj (si se ve desde la membrana) durante la síntesis de ATP con respecto a las subunidades del estator α3β3δab2 (colores azul / verde). La síntesis de ATP en β es impulsada por el flujo de protones (o Na +) a través de FO debido a una diferencia de potencial electroquímico sobre la membrana. Este modelo de homología de FOF1 es un compuesto de varias estructuras parciales (códigos PDB 1BMF [16], 2CK3 [30], 1H8E [31] y 1YCE [32] en el Protein Data Bank, http://www.pdb.org) y se dibujó con VMD v. 1.9.1 [33]. Subunidades a, B2 y δ se han modelado aproximadamente en su tamaño correcto y se han adjuntado manualmente utilizando datos de enlace cruzado. (B) Configuración del ensayo de rotación con una perla magnética unida al F1 parte. F13β3γ) se une a un cubreobjetos mediante etiquetas de histidina (His) en cada subunidad β. La perla magnética cubierta de estreptavidina se acopla a una cisteína en la subunidad γ a través de biotina. La perla está dopada con puntos cuánticos biotinilados fluorescentes para visualizar la rotación del complejo de perlas γ impulsada por ATP. (C) Distribución del punto final de un filamento de actina giratorio (1 µm) acoplado al C10-anillo de E. coli FOF1 en el ensayo de rotación que muestra una aparente rotación escalonada de 120 ° durante la hidrólisis de ATP a un [ATP] alto en presencia de detergente (adaptado de [34]). (D) Tiempos de permanencia de la rotación escalonada de E. coli FOF1 en presencia de (i) 5 mM o (ii) ATP 0,1 mM. Los histogramas muestran las pausas promediadas de las posiciones de paso de una enzima después de 200 o 120 rotaciones, respectivamente.

La pregunta sigue siendo cómo la translocación de protones (o Na +) en una parte remota en FO está acoplado a la síntesis de ATP en los tres sitios de unión de nucleótidos en las subunidades β de F1. Paul Boyer propuso por primera vez un concepto para la síntesis de ATP en 1981 antes de que se dispusiera de información estructural detallada [35,36]. Según su "mecanismo de cambio de unión", dos de los tres sitios de unión de nucleótidos se unen a ADP y PI o generan ATP, y estas reacciones se sincronizan mediante una subunidad γ asimétrica, central y giratoria. Translocación de protones a través de FO es la fuerza impulsora de la rotación γ. En este concepto, FOF1-La ATP sintasa comprende un motor doble, formado por la rotación C-anillo en FO y γε en F1. El rotor está estabilizado por las subunidades del estator. ab2 en FO y α3β3δ en F1. En la figura 1a, las subunidades rotativas γ, ε y C se representan en rojo, rosa y naranja, respectivamente.

Desde que se publicó la primera estructura cristalina que apoya el mecanismo rotatorio de la catálisis, muchos grupos de investigación intentaron revelar los mecanismos moleculares de esta enzima motora, aplicando una variedad de técnicas bioquímicas y espectroscópicas para estudiar su función [37-39]. Sin embargo, la estructura asimétrica de la holoenzima limitó los resultados debido al promedio del conjunto. FOF1-La ATP sintasa es una enzima relativamente robusta que puede manipularse fácilmente, lo que la hace adecuada para microscopía de molécula única (que ha evolucionado desde 1989 a partir de los primeros experimentos con colorantes en cristales orgánicos a temperatura de helio líquido [40]). La observación de cambios conformacionales secuenciales de enzimas individuales como trayectorias de tiempo, es decir, una enzima a la vez o separadas en el espacio, no requiere una sincronización de proteínas asimétricas para una posición inicial o conformación bien definida en el ciclo catalítico. Aquí presentaremos algunos de los experimentos de una sola molécula que desentrañaron el mecanismo de rotación de los dos nanomotores rotativos acoplados dentro de FOF1-ATP sintasa.

3. Evidencia directa: los ensayos de rotación impulsados ​​por ATP resuelven pasos y subpasos de 120 ° en F1

En 1997, el experimento pionero que demostró sin ambigüedades el mecanismo de rotación en el F1 porción de FOF1-ATP sintasa fue informado por Noji et al. [41]. Adjuntan el α3β3γ subcomplejo de TF1 (es decir, F1 de lo termofílico Bacilo cepa PS3) a un cubreobjetos de vidrio cubierto con ácido Ni-nitrilotriacético mediante etiquetas de histidina en cada subunidad β y unió un filamento de actina fluorescente a una cisteína en el dominio globular de la subunidad γ mediante un enlazador biotina-estreptavidina-biotina. Utilizaron videomicroscopía para registrar moléculas individuales de este F1–Complejo de actina. Después de la adición de ATP, reacción de hidrólisis en F1 provocó un movimiento de rotación unidireccional de la subunidad γ que fue visualizado en tiempo real por el filamento de actina. Este ensayo de rotación sirvió como punto de partida para una serie de experimentos de una sola molécula que finalmente dieron como resultado el descifrado de los sucesivos pasos de reacción en F1 durante la hidrólisis de ATP. Además de los filamentos de actina fluorescentes, las nanoperlas de oro [42], las nanovarillas de oro [43-45], el poliestireno [46] o las perlas magnéticas [47-50], o la anisotropía de fluorescencia de fluoróforos simples [51-53] sirvieron como indicadores de la rotación de subunidades. en F1 así como en FOF1. En este último, el reportero se adjuntó a la C-anillo [53–55].

La configuración principal para el ensayo de rotación se muestra en la figura 1.B con una cuenta fluorescente como marcador de rotación. La perla brillante podría ubicarse con precisión nanométrica en videomicroscopía de alta velocidad. Durante la rotación de la subunidad γ, el centro de la posición de la perla se movió solo unos pocos nanómetros en el X- y y-dirección de las imágenes microscópicas. Alternativamente, utilizando un filamento de actina fluorescente como marcador de rotación, se analizó la rotación impulsada por ATP localizando los extremos del filamento de actina en cada fotograma del video grabado. El cambio de posición del extremo se atribuyó al extremo libre y móvil del filamento, mientras que el otro extremo que permaneció en la misma posición en cada imagen se asoció con la conexión de estreptavidina a la subunidad giratoria γ en F1 (o rotativo C subunidades en FOF1 de E. coli en presencia de detergente como se muestra aquí en la figura 1C por conveniencia [34]). El trazado de todas las posiciones finales cambiantes dio como resultado tres posiciones de parada principales, que estaban separadas por micrómetros en el X- y y-dirección. Por lo tanto, los ángulos de rotación relacionados eran fácilmente distinguibles. Los tiempos de permanencia para cada área asignada de posiciones de parada se calcularon y se agregaron a los histogramas (figura 1D, C-ring datos de rotación de E. coli FOF1 en detergente como ejemplo [34]). Las distribuciones del tiempo de permanencia dependieron de la concentración de ATP ([ATP]). A un [ATP] alto, es decir, en el rango milimolar, los tiempos de permanencia se vieron afectados significativamente por el arrastre viscoso del filamento de actina que ralentiza la rotación, pero para un [ATP] bajo, menos de 1 µM, los tiempos de permanencia correspondieron a las tasas de renovación bioquímica en solución [56].

Los experimentos de videomicroscopía posteriores tuvieron como objetivo asociar diferentes pasos de reacción de la hidrólisis de ATP, es decir, unión de ATP, hidrólisis de ATP, ADP y PI liberación, a subpasos de resolución angular de la rotación de la subunidad γ [42]. Se utilizaron pequeñas perlas de oro de 40 nm para reducir la fricción en la enzima durante la rotación, y se requirió una cámara de alta velocidad con 8000 cuadros por segundo para observar una rotación de tres pasos a 2 mM [ATP]. Cada parada después de un paso de rotación de 120 ° correspondió a una reacción de hidrólisis de ATP en uno de los tres sitios catalíticos en las subunidades β. Al reducir [ATP] a 2 µM, cada transición giratoria se resolvió en dos subpasos de 80 ° y 40 °. El sustrato estaba limitado a bajo [ATP] y, por lo tanto, se ralentizó la unión de una molécula de ATP. La duración de la permanencia antes del subpaso de rotación de 80 ° dependía de [ATP], lo que indica que (i) el subpaso de 80 ° está asociado con el proceso de unión de una molécula de ATP a un sitio de unión de nucleótidos vacío, y (ii) ) la permanencia antes del subpaso de 80 ° es el 'estado de espera de ATP' de la enzima. La permanencia antes de la sub-etapa rotatoria de 40 ° fue independiente de [ATP] y se asoció con la reacción de hidrólisis de ATP y la liberación del producto. Por lo tanto, se denominó "permanencia catalítica".

