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¿Cómo confirmar la formación de la estructura secundaria del miARN precursor en gel?

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Quiero doblar el precursor-miARN en su estructura secundaria y luego confirmarlo en gel. Al principio, lo caliento en tampón de recocido a 95 ° C durante 5 minutos y lo enfríe lentamente. Luego lo ejecuto en gel, pero las muestras están en la misma posición que la dilución original.


Descargo de responsabilidad: aunque he intentado transferencias Northern para miARN, en realidad no he realizado el tipo de experimento del que estás hablando.

Primero que nada necesitas controles.

  1. Un control negativo: un ARN de la misma longitud que no se pliega (puede introducir algunas mutaciones en su secuencia de pre-miARN para interrumpir el emparejamiento de bases). Puede utilizar las herramientas de predicción de la estructura secundaria de miARN para diseñar racionalmente dichos controles.
  2. Un control positivo: quizás un pre-miARN plegado que está reticulado. Francamente, no me he encontrado con nadie que utilice tales agentes de reticulación para estudiar la estructura secundaria del ARN. Sin embargo, había visto algunos artículos antiguos sobre este tema (Wagner y Garrett, 1978, Rabin y Crothers, 1979). También puede probar algunas condiciones (concentraciones de sal, etc.) en las que el ARN se plegará (estudiado mediante ensayos biofísicos).

Ahora, no puede utilizar geles de agarosa. Necesitaría geles largos de poliacrilamida ~ 15%. También debe utilizar los búferes adecuados. 0.5-1x TBE supuestamente funciona. Es posible que desee analizar su muestra en dos condiciones: desnaturalizante (con urea 8 M) o no desnaturalizante. Puede consultar este protocolo (Petrov et al. 2013).

Su control positivo debería migrar más rápido que el control negativo. Si su ARN está plegado (total o parcialmente), debería migrar entre los controles positivo y negativo en el gel no desnaturalizante. En el gel desnaturalizante, su ARN debe migrar al mismo nivel que el control negativo. El control positivo (si funciona) no debería verse afectado por la urea.

Además, el gel se calienta durante la electroforesis, lo que a su vez puede dentar el ARN. Es posible que desee ejecutar el gel no desnaturalizante en la cámara fría.

Habiendo dicho todo esto, le aconsejaría que en lugar de poner tanto esfuerzo en un ensayo basado en gel, pueda usar equipos más sensibles para estudiar el plegamiento del ARN. Hay muchos estudios biofísicos sobre in vitro Plegamiento de ARN. Puedes echarles un vistazo.


Diseño basado en secuencia de pequeñas moléculas bioactivas que se dirigen a microARN precursores

Los oligonucleótidos están diseñados para dirigirse al ARN utilizando reglas de emparejamiento de bases, pero pueden verse obstaculizados por un suministro celular deficiente y una estimulación inespecífica del sistema inmunológico. Se prefieren moléculas pequeñas como fármacos principales o sondas, pero no se pueden diseñar a partir de la secuencia. En este documento, describimos un enfoque denominado Inforna que diseña moléculas pequeñas de plomo para ARN a partir de una única secuencia. Inforna se aplicó a todos los precursores de horquilla de microARN humanos e identificó pequeñas moléculas bioactivas que inhiben la biogénesis al unirse a los sitios de procesamiento de nucleasas (44% de tasa de aciertos). Entre las 27 interacciones de plomo, la interacción más ávida es entre un benzimidazol (1) y precursor microARN-96. Compuesto 1 inhibe selectivamente la biogénesis del microARN-96, regula al alza una proteína diana (FOXO1) e induce la apoptosis en las células cancerosas. La apoptosis se elimina cuando FOXO1 La expresión de ARNm es anulada por un ARNip, validando la selectividad del compuesto. De manera notable, el perfil de microARN muestra que 1 sólo afecta a la biogénesis del microARN-96 y es al menos tan selectivo como un oligonucleótido.


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INTRODUCCIÓN

Durante la última década, la caja de herramientas de la biología sintética se ha llenado con una plétora de diferentes partes y dispositivos genéticos para la manipulación de la función celular (revisado en (1,2)). Sin embargo, la aplicabilidad de muchos de estos componentes básicos todavía está poco explorada. Se sabe aún menos acerca de la modularidad genética y la portabilidad de las herramientas individuales, descuidando así el gran potencial de la combinación de diferentes estructuras para producir elementos intercambiables. La naturaleza flexible de los sistemas basados ​​en ARN, en particular, permite combinaciones modulares de un riborregulador con prácticamente cualquier otro marco de ARN sintético o derivado de forma natural, a pesar del hecho de que los bloques de construcción individuales pueden tener funciones completamente diferentes. Aunque se han publicado varios intentos exitosos que demuestran la expresión génica condicional con dispositivos de ARN sintético (revisado en (2,3)), los principales inconvenientes son el repertorio limitado de partes genéticas adecuadas o la falta de integración de partes existentes de diferentes fuentes en marcos sólidos. (4). La gran mayoría de los sistemas de regulación bien caracterizados están diseñados para su uso en bacterias y eucariotas inferiores. Sin embargo, aún queda por acceder a todo el potencial de los reguladores basados ​​en ARN para aplicaciones en células de mamíferos (5).

Varios estudios recientes se han centrado en la importancia de los ARN pequeños no codificantes para la regulación de genes eucariotas y han revelado un papel importante para varios procesos biológicamente relevantes (revisado en (6)). Para profundizar en el conocimiento sobre estas moléculas y sus respectivas funciones, el repertorio de métodos y herramientas existentes debe adaptarse a las características específicas del objetivo de investigación individual. Tales configuraciones experimentales se beneficiarían del uso de sistemas conmutables que brinden control sobre la abundancia del ARN respectivo para investigar su relevancia fisiológica. Los microARN (miARN) son los principales candidatos para el desarrollo de tales sistemas intercambiables. Esta clase de ARN no codificantes impacta en el silenciamiento génico postranscripcional en eucariotas en un proceso llamado interferencia de ARN (revisado en (7)). Al actuar sobre la traducción y la estabilidad del ARNm, los miARN influyen en la funcionalidad de al menos el 60% de los genes codificadores de proteínas humanas (8). Por lo tanto, las mutaciones de secuencia, así como los cambios en la abundancia de miARN, a menudo conducen a un mal funcionamiento genético y pueden resultar en una apariencia fenotípica (9). Además, los miARN se han identificado como causantes de diversas enfermedades y muestran una marcada especificidad tisular. En consecuencia, son candidatos ideales para el diagnóstico y tratamiento precoces relacionados con biomarcadores (10). Hasta ahora, se han catalogado 2500 miARN humanos (miRbase, versión 21, http://mirbase.org/), y la mayoría de sus objetivos y funciones relacionadas aún se desconocen. A la luz del especial interés en la función de miARN y su participación en la patogénesis, el desarrollo de una herramienta específica y universal para la regulación de la biogénesis de miARN de una manera dependiente de ligando proporcionará un dispositivo útil para investigar el impacto de los miARN en células (mal )función.

Debido a su importancia para la regulación génica postranscripcional, la biogénesis de miARN debe regularse estrictamente para garantizar una cantidad adecuada de miARN funcional. La biogénesis de los miARN implica dos pasos de procesamiento consecutivos para escindir el miARN maduro de una transcripción primaria más larga (pri-miARN) (revisado en (7)). Drosha y Dicer, los dos componentes clave de la maquinaria de procesamiento, junto con sus factores auxiliares, operan con criterios de reconocimiento de sustratos conservados que deben cumplirse para el procesamiento exitoso del miARN. Para el segundo paso de maduración, realizado por el RNase III Dicer, son relevantes tanto la secuencia del miRNA precursor (pre-miRNA) como las propiedades de su bucle terminal (11,12). Dicer actúa como una & # x02018 regla molecular & # x02019, por lo que la longitud de la región bicatenaria en el pre-miARN y la formación de la estructura típica en horquilla también contribuyen al reconocimiento y procesamiento preciso (9,12 & # x0201314). Una modificación estructural en el pre-miARN a menudo va acompañada de una escisión imprecisa o deficiente, lo que resulta en una región semilla alterada o en una pérdida total del miARN maduro (12,15). En consecuencia, el diseño y la implementación exitosos de una herramienta de miARN parcialmente sintética debe cumplir dos requisitos: el elemento conmutable incorporado debe parecerse a la estructura original del sistema natural y, al mismo tiempo, debe permitir una regulación robusta dependiente del ligando. Por lo tanto, la flexibilidad estructural y el tamaño bastante pequeño de un aptámero de ARN lo hacen ideal para servir como un sensor robusto y un dominio actuador. Los aptámeros son oligonucleótidos altamente estructurados que exhiben una unión de alta afinidad a una molécula diana específica (revisado en (16)). los de novo La selección de un aptámero a través de SELEX (E volución sistémica de ligandos por enriquecimiento exponencial) se puede realizar contra prácticamente cualquier tipo de ligando, desde moléculas pequeñas sobre proteínas hasta estructuras celulares más complejas (revisado en (17)).