A continuación, se controlaron simultáneamente la rotación de la subunidad γ y el evento de unión de un derivado de ATP fluorescente a la subunidad β. En este ensayo de rotación, poliestireno o perlas magnéticas unidas a TF1 sirvieron como reporteros para seguir la rotación de γ por microscopía de campo brillante [57,58]. Un total del 10 por ciento de las moléculas de ATP se marcaron con fluorescencia con el tinte de cianina Cy3 (Cy3-ATP). Mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM), se creó una onda evanescente sobre el cubreobjetos para observar únicamente las moléculas de Cy3-ATP unidas a TF1, pero no las moléculas que se difunden en la solución a granel. La polarización de la onda evanescente se hizo oscilar con una frecuencia de 1 Hz. De ese modo, se detectó la fluorescencia del Cy3-ATP unido en cualquiera de las tres subunidades β mediante formación de imágenes de anisotropía de fluorescencia resuelta en ángulo. La fluorescencia y la luz de campo brillante se separaron mediante un espejo dicroico y se grabaron simultáneamente con una cámara de video convencional. A 0,6 µM de [ATP + Cy3-ATP], la subunidad γ progresó en pasos de 120 ° y un evento de unión de Cy3-ATP indujo inmediatamente una rotación de la perla en 120 °. Esta molécula Cy3-ATP (o su derivado hidrolizado Cy3-ADP) permaneció unida al menos durante una rotación de γ de 240 °. El sitio de unión de nucleótidos en β permaneció vacío hasta que se produjo la unión de otra molécula de ATP. Estos resultados excluyeron que cada subunidad β actúe por sí misma, pero confirmaron que los tres sitios catalíticos, junto con la subunidad γ, hidrolizan el ATP en una acción concertada. Cuando solo se usó Cy3-ATP sin ATP sin marcar, la reacción de hidrólisis se ralentizó (ver cálculos de acoplamiento y tasas de rotación en [59]), y los subpasos de 80 ° y 40 ° se hicieron visibles.

A partir de estos y posteriores experimentos de rotación de una sola molécula con F unida a la superficie1 de lo termofílico Bacilo cepa PS3, el siguiente esquema de reacción para la hidrólisis de ATP en el F1 surgió el motor [17,60,61]. Si la permanencia de ATP en espera en un ángulo de rotación de la subunidad γ se define como 0 °, la unión de ATP al lado catalítico vacío induce un movimiento de rotación de γ de 80 °. Al mismo tiempo, el sitio de unión de nucleótidos a + 120 ° (es decir, en la dirección de avance de la rotación γ) libera ADP, mientras que el sitio a -120 ° contiene ATP del evento de unión anterior. Después del primer subpaso de 80 °, la enzima alcanza el reposo catalítico. El ATP que se unió durante el paso anterior se hidroliza en ADP y PI. En una segunda reacción, la liberación de fosfato desencadena el siguiente subpaso de 40 °. El ADP se libera durante el segundo subpaso de 80 ° desde el lado que anteriormente estaba a -120 °. El movimiento de rotación de γ en la F separada1 El motor depende de [ATP] y se produce en tres o seis pasos rotativos distinguidos. Mientras que la rotación de γ es en sentido antihorario cuando se ve desde la membrana, la secuencia de eventos en las subunidades β está en la dirección opuesta, es decir, después de la unión de un ATP a un sitio vacío en una subunidad β, el ATP en la subunidad β vecina en el sentido de las agujas del reloj se hidrolizará durante la siguiente permanencia catalítica.

La mayoría de los estudios de una sola molécula sobre el mecanismo de la F1-La ATPasa descrita anteriormente se llevó a cabo con el α3β3γ subcomplejo de TF1, principalmente uniendo filamentos o perlas de actina a la subunidad γ. El mesofílico E. coli F1 La enzima, según lo estudiado por el grupo de Masamitsu Futai con perlas de oro de tamaño 40-60 nm, rotaba ligeramente más rápido a [ATP] y temperaturas similares. Su preparación de proteínas contenía también la segunda subunidad rotatoria ε, pero no la subunidad estática δ de F1 en el ensayo de molécula única. Al saturar [ATP], una tasa de rotación de γ en estos F individuales1 Se informó de moléculas de 400 rps (o 1200 ATP s -1, respectivamente) [62,63]. Los tiempos de permanencia catalítica de una sola molécula fueron de 0,2 ms, es decir, aproximadamente 10 veces más cortos de lo esperado a partir de las mediciones del conjunto bioquímico de la hidrólisis de ATP, y el tiempo de transición para los pasos de 120 ° fue de 0,6 ms [64]. Por lo tanto, diferentes mecanismos estocásticos de pausa (inhibición de ADP e inhibición de ε con pausas distintas) podrían ser las causas de la evidencia aparente de que alrededor del 90 por ciento de la F1 se inhiben las moléculas en las mediciones del conjunto. Comparado con TF1, los E. coli La enzima tiene una permanencia catalítica más corta pero una transición ligeramente más lenta para el paso de 120 ° [64-66]. Por otro lado, Wayne Frasch y sus colegas observaron la rotación de nanobarras de oro de 75 nm de largo unidas a γ de E. coli F1 bajo saturación [ATP] con una resolución temporal muy alta de 2,5 µs. Encontraron tiempos de permanencia catalítica de aproximadamente 8 ms en EF individual1, comparable a sus mediciones de hidrólisis de ATP a granel de 7,7 ms [43]. Debido a que también se informaron diferencias en las tasas de rotación para ATP C-Rotación del anillo en FOF1 de E. coli (ver más abajo), cualquier comparación de las velocidades de rotación de una sola molécula debe hacerse con cuidado, y los sitios de las mutaciones de cisteína para la unión del marcador, los tamaños y formas de los marcadores, otras mutaciones, la integridad de las subunidades en la enzima o la presencia de detergentes. o lípidos para FOF1 hay que distinguir. Además, la resolución temporal del enfoque experimental debe coincidir con los detalles de rotación que se van a resolver.

4. Síntesis de ATP impulsada mecánicamente en una sola F1 usando fuerza magnética externa

La F1 El complejo solo es capaz de hidrólisis de ATP porque carece de FO motor. Sin embargo, cuando γ en F1 giraba en la dirección opuesta por una fuerza magnética externa que actuaba sobre una cuenta magnética unida a γ, también podía sintetizar ATP, demostrando que la energía mecánica se puede transformar en energía química [47,48]. El campo magnético externo aplicado se utilizó para impulsar la enzima en cualquier dirección catalítica, es decir, para reforzar la hidrólisis o síntesis de ATP, o para detener la subunidad γ en cualquier ángulo de rotación dado. En cámaras de reacción de picolitro selladas, fue posible detectar y cuantificar las pocas moléculas de ATP sintetizadas por las reacciones de luminiscencia de luciferina / luciferasa, o monitoreando la rotación impulsada por ATP después de la liberación de la fuerza magnética externa, respectivamente.

5. La rotación de subunidades impulsada por protones se puede controlar mediante FRET de molécula única

Se desarrolló un enfoque experimental diferente para monitorear los movimientos de rotación en la holoenzima FOF1-ATP sintasa durante la síntesis de ATP impulsada por protones.En el grupo de Gräber, se aplicó transferencia de energía de resonancia de Förster de molécula única (FRET) para observar la rotación del eje central en individuos E. coli FOF1-ATP sintasas. Dos tintes fluorescentes muy próximos, es decir, en el rango de hasta 10 nm, pueden transferir energía de uno a otro mediante el mecanismo de Förster no radiativo, siempre que el espectro de emisión del fluoróforo donante se superponga con el espectro de absorción del aceptor. , y los momentos dipolares de transición de los colorantes no están orientados ortogonales entre sí [67]. Entonces, la eficiencia de transferencia de energía de resonancia depende de la distancia entre los dos tintes. Por lo tanto, FRET se puede utilizar como regla molecular dentro de proteínas individuales para distancias de colorante entre 3 y 8 nm. Börsch y sus colegas utilizaron dos fluoróforos unidos a la subunidad γ o ε en el rotor y a ambos B subunidades en el estator a través de cisteínas introducidas genéticamente [68-72]. El etiquetado específico de las cisteínas respectivas se logró mediante el etiquetado separado de la F1 y FO porciones, y posterior reensamblaje en una holoenzima marcada doble completamente funcional, que se reconstituyó en liposomas. Estos proteoliposomas contenían menos de una enzima en promedio y mostraron tasas de hidrólisis y síntesis de ATP similares a las enzimas de tipo salvaje no modificadas de E. coli.