Para configurar una plataforma para el procesamiento de pre-miARN controlado por aptámeros, es deseable tener un sistema que permita el cambio reversible en escalas de tiempo biológicamente relevantes. Entre los muchos pares de aptámero-ligando existentes, el aptámero de unión al Represor de Tet (TetR) derivado de SELEX y la proteína TetR constituyen una base ideal para el diseño y la implementación de un interruptor de miARN reversible. El aptámero se ha identificado en una combinación in vitro y en vivo enfoque de selección y se une a TetR con una afinidad de unión extremadamente alta (18). La afinidad de TetR por el aptámero y el tetO el ADN del operador son iguales (19). La unión de tetraciclina (tc) o doxiciclina (dox), un análogo estructural de tc, a TetR provoca un cambio conformacional en el núcleo de la proteína TetR que a su vez compromete la unión al aptámero (19), lo que permite la unión reversible del ligando. Tanto la naturaleza de ese sistema de combinación de ARN / proteína / molécula pequeña como las propiedades farmacocinéticas adecuadas de los ligandos tc y dox son ideales para su uso en células de mamíferos y en la regulación de la biogénesis de miARN (20).

La aplicabilidad del sistema aptámero TetR en diferentes organismos ya ha sido confirmada por varios enfoques. La publicación original demostró el uso exitoso del aptámero TetR para controlar la expresión génica en Escherichia coli (18). A continuación, se ilustraron la portabilidad y la aplicabilidad más amplia del sistema con su uso exitoso en el protozoo. Plasmodium falciparum y en levadura (21,22). Además, se agregó una capa adicional de regulación al sistema aptámero TetR con el diseño de un interruptor sensible a moléculas pequeñas que demostró ser funcional en mamíferos (23). Estos enfoques destacan la naturaleza universal y la adaptabilidad del sistema aptámero TetR.

La mayoría de los enfoques para controlar la interferencia de ARN hasta la fecha se han centrado en shRNA modificados para el desarrollo y la implementación de herramientas. La ingeniería de una estructura compleja relacionada con miARN presenta un desafío considerable debido a la fuerte dependencia de los criterios de reconocimiento de sustratos conservados para el procesamiento. A diferencia de los pre-miRNA naturales, los shRNA presentan un tallo perfectamente hibridado rematado con un bucle corto (24). Esta estructura secundaria sin complicaciones es fácilmente accesible para (i) un rediseño específico que coincida virtualmente con cualquier secuencia objetivo, y (ii) a un en silico predicción de los sitios de escisión de Dicer. La modificación de una estructura de ARNhc no requiere seguir las estrictas reglas de procesamiento que se aplican a los pre-miARN naturales. Por lo tanto, se pueden eludir los problemas asociados con la ingeniería de las estructuras considerablemente más complejas que se encuentran en los pre-miARN naturales. La fusión de la in vitro El aptámero de teofilina seleccionado con un ARNhc permitió la regulación del procesamiento de Dicer y facilitó el control sobre GFP o los niveles de albúmina humana de una manera dependiente del ligando (25). En un enfoque comparable, varios aptámeros junto con cadenas competidoras se integraron en estructuras de bucle de ARNhc que afectan el procesamiento de los ARNhc respectivos mediante el cambio dependiente de ligando entre dos conformaciones estructurales (26). Además, se ha demostrado que los motivos de unión a proteínas para la proteína U1A humana y L7Ae, o el aptámero de unión a p50 posicionado en la región del bucle de shRNA regulan el procesamiento de shRNA por Dicer (27, 28). En otro diseño, se integraron aptámeros de unión a proteínas o moléculas pequeñas en el segmento basal de un pri-miRNA sintético que lleva un siRNA. Imitando un pri-miRNA, se controló el procesamiento de Drosha, lo que resultó en un control dependiente del ligando sobre GFP expresión (29,30).

Las herramientas anteriores proporcionan valiosos estudios de prueba de concepto. Sin embargo, se construyeron sobre la base de estructuras de ingeniería no naturales y aún sufren de rangos dinámicos bajos y falta de flexibilidad regulatoria. Además, la aplicabilidad de las herramientas basadas en shRNA para la regulación de genes es limitada, es decir, se dirigen a una secuencia específica, mientras que los miRNA son capaces de unirse a varios sitios de unión. La interferencia de ARN es cada vez más popular como método de elección para el análisis funcional y el silenciamiento de genes. En consecuencia, existe una necesidad creciente de herramientas de interferencia robustas y fiables (31). Hasta ahora, no se ha demostrado la modificación de un miARN natural que resultó en una regulación eficiente de los niveles de miARN maduros.

Aquí, proponemos un enfoque para la regulación de sistemas de miARN naturales. Con nuestro dispositivo basado en ARN, buscamos crear una unidad de conmutación universal y reversible que consta de un componente aptámero sintético como un dominio de detección de ligando acoplado a un pre-miARN natural para permitir la abundancia de miARN controlada por ligando (Figura & # x200B (Figura 1 ). 1). En nuestro sistema, el aptámero TetR reemplaza el bucle terminal natural del pre-miR de una manera que podría emplearse universalmente para diferentes miARN. El aptámero está conectado al tallo del pre-miRNA a través de un módulo de comunicación, reteniendo así el procesamiento del pre-miRNA mientras que simultáneamente hace que el sistema dependa del ligando y sea reversible. Con nuestro interruptor pre-miR, proporcionamos una herramienta de aplicación universal que suprime de manera eficiente el procesamiento de miARN con un rango dinámico de 40 a 140 veces en la unión de TetR. La represión se alivia completamente con la adición de dox. Por lo tanto, proporcionamos la primera evidencia de la biogénesis controlada de tres miARN diferentes utilizando un sistema de regulación basado en ARN sintético novedoso, versátil y flexible en mamíferos.


Discusión

Dicer o sus análogos son elementos indispensables de todas las vías de ARNi. No hay duda de que la regulación precisa de estas vías, incluida la regulación de todas las proteínas implicadas, es un proceso muy complejo. Recientemente, se han identificado varios reguladores potenciales de la actividad de Dicer. Se demostró que los compuestos de unión a cuádruplex (porfiricinas y compuestos de bisquinolinio) pueden inhibir la digestión mediada por Dicer de precursores de ARNip ricos en guanosina [34]. Ma et al. informó que un dominio de helicasa putativo de Dicer puede ejercer un efecto autoinhibidor sobre esta enzima [35]. Lima y col. demostraron que el Dicer humano puede interactuar con diferentes regiones de transcripciones de ARN y unirse a moléculas de ARN de cadena simple y doble [36]. También se ha informado de que los adenovirus protegen sus ARN al producir una gran cantidad de transcripciones autocomplementarias largas, que compiten de manera efectiva por la unión de Dicer con otras moléculas. Como resultado, las transcripciones virales restantes están protegidas de la escisión [37]. Recientemente, se ha demostrado que las moléculas de ARN pueden interferir con la maduración de miARN secuestrando la ARNasa III Drosha, que es otra enzima involucrada en la biogénesis de miARN [38]. Sin embargo, hasta la fecha no ha habido informes que demuestren que las moléculas de ARN puedan dirigirse selectivamente tanto a los precursores de miARN como a Dicer y así regular la maduración de miARN individual. En nuestros estudios, identificamos oligómeros de ARN que actuaban como reguladores bifuncionales. Estos oligómeros afectaron específicamente la maduración de miR-210 uniendo tanto Dicer como pre-miR-210 (Figuras 1, & # x200B, 2, 2, & # x200B, 3, 3, S1 y S2). Más específicamente, además de vincular a Dicer, actuaron como sui generis antagomiR, es decir, moléculas de ARN cortas que se unen a los miARN e inhiben su correcto funcionamiento [39]. En nuestro caso, sin embargo, estábamos tratando con antagopre-miR, es decir, moléculas de ARN cortas que interactúan con los pre-miARN y previenen la formación de miARN.