El principio de medición de FRET confocal de una sola molécula con proteoliposomas de difusión libre en solución se muestra en la figura 2.a. El colorante rodamina 110 (Rh110) en la subunidad del rotor γ fue excitado por un láser a 488 nm y actuó como donante FRET, mientras que el segundo colorante cianina 5 (Cy5) en las subunidades del estator B2 sirvió como aceptor de FRET [73] (figura 2B). La fluorescencia de ambos tintes se detectó mediante fotodiodos de avalancha sensibles y se registró utilizando componentes electrónicos de conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo con resolución de tiempo de picosegundos. Una vez que un proteoliposoma entró en el volumen de detección / excitación confocal del tamaño de un femtolitro debido al movimiento browniano, el donante FRET Rh110 en FOF1 se excitó repetidamente y emitió fotones en una ráfaga. La intensidad de la fluorescencia dependía de la posición real del tinte dentro del foco láser, que tenía una distribución de intensidad gaussiana tridimensional aproximada. El tiempo medio de tránsito de los proteoliposomas fue de aproximadamente 30 a 50 ms, pero se pudieron observar algunos proteoliposomas durante varios cientos de milisegundos (figura 2).CD). Para potenciar la síntesis de ATP, los proteoliposomas con una sola enzima fueron energizados por un ΔpH usando mezcla de tampón en presencia de una diferencia de potencial eléctrico creada por un potencial de difusión de K + [11]. Para las mediciones de rotación durante la hidrólisis de ATP, se añadió ATP 1 mM al tampón en presencia de Mg 2+ 2,5 mM. La concentración de liposomas que contienen solo una etiqueta FOF1La -ATP sintasa se ajustó a aproximadamente 100 pM de modo que en promedio de tiempo, solo se detectó una enzima en el foco del microscopio confocal. En presencia de AMP-PNP, cada enzima mostró una de las tres eficiencias FRET diferentes correspondientes a tres posibles orientaciones de la subunidad γ dentro de la F1 parte. A partir de las eficiencias de FRET, se calcularon las distancias de colorante a colorante de aproximadamente 4,5, 6,5 y 8 nm para cada orientación de subunidad γ. Estas distancias estaban de acuerdo con el modelo de FOF1 de E. coli.

Figura 2. (a) Supervisión de la rotación de subunidades en un solo F reconstituidoOF1-ATP sintasa por microscopía FRET confocal. El proteoliposoma atraviesa arbitrariamente el volumen de excitación / detección confocal debido al movimiento browniano. (B) Posiciones de los fluoróforos FRET en FOF1-ATP sintasa. Donante FRET Rh110 (punto azul) en la subunidad ɛ del rotor que se muestra en negro estaba unido al eje central de rotación y se esperaba que se moviera de acuerdo con la flecha azul durante la hidrólisis de ATP. La rotación fue opuesta para la síntesis de ATP (flecha verde). El aceptador FRET Cy5 (punto rojo) se adjuntó al B dímero de subunidad del estator mostrado en gris. (C) Ráfaga de fotones de una F etiquetada con FRETOF1-ATP sintasa durante la hidrólisis de ATP. El panel inferior muestra las trayectorias de intensidad de fluorescencia del donante de FRET Rh110 (trazo verde. ID) y aceptor Cy5 (trazo rojo, IA). El panel superior muestra el factor de proximidad correspondiente P como un trazo azul, con P = IA / (ID + IA). Los niveles de eficiencia de FRET se asignaron manualmente y se denominaron "FRET alto" H, "FRET medio" M y "FRET bajo" L. La secuencia de FRET fue → H → M → L → H → (adaptado de [73]). (D) Ráfaga de fotones de una F etiquetada con FRETOF1-ATP sintasa durante la síntesis de ATP. El panel inferior muestra trayectorias de intensidad de fluorescencia y los paneles superiores muestran la traza del factor de proximidad. La secuencia FRET se invirtió → L → M → H → L → (adaptado de [73]).

Durante la catálisis, también, se encontraron tres eficiencias FRET. Sin embargo, cambiaron rápida y gradualmente dentro de las explosiones de fotones de enzimas individuales. Su secuencia se invirtió, dependiendo de las condiciones catalíticas como se ve en las figuras 2.C para la hidrólisis de ATP y 2D para la síntesis de ATP. Los tiempos de permanencia medios para los niveles de FRET se encontraron en el rango de 12 a 20 ms para la hidrólisis de ATP, o entre 17 y 50 ms para la síntesis de ATP, respectivamente. Estas permanencias correspondieron a un recambio enzimático único de aproximadamente 70 ATP s -1 para la hidrólisis de ATP y hasta 50 ATP s -1 para la síntesis de ATP. Las tasas de una sola molécula coincidieron con las tasas del conjunto bioquímico para las mismas preparaciones enzimáticas reconstituidas en liposomas. La progresión de los tres niveles de FRET fue la misma en aproximadamente el 80 por ciento de todos los niveles de FRET, pero se invirtió para las condiciones bioquímicas opuestas. Para la hidrólisis y síntesis de ATP, los tres niveles de FRET fueron similares, es decir, independiente de la dirección de rotación. Esto demostró no solo que γ y ε son de hecho parte del rotor en la holoenzima FOF1-ATP sintasa, pero también que los eventos catalíticos durante la síntesis de ATP y la hidrólisis de ATP son en principio reversibles. En presencia del inhibidor no competitivo aurovertina B, las diferencias en el movimiento de rotación de γ durante la síntesis de ATP y la hidrólisis de ATP podrían desentrañarse, lo que indica que los inhibidores no solo sirven como controles para las mediciones de la actividad bioquímica, sino que también pueden usarse para obtener mecanismos mecánicos adicionales. información. Las mediciones de FRET de una sola molécula pueden discriminar entre una ralentización general de la rotación durante la hidrólisis de ATP y un bloqueo parcial de la rotación durante la síntesis de ATP [73].

En un experimento FRET de una sola molécula posterior, el tamaño del paso de la rotación C-anillo en FOF1-La ATP sintasa se resolvió [74]. La proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) se fusionó con la subunidad del estator. a en FO y sirvió como donante FRET [75], mientras que el aceptor fluoróforo Alexa568 se unió covalentemente a una cisteína de uno C subunidad. Las enzimas individuales reconstituidas fueron impulsadas por una fuerza motriz de protones para sintetizar ATP. Las enzimas rotativas de doble marcaje se detectaron mediante excitación láser alterna pulsada con un ciclo de trabajo optimizado [76,77]. Se discriminaron hasta cinco niveles diferentes de FRET. Sin embargo, los cambios de eficiencia de FRET fueron más pequeños y los tiempos de permanencia más cortos que antes, como se esperaba para un movimiento giratorio de 10 pasos con la misma tasa de rotación para la rotación completa que el motor de tres pasos en F1. Los cambios de FRET pequeños y grandes se asignaron manualmente en el conjunto de datos, pero la progresión de los niveles de FRET no siempre fue clara y unidireccional. La resolución de tiempo del experimento FRET de una sola molécula se limitó a 1 ms debido a un brillo reducido y a las propiedades fotofísicas de los fluoróforos, por lo que podrían perderse algunas estancias breves. Las trayectorias de tiempo FRET simuladas de una sola molécula se generaron mediante un enfoque de Monte Carlo para facilitar el desenlace de la C-Tamaño del paso del anillo. Simulaciones de 10 pasos CEl anillo con cinco distancias FRET diferentes por razones de simetría de anillo se comparó con un C-anillo giratorio con tres pasos de 120 °. Posteriormente, los resultados experimentales de FRET podrían ajustarse mejor al asumir una rotación de 10 pasos. Así se concluyó que el rotativo Cde hecho, el anillo de la enzima avanza en pasos de 36 ° durante la síntesis de ATP. Sin embargo, no se pudo descartar que la distribución del nivel FRET de una sola molécula también admitiría una combinación de subpasos de 80 ° + 40 °, que se informaron para el TF termófilo.1 durante la hidrólisis de ATP.

La rotación de un paso tras otro del C-anillo fue compatible con el modo de hidrólisis de ATP utilizando nanobarras [44] o nanoperlas [78]. Sin embargo, las mutaciones en la vía de translocación de protones a través de la subunidad a o se requirió un arrastre viscoso incrementado para resolver los pasos secundarios en estos experimentos. Como se discutió para el caso de la rotación de la subunidad γ en F1 arriba, es importante comparar la velocidad de rotación de una sola molécula y los tamaños de paso con precaución. El uso de liposomas cerrados en los experimentos FRET en contraste con los parches de bicapa lipídica o nanodiscos lipídicos con soporte superficial afectará y ralentizará la rotación de la subunidad impulsada por ATP debido a la acumulación de una diferencia de concentración de protones que contrarresta la enzima acoplada. Además, las posiciones de los aminoácidos para las mutaciones de cisteína no solo permitirán la unión de los fluoróforos u otros marcadores, sino que también podrían alterar las velocidades catalíticas de las enzimas mutantes. Sin embargo, debido a que existe un desajuste entre la rotación de 10 pasos en FO y la rotación de tres pasos en F1, estos resultados reforzaron el modelo de dos nanomotores acoplados elásticamente que fue desarrollado por Junge y colaboradores [4,79-82].

5. Los diferentes tamaños de paso de los dos motores acoplados requieren elasticidad interna

En FOF1-ATP sintasa, dos nanomotores trabajan uno contra el otro. Dependiendo de la fuerza motriz del protón, la E. coli las enzimas en los proteoliposomas pueden pasar de la síntesis de ATP a la hidrólisis de ATP [3]. El potencial químico de la síntesis o hidrólisis de ATP en F1 actúa contra la diferencia de potencial electroquímico sobre la membrana que impulsa el motor en FO. Los dos motores funcionan con diferentes marchas. F1 es un motor de 3 pasos, mientras que FO es un motor de 10 pasos en E. coli (o de 8 a 15 pasos, según el organismo). Surge la pregunta de cómo se transmite la energía entre estos dos motores y cómo la enzima puede superar las barreras de energía para un sistema en el que dos motores con engranajes diferentes están estrechamente acoplados. Se ha sugerido que los motores estén acoplados elásticamente [4,79-82]. En lugar de un sistema rígido, ciertas partes de esta enzima son elásticamente blandas y pueden almacenar energía de forma transitoria hasta que se necesiten para la reacción química. De ese modo, la enzima puede funcionar con una alta tasa de rotación y eficiencia cinética.

En una serie de experimentos con una sola molécula, Sielaff y colaboradores han determinado estos elementos elásticos [49,50]. Usaron mutantes de E. coli F1 o FOF1 que contenía dos cisteínas diseñadas, una en el rotor (subunidades γ o C) y el otro en el estator (subunidades β, α o a) oponiéndose a la cisteína anterior (figura 3a). Los pares de cisteína, a saber, aI223C / cL72C (azul en la figura 3a), βD380C / γA87C (verde) y αE284C / γA276C (rojo), se colocaron sobre la longitud del tallo del rotor para explorar sus diferentes elasticidades. En el ensayo de rotación, la enzima se unió a la superficie del vidrio. vía etiquetas de histidina en cada subunidad β, mientras que un filamento corto de actina marcado con fluorescencia (aprox. 0,5 µm) o una perla magnética dopada con punto cuántico (Q-dot) (1 µm) unida a la enzima en el otro lado sirvió como indicador para videomicroscopía. Los reporteros estaban obligados a C-anillo en FOF1, oa γ en F1, respectivamente (figura 3a,B).

Figura 3. (a) Ensayo de rotación con E. coli FOF1 unido a un cubreobjetos vía etiquetas de histidina (His) en la subunidad β, impulsadas por la hidrólisis de ATP. Un filamento de actina fluorescente marcado con TMR se acopla a etiquetas de estreptococos en cada C subunidad vía un vínculo estreptactina-biotina. Para controlar la elasticidad interna del rotor, se diseñaron tres mutantes cada uno con dos cisteínas opuestas en el rotor y el estator como se indica. Después de la oxidación, sirvieron para formar un puente disulfuro y paralizar la enzima en una determinada posición. (B) Se utilizó una partícula magnética dopada con puntos Q en lugar de un filamento de actina para controlar la elasticidad interna del estator, es decir, subunidades B2. La partícula magnética se cubrió con estreptavidina o estreptactina, para unirla a B2, ya sea directamente a través de dos cisteínas / biotinas en la membrana, parte integral de las subunidades B, o indirectamente a la C-anillo, que estaba reticulado a la subunidad a a través de dos cisteínas como se indica, respectivamente. (C) Cumplimiento del complejo enzima-filamento para los tres mutantes dobles que se muestran en (a), determinada por las fluctuaciones térmicas de la proteína reticulada. Los histogramas se ajustaron con gaussianos y la rigidez a la torsión se derivó de su ancho inverso, lo que resultó en 450, 59 y 47 pN · nm para la curva azul, verde y roja, respectivamente (adaptado de [50]). (D) Modelo de FOF1 mostrando en rojo el sitio de mayor elasticidad, es decir, el sitio de contacto de C-arrojo con γε. La conformidad en unidades de pN · nm se da para diferentes dominios de la enzima (figura proporcionada por S. Engelbrecht y W. Junge).

Después de la adición de ATP y en condiciones reductoras, las subunidades comenzaron a rotar como se esperaba. Tras la oxidación, las dos cisteínas formaron un puente disulfuro y la enzima dejó de girar. En este estado, solo eran visibles las fluctuaciones térmicas del sistema enzimático-indicador. Un histograma de estas fluctuaciones mostró distribuciones de tipo gaussiano (figura 3C). El ancho σ de los gaussianos fue inversamente proporcional a la rigidez torsional κ (en pN · nm) por σ = kBT /κ, donde kB es la constante de Boltzmann y T la temperatura absoluta. El eje de la bobina enrollada de γ tenía una rigidez media con κ = 320 pN · nm. La porción con la rigidez torsional más pequeña se ubicó justo entre los sitios respectivos de generación de par en F1 y FO—Es decir, en la interfaz de la porción globular de γ y la C-anillo. Con una rigidez a la torsión de menos de 70 pN · nm, puede almacenar hasta 14 kJ mol -1 de energía elástica para suavizar la cooperación de los dos motores cuando operan uno contra el otro. En la enzima no restringida, el cumplimiento fue incluso menor (alrededor de 35 pN · nm como se infiere de las posiciones de reposo de la enzima), causado por el movimiento de bisagra flexible de la palanca en las subunidades β. Además, una simulación de dinámica molecular del sistema libre y reticulado reveló una coincidencia sorprendente con los datos experimentales [83].

Por otro lado, se encontró que el estator era al menos 10 veces más rígido que la parte más flexible del rotor. La elasticidad del tipo salvaje B2 dímero se comparó con mutado B subunidades que fueron alargadas por 11 residuos de aminoácidos ("largas") o desestabilizadas al sustituir tres residuos consecutivos con glicinas ("Gly3-mutante") [49]. En el ensayo rotacional, una perla magnética dopada con Q-dot acoplada al estator sirvió como indicador para monitorear el movimiento de FOF1 (figura 3B). Como el estator no giraba por sí mismo, el movimiento se inducía artificialmente mediante la aplicación de un campo magnético giratorio externo, que impulsaba el cordón hacia adelante o hacia atrás. Se probaron dos modos de funcionamiento. (i) Cuando el cordón magnético se acopló al extremo integral de la membrana del B2 dímero por un acoplamiento cisteína-biotina-estreptavidina, el dímero se retorció alrededor de su eje. (ii) El movimiento de flexión fisiológico de B2 fue estudiado acoplando la perla magnética a la C-anillo que estaba reticulado a la subunidad a. En todos los casos, el cumplimiento fue de aproximadamente 500 pN · nm, excepto por la flexión del mutante Gly3. Aquí, el cumplimiento fue tres veces menor en comparación con la enzima de tipo salvaje. La actividad de bombeo de H + dependiente de ATP de los mutantes se redujo a la mitad en comparación con la F de tipo salvajeOF1-ATP sintasa. No obstante, estos mutantes con un estator desestabilizado estaban activos, porque la reducción de su distensibilidad tres veces (es decir, todavía una magnitud mayor que la distensibilidad del rotor) no afectó de manera importante la estabilidad del estator. Las propiedades elásticas se resumen en la figura 3.D. Estos datos apoyaron el modelo teórico para la transducción de energía en FOF1-ATP sintasa por deformaciones transitorias reversibles en el rotor.

6. FRET de una sola molécula de tres colores revela que el rotor gira hasta 120 °

Para identificar las deformaciones elásticas de las subunidades del rotor sin la unión de perlas o filamentos grandes y para observar estas fluctuaciones conformacionales durante la síntesis de ATP, el enfoque FRET de molécula única con una sola F que se difunde librementeOF1-ATP sintasas en liposomas se extendió recientemente a un experimento de tres fluoróforos [77, 84]. La configuración del microscopio confocal multicolor se muestra en la figura 4a. Un triple mutante de E. coli FOF1-Se usó ATP sintasa que comprende la proteína fluorescente EGFP fusionada al extremo C-terminal de la a subunidad como donante FRET primario, la subunidad ε etiquetada con Alexa532 como donante FRET secundario en el residuo 56, así como una etiqueta Cy5 como aceptor FRET en una cisteína introducida en el residuo 2 en uno de los diez C subunidades (figura 4B). El objetivo de esta configuración espectroscópica fue correlacionar las deformaciones internas de las subunidades del rotor con una rotación general de las tres subunidades γεC10 como prueba de la actividad catalítica de la enzima. Por lo tanto, los artefactos fotofísicos en el nivel de fluorescencia de una sola molécula, como las fluctuaciones espectrales y el parpadeo, podrían discriminarse de una torsión transitoria de ε versus C subunidades. Indicaciones de movimientos relativos entre ε y C también fueron encontrados por Gräber y colaboradores [85].

Figura 4. (a) Configuración experimental para mediciones FRET confocales de tres colores utilizando tres láseres alternos en ciclo de trabajo optimizado (adaptado de [77]). (B) Posiciones de los tres fluoróforos en una sola FOF1-ATP sintasa en un liposoma. EGFP (rectángulo azul) es el primer donante FRET en la estática a subunidad, que es excitada por el láser de 488 nm. Alexa532 (punto verde) se une a la subunidad rotatoria ε y actúa como aceptor de FRET para EGFP por excitación de 488 nm, pero posteriormente se convierte en el donante de FRET secundario cuando se excita con el pulso láser de 532 nm. Cy5 (punto rojo) en uno de los 10 rotativos C subunidades es el aceptador FRET para EGFP y Alexa532. (C) Esquema de las mediciones de distancia FRET alternadas en una sola enzima entre la posición estática de EGFP en a y tres posiciones de parada de la subunidad ε rotatoria (puntos verdes con las posiciones 1, 2 y 3). Retorcimiento del rotor entre ε y C se debe a los diferentes tamaños de paso de ambas subunidades rotativas y da como resultado cambios de distancia FRET de acuerdo con las flechas naranjas. (D) Ráfaga de fotones de una sola FOF1-ATP sintasa que comprende dos mediciones FRET simultáneas en una enzima. Las trayectorias de fluorescencia inferiores muestran el donante de FRET EGFP (azul) y los aceptores de FRET combinados Alexa532 más Cy5 (verde). Las intensidades relativas cambiaron durante el tiempo de observación y produjeron cambios escalonados del factor de proximidad (mostrado como trazo gris arriba). La trayectoria FRET asociada para Alexa532 como donante FRET (cian) y Cy5 como aceptor FRET (rojo) se registró durante la excitación de 532 nm. La trayectoria de distancia (azul / naranja) en el panel superior indica una torsión escalonada entre ε y C así como las fluctuaciones de la distancia elástica dentro de la segunda mitad de esta explosión de fotones (figura 4B,C y D adaptado de [84]).

Brevemente, el mutante de cisteína εH56C en F1 fue producido en E. coli cepa RA1. F1 se preparó y marcó con Alexa532-maleimida. Se determinó que la eficiencia media de etiquetado era del 35 por ciento. El doble mutante FOF1-ATP sintasa con EGFP activado a y una cisteína introducida en la posición del residuo 2 de C se purificó por separado. Después del etiquetado subestequiométrico del C-anillo de aproximadamente el 7,4 por ciento con Cy5-monomaleimida, la enzima se reconstituyó en liposomas preformados y su F sin etiquetar1 se intercambió con el F con la etiqueta Alexa5321. Tasas de éxito de la F1 los procedimientos de canje no fueron cuantificados. Por lo tanto, se superpusieron tres longitudes de onda láser (488, 532 y 635 nm) en el mismo volumen de excitación confocal y se aplicó una secuencia de pulsos para un esquema de excitación láser alterna con ciclo de trabajo optimizado (DCO-ALEX, figura 4a) para identificar los pocos FOF1-ATP sintasas con los tres fluoróforos presentes [77,84].

Dos mediciones FRET simultáneas en cada F individualOF1-La ATP sintasa se combinó como se muestra en la figura 4antes de Cristo. La primera medición de distancia entre EGFP en la subunidad estática a (azul) y los dos marcadores de las subunidades del rotor ε (verde) y C (rojo) reveló una enzima activa cuando se detectaron fluctuaciones de FRET escalonadas como ɛ/C girado desde la posición de parada 1 a las posiciones de parada 2 y 3. Posteriormente, la segunda medición de distancia a través de las subunidades del rotor ε y C, indicado por flechas naranjas en la figura 4C, desentrañó el giro angular entre estos dos tintes en la misma enzima. En la figura 4 se muestra un ejemplo de una explosión de fotones de este tipo.D. La excitación pulsada con el láser de 488 nm sondeó el movimiento de las subunidades del rotor con respecto al estator. En el panel más bajo, las intensidades relativas de fluorescencia del donante de FRET EGFP y los aceptores de FRET Alexa532 más Cy5 cambiaron paso a paso de eficiencias de FRET bajas a medias a altas, como se ve en la traza del factor de proximidad correspondiente anterior (trayectoria gris). La excitación del fluoróforo Alexa532 en ε con 532 nm ahora actuando como el donante FRET real mostró cambios de eficiencia FRET en el aceptor Cy5 en C por cambios de intensidad relativa dentro de este estallido de fotones. La correspondiente trayectoria de distancia FRET en el panel superior de la figura 4D (azul-naranja) indicó un gran cambio de distancia de 6 a 5 nm al comienzo de la explosión de fotones, que fue seguido por fluctuaciones de distancia de aproximadamente 0,5-1 nm. Sobre la base de estos experimentos FRET, analizamos cuantitativamente los movimientos relativos de ε y C durante la síntesis de ATP y la hidrólisis de ATP [86]. Encontramos una torsión extensa en esta sección del rotor, que abarca el dominio de barril β de ε y el C-anillo, significativamente mayor de 36 ° y posiblemente en el rango de hasta 120 °.

Estos datos FRET de una sola molécula y las mediciones de fluctuación angular basadas en perlas confirmaron la hipótesis de que una fracción sustancial de la energía elástica de torsión total del rotor se almacena en la parte del rotor flexible, mientras que el estator es muy rígido y no contribuye al alto cumplimiento. de la FOF1-ATP sintasa. La parte más blanda probablemente se encuentra en la interfaz de los dos nanomotores paso a paso, es decir, donde se necesita mecánicamente para operar la enzima con alta eficiencia cinética.

7. Outlook

¿Qué aprendimos en 15 años de los experimentos de rotación de una sola molécula con F1 y FOF1-¿ATP sintasas? En primer lugar, pruebas experimentales de rotación de subunidades y discriminación de pasos de 120 ° a [ATP] alto y subpasos a [ATP] bajo en F1 nos permitió perfeccionar el modelo de catálisis rotatoria. Los cuatro pasos químicos de la hidrólisis de ATP, es decir, desde la unión hasta la escisión del enlace y la liberación de productos, se atribuyeron no solo por su tiempo, sino también con respecto a los tres sitios de unión catalíticos sincronizados en la enzima. Las ventajas de la visualización directa de perlas giratorias o filamentos unidos a enzimas unidas a la superficie fueron (i) tiempos de observación muy largos de una sola molécula con muchos cambios y buenas estadísticas, y (ii) la posibilidad de cambiar las condiciones bioquímicas y monitorear sus efectos sobre el comportamiento rotatorio de la misma enzima. Las mediciones de elasticidad de una sola molécula requerían ambos beneficios. Las resoluciones angulares y de tiempo para los tamaños de paso de los nanomotores rotativos son muy altas utilizando nanopartículas brillantes que no blanquean como indicadores. La colocación de perlas magnéticas en el rotor permitió, en última instancia, fabricar y medir "ATP artificial" mediante rotación forzada en pequeñas cámaras de reacción.

Otros métodos de manipulación e imagen de una sola molécula, como la microscopía de fuerza atómica [87] o las pinzas ópticas muy suaves, aumentarán la resolución del ciclo catalítico mecanoquímico detallado en esta ATPasa. Se están realizando experimentos que prueban la estimulación mecánica de diferentes dominios de F1 para correlacionar las fuerzas direccionales con la rotación de la subunidad γ inducida. Las extraordinarias estadísticas de cambios conformacionales basadas en una única molécula unida a la superficie permiten análisis teóricos avanzados como los teoremas de fluctuación [88,89].

Las mediciones de FRET de molécula única parecen complementar este enfoque. La dirección de rotación se ha medido mediante FRET tanto para la hidrólisis de ATP como para la síntesis de ATP. Las pequeñas moléculas de colorante no contribuyeron al arrastre viscoso. Sin embargo, las posiciones de las mutaciones de cisteína en el FOF1-La ATP sintasa todavía tenía que controlarse para evitar tasas de rotación reducidas. La función del inhibidor diciclohexilcarbodiimida (que se une al C subunidad y bloqueo de la rotación en FO) podría discriminarse del inhibidor aurovertina B, que ralentizó la rotación durante la hidrólisis de ATP pero aparentemente bloqueó la rotación durante la síntesis de ATP. En contraste con las mediciones de FRET de molécula única de la ATPasa de tipo P KdpFABC, que es un transportador de K + bacteriano con un único dominio de unión de nucleótidos flexible [90,91], o con el transportador ABC impulsado por ATP, glucoproteína P [92]. con dos sitios de unión de ATP, el FOF1-ATP sintasa mostró una correlación directa de la unión de ATP y cambios conformacionales escalonados. Debido a que los inhibidores podían bloquear completamente la rotación escalonada, fue posible la discriminación de las fluctuaciones térmicas del dominio de la proteína marcada de las transiciones entre conformaciones durante la catálisis. Se puede anticipar un comportamiento giratorio similar para el tipo A estructuralmente relacionado (incluido el Thermus thermophilus enzima [78,93]) y ATPasas de tipo V vacuolares [94,95]. La resolución de tiempo para las transiciones conformacionales detectadas por FRET de molécula única con FOF1-ATP sintasa alcanzó un rango de submilisegundos [72,96] pero dependió de la relación señal-ruido. Por lo tanto, las transiciones rápidas se siguen con mayor precisión utilizando sondas de dispersión de luz [43]. Dado que el enfoque FRET de molécula única siempre está limitado por la fotofísica de los colorantes, se esperan nuevas mejoras con nuevos fluoróforos con mayor fotoestabilidad [97,98] o con nanocristales fluorescentes [99].

La monitorización de proteoliposomas que se difunden libremente se limita a menos de un segundo debido al tiempo de tránsito a través del foco láser. Los nuevos dispositivos no ópticos para atrapar partículas, como la trampa electrocinética anti-browniana [100-104] (trampa ABEL) inventada por Cohen y Moerner, se pueden utilizar para atrapar y empujar activamente una sola FOF1-ATP sintasa a una posición objetivo para mediciones FRET confocales extendidas [105]. Luego, los diferentes números de protones transportados necesarios para hacer una molécula de ATP en la FOF1-ATP sintasas de cloroplastos [3,106], bacterias [3] o mitocondrias [107] (calculadas a partir de mediciones de conjuntos) se pueden comparar con los tamaños de paso de la rotativa C-anillos del respectivo single FO motores.


Discusión

En este estudio, medimos el tiempo de permanencia aparente de los dominios SH2 dentro de un campo de iluminación TIR cerca de la membrana celular. Encontramos que el tiempo de permanencia promedio es más largo de lo previsto sobre la base de la tasa de disociación química, y para los dominios monoméricos SH2, la cinética de disociación exhibió poca heterogeneidad. Aunque no se pueden excluir por completo otras posibilidades, la explicación más simple y más probable es que la interacción entre los dominios SH2 y los sitios p-Tyr implica un reenlace repetido. Proponemos que la reagrupación es el resultado de la competencia entre la velocidad cinética química intrínseca muy rápida de la reacción de asociación y la velocidad de difusión relativamente lenta de las biomoléculas in vivo. Parte de la razón por la que la tasa de asociación química es alta es que hay una gran cantidad de sitios de unión de p-Tyr disponibles, porque cada molécula receptora tiene múltiples sitios de fosforilación y debido a la agrupación de los receptores que aumenta aún más la concentración local de sitios de unión. . Debido a que las moléculas SH2 no se disocian directamente de los receptores en nuestro modelo, el concepto tradicional de tiempo de rotación tiene un significado ambiguo en este caso. De hecho, hay dos tiempos de rotación diferentes. El tiempo de renovación de SH2 en un sitio p-Tyr individual es bastante corto, porque la molécula se disocia rápidamente. La rápida disociación es coherente con el hecho de que los sitios p-Tyr pueden desfosforilarse muy rápidamente (26) y, por tanto, no están protegidos por la unión de SH2 durante mucho tiempo. Por otro lado, el tiempo de renovación de SH2 con respecto al grupo de receptores es relativamente largo, porque la molécula de SH2 & # x0201 choca & # x0201d entre los sitios de unión. La teoría predice que la agrupación estabiliza la unión entre los sitios p-Tyr y las moléculas SH2, lo que verificamos en experimentos.

El hallazgo de que la proteína SH2 salta entre los sitios de unión agrupados a lo largo de la membrana celular sugiere que una sola molécula de SH2, cuando se recluta en la membrana, podría interactuar potencialmente con múltiples sitios p-Tyr que están cerca unos de otros. Este tipo de mecanismo también puede desempeñar un papel en otras interacciones proteicas intracelulares. Por ejemplo, los estudios de la interacción de Cdc4 con Sic1 revelaron que Cdc4 puede interactuar con múltiples sitios fosforilados en Sic1 aunque Cdc4 contiene solo un sitio de interacción (27). Junto con nuestros hallazgos, parece plausible que el equilibrio dinámico a través de múltiples eventos de reagrupación sea un tema común de las interacciones de las fosfoproteínas. El mecanismo de unión disminuye la importancia de los sitios de unión únicos de alta afinidad. En términos de señalización de RTK, los tiempos de permanencia de SH2 dependen de las afinidades promedio de muchos sitios fosforilados, la falta de un solo sitio de alta afinidad tendrá solo un impacto moderado en la duración promedio de la unión. Por lo tanto, el mecanismo de reenlace puede explicar por qué la mutación de los fosfositos RTK que se predice que se unirán específicamente a dominios SH2 particulares tuvo un efecto relativamente pequeño sobre la señalización aguas abajo. Fue solo cuando se eliminaron todos los sitios y se volvieron a agregar fosfositos individuales que se pudieron observar efectos específicos sobre la señalización aguas abajo (28, 29).

Finalmente, estos resultados subrayan la importancia de la agrupación de receptores, ya que la estabilización cinética de la interacción SH2 / p-Tyr depende de una alta densidad local de sitios fosforilados. La agrupación de receptores puede afectar aún más el resultado aguas abajo del proceso de señalización (30). Por ejemplo, se propuso (31) que en las células T, la asociación prolongada ligando / receptor suprime el & # x0201cnoise & # x0201d de la activación del receptor adventicio (un mecanismo cinético de corrección de pruebas). De manera similar, el aumento del tiempo de permanencia de la proteína SH2 cerca de la membrana celular, junto con las altas tasas de desfosforilación in vivo (26), puede servir para amortiguar el ruido espurio asociado con la unión inespecífica de las proteínas SH2 a las moléculas de la membrana. Finalmente, debido a que las proteínas SH2 reclutadas no se asocian con un solo sitio p-Tyr, sino con & # x0201cglide & # x0201d sobre muchos sitios p-Tyr, la interacción química de dicha proteína SH2 con el sustrato o las moléculas efectoras en la membrana celular puede no seguir leyes cinéticas químicas simples. Los detalles de tales interacciones deberían ser un tema interesante de investigación futura.


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Los procesos de fabricación dependientes del tiempo conducen a una nueva clase de problemas inversos

El control de los procesos de fabricación de haces de energía dependientes del tiempo se ha logrado en el pasado mediante enfoques de prueba y error. Identificamos brechas de investigación clave y desafíos genéricos relacionados con problemas inversos para estos procesos que requieren un enfoque multidisciplinario de resolución de problemas para abordarlos. Los problemas genéricos que identificamos tienen una amplia gama de aplicaciones en el control algorítmico de los procesos de fabricación modernos.

Durante milenios, la principal forma de fabricar objetos ha sido utilizar herramientas sólidas diseñadas para un trabajo específico. El principio de modelado más común es simple: mueva una herramienta sólida para que, según algunos principios mecánicos, se elimine material de la pieza de trabajo. Por tanto, existe una dependencia geométrica directa entre el movimiento de la herramienta y la forma del objeto creado. Incluso las máquinas herramienta sofisticadas controladas numéricamente utilizan este principio básico.

Otros procesos de fabricación que utilizan herramientas que, geométricamente, no están completamente definidas de manera determinista (es decir, herramientas dependientes del tiempo) también se han abierto camino en las líneas de producción. En estos procesos, la herramienta toma la forma de un flujo de energía que emana de una fuente (por ejemplo, láser, pistola de iones, chorro de fluido), que llamaremos procesos de haz de energía (EBP). Estas herramientas dependientes del tiempo se pueden utilizar para dar forma a materiales que no se pueden procesar con precisión mediante métodos convencionales. A diferencia de las herramientas convencionales, la forma y la magnitud de las huellas de EBP (tasa de eliminación / deposición de material y / o tasa de transformación de material en la intersección entre la viga y la pieza de trabajo) dependen no solo de la trayectoria de la herramienta, sino también del tiempo de exposición y del flujo de energía. Además, el flujo de energía depende de la geometría del haz, que varía con la configuración del proceso (por ejemplo, pérdidas de energía entre la fuente y el objetivo). Por tanto, el control de las herramientas dependientes del tiempo para generar formas libres es muy difícil en comparación con los procesos que utilizan herramientas tradicionales independientes del tiempo. Para hacer piezas usando EBP, el haz se mueve a lo largo de una ruta predefinida para convolucionar la huella de energía con la pieza de trabajo, y cualquier variación en el tiempo de permanencia de la huella da como resultado errores en la geometría de la pieza. Tenga en cuenta que la huella no suele ser espacialmente uniforme y cambia con la orientación a la superficie de destino.

Tomar una trayectoria de herramienta predefinida y predecir la superficie resultante es el problema directo en los EBP, que ha sido ampliamente documentado; esto generalmente se combina con prueba y error para lograr la geometría requerida. Sin embargo, el verdadero desafío, y el enfoque correcto, es abordar el problema inverso, es decir, para una geometría de pieza determinada, determinar una ruta que minimice los errores en su generación mediante un algoritmo de optimización. Solo se han realizado investigaciones muy limitadas en este campo.

Nuestro objetivo aquí es difundir a la comunidad científica en general esta oportunidad de estudiar un nuevo y desafiante conjunto de problemas, que requiere un enfoque interdisciplinario. Creemos que la falta de investigación sobre estos problemas inversos se debe a la dificultad de formular con precisión el problema directo para tener en cuenta la dependencia del tiempo de la huella energética y su efecto sobre el material de la pieza de trabajo y, posteriormente, abordar el problema inverso.

Aunque se han explorado bien los problemas inversos en la ingeniería general (por ejemplo, transferencia de calor, acústica), los relacionados con los procesos de fabricación dependientes del tiempo son nuevos porque implican la optimización de los movimientos de múltiples pasadas de la fuente de energía en relación con la pieza de trabajo objetivo. Sin embargo, ha habido algunos avances recientes. Por ejemplo, en el micromaquinado de chorro abrasivo, Lari y Papini (1) estudiaron el problema inverso como la solución de una ecuación integral (ver también ref.2) para determinar la velocidad de alimentación para la generación de formas periódicas superficiales y en forma de W basadas en caminos rectos superpuestos para una huella de haz gaussiano. Para las huellas no gaussianas, se utilizó un método de aproximación basado en el modelado del haz como fuente puntual. En el grabado con plasma atmosférico, Dai et al. (3) se ocupó de la dependencia no lineal de la tasa de remoción de material en el tiempo de permanencia al considerar un método iterativo pulsado anidado para evaluar y corregir la no linealidad variable en el tiempo del proceso y permitir el mecanizado de geometrías de cavidades en sílice fundida. En superficies ópticas, Beaucamp y colaboradores (4) mostraron cómo las estrategias de autoplanificación de la ruta de paso variable, respaldadas por un modelo lineal simple para la eliminación de material, pueden usarse para mejorar la uniformidad de una superficie pulida. En el mecanizado con haz de iones, una solución aproximada del problema inverso implica variar el tiempo de permanencia del haz en cada píxel de la superficie requerida (5). Sin embargo, esto no tiene en cuenta los efectos no lineales y, si bien es una estrategia de inicio plausible, para esta PBE, demostramos (6) cómo resolver el problema inverso para un modelo más sofisticado utilizando un algoritmo de descenso más pronunciado puede mejorar significativamente la precisión de grabado de forma libre con esta herramienta.

En los últimos años, hemos definido una serie de problemas directos e inversos para los procesos de fabricación de haces de energía, que van desde el mecanizado abrasivo y por chorro de agua simple (2) hasta el micromaquinado láser (7) y el mecanizado por haz de iones enfocado (6), con un sistema unificado. descripción dada en la ref. 8. Si definimos la superficie de la pieza de trabajo como r = R (α, β, t), donde α y β parametrizan la superficie y t es el tiempo, la ecuación de evolución de la superficie bajo la acción de la viga es n · d R dt = (n. k) E, donde n (α, β, t) es la unidad exterior normal a la superficie, k (t) es un vector unitario en la dirección del eje de la viga, E (r , θ, t, R p) es la tasa de remoción de material, r y θ parametrizan la posición dentro del haz, y p es un vector de parámetros que caracterizan la dinámica de cómo la energía es entregada por el haz. La ecuación de evolución debe resolverse sujeto a r = R 0 cuando t = 0 para 0 & lt t & lt T.

En el problema directo, los parámetros de control, p (la trayectoria del haz, la orientación y posiblemente la tasa de salida de energía y el tiempo de proceso, T), se especifican y se calcula la superficie final, R (α, β, T), que se observará en la práctica.

En el problema inverso, buscamos parámetros, p, que minimicen ‖ R (α, β, T) - R 1 (α, β) ‖, donde R 1 (α, β) especifica la superficie objetivo a crear y ‖. ‖ Es una norma apropiada (una suma ponderada con T se puede utilizar para minimizar el tiempo de proceso). En un modelo tan simple como este, toda la física se incluye en la función de tasa de remoción de material, E (r, θ, t, R p).

Problemas como este se encuentran en la amplia categoría de optimización restringida por ecuaciones diferenciales parciales. Aunque se trata de una amplia área de investigación, el uso de técnicas de este campo en la ingeniería de fabricación no es común. No discutimos el efecto del ruido del proceso y formulamos el modelo en términos de una ecuación diferencial parcial, pero tenga en cuenta que modelar la eliminación de material como un proceso aleatorio hace que los problemas directos e inversos sean más desafiantes matemáticamente y es un área que se beneficiaría de un mayor desarrollo ( 9).

Además, podemos formular un conjunto de nuevos problemas que presentan una amplia gama de desafíos, requieren un enfoque interdisciplinario y van mucho más allá de los procesos de eliminación y acumulación. La siguiente es una clasificación simple y una lista no exhaustiva de procesos de fabricación que utilizan herramientas dependientes del tiempo y requieren consideración de los problemas inversos asociados (Fig.1):

• Eliminación de material: mecanizado por rayo láser, chorro de agua / chorro de aire abrasivo, haz de iones enfocado, haz de electrones, electrochorro, electrodescarga y ultrasonido

Los principios de eliminación de material varían significativamente (vaporización, abrasión mecánica, transferencia de cantidad de movimiento de partículas, disolución química, erosión por chispa) pero tienen en común una huella de eliminación de haz de energía con particularidades en la forma y el comportamiento (p. Ej., Redeposición de la masa fundida, deformación plástica, pérdida de energía). debido a la reflexión / absorción).

• Modificación de material / superficie: granallado mecánico o láser, pulido con láser, tratamiento térmico localizado / selectivo

No se agrega ni quita material, pero el haz de energía modifica las propiedades (generalmente superficiales) de la pieza de trabajo por medios mecánicos o térmicos para alterar las propiedades mecánicas (por ejemplo, dureza, tensiones residuales) o componentes microestructurales de la pieza.

• Acreción de material: deposición directa de metal, recubrimiento por pulverización, deposición fundida

El haz de energía deposita materiales similares o diferentes en la pieza de trabajo, y los principios están relacionados principalmente con la transferencia de energía a partículas individuales que interactúan con el material base a través de diferentes mecanismos físicos (por ejemplo, transporte de masa, calor y / o momento) y resultados. en huellas de deposición que se ven afectadas por efectos secundarios específicos del proceso (por ejemplo, partículas antiadherentes, porosidad del material depositado).

• Consolidación de materiales: sinterización selectiva por láser, fusión por haz de electrones

Este es un grupo genérico de procesos de fabricación aditiva de lecho de polvo en el que el haz de energía provoca la consolidación local de grupos de partículas. Cada proceso está influenciado por el tiempo de permanencia y la distribución de energía del haz y conduce a propiedades microestructurales y mecánicas únicas del componente generado.

• Procesos híbridos: láser / ultrasónico / asistido por plasma

El haz de energía se utiliza junto con otro proceso que puede no depender del tiempo (p. Ej., Cortar) o depender del tiempo (p. Ej., Mecanizado por descarga eléctrica). El rayo de energía se coloca delante o exactamente en la posición donde ocurre el proceso principal. El objetivo es mejorar el proceso de eliminación básico. En el caso de dos procesos de tiempo de permanencia acoplados gobernados por diferentes fenómenos, la solución del problema inverso asociado es particularmente desafiante.

Una clasificación condensada de EBP para modelado inverso.

Como ejemplo de un proceso híbrido, hemos demostrado recientemente (10) que mediante el uso de un rayo láser que escanea delante de una herramienta de fresado en una trayectoria obtenida al resolver el problema inverso, las fuerzas de corte se pueden reducir en aproximadamente un 50%. Esto permite un aumento significativo en la tasa de remoción de material.

En cada uno de los ejemplos anteriores, los parámetros del haz de energía deben determinarse de manera inversa para lograr los resultados requeridos del proceso. Es probable que el estudio de estos conjuntos de problemas inversos revolucione la forma en que se planifican y controlan las PBE, eliminando el enfoque de "artesanía". En particular, es probable que surjan paquetes diseñados específicamente para procesos que dependen del tiempo para reemplazar el uso actual de sistemas de diseño / fabricación asistidos por computadora, que están diseñados para máquinas herramienta tradicionales y no son adecuados para su propósito.


Tenemos una colección de ubicaciones de usuarios en tiempo real desde nuestra aplicación. Cada registro contiene la longitud, la latitud y la hora a la que se capturó la ubicación geográfica. ¿Cómo puedo calcular el tiempo de permanencia en el lugar fijo de un usuario a partir de estos datos?

Cosas para considerar al recolectar los datos:

Si está utilizando una biblioteca como: react-native-mauron85-background-geolocation y Ionic Framework, debe configurar el radio estacionario para definir un área dentro de la cual el dispositivo que informa su ubicación se considera estacionario.

Cuando hay obstrucciones y superficies reflectantes, es probable que haya recepción de múltiples rutas. Las señales llegan al receptor en momentos ligeramente diferentes y, según la señal que el receptor elija creer para una muestra determinada, la distancia desde el satélite también difiere. Multiplique este comportamiento por varios satélites, luego factorícelo en el cálculo de la posición general, y el resultado neto es que el receptor percibe cambios abruptos en la posición. A veces, estos pueden ser significativos, digamos 40 o 50 pies.

El software de nivel superior en el receptor intenta suavizar esto. En términos generales, hace un mejor trabajo cuando el rastreador se está moviendo. Esto se debe a que su verdadero cambio de posición por unidad de tiempo es mucho mayor que los cambios aleatorios causados ​​por la recepción de múltiples rutas.

Puede promediar la posición informada durante un período de tiempo para obtener un círculo dentro del cual es probable que se encuentre el dispositivo. El uso de información secundaria como la dirección IP y el posicionamiento WiFi puede proporcionar información adicional para reducir el adivinar más rápido. Consulte también: Tecnologías inalámbricas.

Aquí hay un ejemplo que le muestra dónde está utilizando la API de geolocalización de Mozilla, haga clic en "Ejemplo en vivo de geolocalización" y dé permiso para compartir su ubicación (no con nosotros en SE, con Mozilla).

Una vez que tenga datos bastante precisos, es simplemente una cuestión de definir un radio y un tiempo mínimo de permanencia (que sería un promedio móvil).

Si se mueven rápido, una permanencia más corta es una pausa, mientras que a una velocidad más lenta no se produciría una pausa hasta un período de tiempo más largo.

El modelado matemático avanzado es necesario para analizar un mejor resultado y no confundirse con los meandros y el retroceso.


Abstracto

La espectroscopia de sujeción por fuerza es una técnica novedosa para estudiar la mecanoquímica a nivel de enlace simple. Los eventos de reducción de enlaces disulfuro individuales se detectan con precisión a medida que aumenta gradualmente la longitud de las poliproteínas que contienen enlaces disulfuro y que se estiran a una fuerza constante con el voladizo de un microscopio de fuerza atómica (AFM). La cinética de esta reacción se ha medido a partir de ajustes exponenciales simples para promedios de conjuntos de los eventos de reducción. Sin embargo, los ajustes exponenciales son notoriamente ambiguos de usar en casos de datos cinéticos que muestran múltiples vías de reacción. Aquí presentamos una técnica de análisis de tiempo de permanencia, de uso generalizado en el campo del canal iónico único, que aplicamos al examen de la cinética de reducción de los enlaces disulfuro medidos a partir de trazas de espectroscopía de sujeción de fuerza de una sola molécula. En esta técnica, los datos de tiempo de permanencia distribuidos exponencialmente se trazan como un histograma con una escala de tiempo logarítmica y una raíz cuadrada ordenada. La ventaja de los histogramas logarítmicos es que los tiempos de permanencia distribuidos exponencialmente aparecen como picos bien definidos en la distribución, lo que mejora en gran medida nuestra capacidad para detectar múltiples vías cinéticas. Aplicamos esta técnica para examinar la distribución de los tiempos de permanencia de 4488 eventos de reducción del enlace disulfuro simple medidos en presencia de dos tipos muy diferentes de agentes reductores: clorhidrato de tris- (2-carboxietil) fosfina (TCEP) y la enzima tiorredoxina (TRX). . Se utiliza una fuerza de sujeción diferente para cada agente reductor para obtener distribuciones de los tiempos de permanencia en una escala de tiempo similar. En el caso de TCEP, el histograma logarítmico de tiempos de permanencia mostró un solo pico, correspondiente a un solo mecanismo de reacción. Por el contrario, experimentos similares realizados con TRX mostraron dos picos bien separados, marcando dos modos distintos de reducción química que operan simultáneamente. Estos experimentos demuestran que las técnicas de análisis del tiempo de permanencia son un método poderoso para estudiar reacciones químicas a nivel de una sola molécula.


Ver el vídeo: TIEMPO DE VACIADO DE TANQUES CON ECUACIONES DIFERENCIALES (Diciembre 2022).