Uno de los ejemplos más estudiados de la regulación selectiva del procesamiento de pre-miRNA involucra a la proteína de unión a RNA Lin28 y al pre-miRNA let-7 [29], [30], [40], [41]. Lin28 puede secuestrar miARN pre-let-7 para prevenir el procesamiento mediado por Dicer. Se demostró que Lin28 se une directamente a pre-let-7, presumiblemente a través del reconocimiento específico del bucle terminal de pre-miRNA let-7. Piskounova y col. demostraron que un residuo de citosina conservado en el bucle de pre-let-7 g es esencial para la unión de Lin28 [42]. Por el contrario, Heo et al. enfatizó el papel de un motivo de secuencia de tetra-nucleótidos (GGAG) presente en el bucle terminal de pre-let-7 en la unión selectiva de Lin28 a este precursor [43]. Los autores demostraron que Lin28 recluta una uridilil transferasa terminal (TUTase) en el pre-let-7. Esta polimerasa no canónica agrega una cola de oligouridina al pre-let-7, evitando así que Dicer procese eficientemente el precursor modificado. El ARN poliuridilado se degrada posteriormente y, en consecuencia, se observa el agotamiento de miARN let-7. Por el contrario, otra proteína de unión a ARN, la proteína reguladora de empalme de tipo KH KSRP, promueve la maduración de ciertos pre-miARN, por ejemplo, pre-let-7a-1 [31]. Trabucchi y col. encontraron que uno de los dominios KSRP reconoce un tramo corto rico en G presente en el bucle terminal de pre-let-7a-1a con alta especificidad y afinidad. También demostraron que KSRP puede funcionar como un componente de los complejos Drosha y Dicer. Además, al unirse a los bucles apicales de ciertos precursores de miARN, KSRP participa en el transporte nucleocitoplasmático de pre-miARN dirigidos por la exportina-5. Sobre la base de los experimentos de inmunoprecipitación, los autores designaron dos grupos de precursores de miARN, los asociados con complejos de procesamiento que incluyen KSRP y los asociados con complejos que carecen de KSRP. Curiosamente, Michlewski et al. demostraron que hnRNP A1, la proteína de unión al ARN involucrada en muchos aspectos del procesamiento del ARN, puede unirse al bucle terminal de estos precursores de miARN, cuyo procesamiento no se ve afectado por KSRP [44]. Estos autores plantearon la hipótesis de que existe un grupo de precursores de miARN con bucles apicales conservados y que su procesamiento depende en gran medida de la unión de factores auxiliares (como hnRNP A1) a este elemento estructural conservado. Una de esas moléculas específicas es un precursor de miR-18a. Michlewski y col. informó que los oligonucleótidos complementarios al bucle terminal conservado del precursor de miR-18a abolieron selectivamente su procesamiento. Por el contrario, los oligonucleótidos que se dirigen a los bucles terminales no conservados de los precursores de miR-16-1 y -27a no afectaron a la maduración de estos miARN. Los autores sugirieron que hnRNP A1 no es esencial para el procesamiento de precursores de miARN que portan bucles terminales no conservados, como miR-16-1 y -27a.

Los estudios anteriores se concentraron en proteínas que participan en la regulación de la maduración de miARN. Nuestros estudios se centraron en la cuestión de si las moléculas de ARN también pueden modular el procesamiento de pre-miARN individuales. No consideramos la conservación de los precursores de miARN, sino que examinamos si los pre-miARN exhibían estructuras secundarias que pueden ser accesibles para interacciones con otras moléculas de ARN. De acuerdo con los datos publicados, demostramos que las regiones del bucle terminal son importantes para controlar el procesamiento de miARN por Dicer. De hecho, esta región de precursores de miARN puede servir como plataforma de unión para Dicer [45] y otros factores auxiliares involucrados en la maduración de miARN [31], [42], [44]. Demostramos que los oligonucleótidos de ARN dirigidos a fragmentos apicales de pre-miR-21, -33a y -210 afectaron su procesamiento por Dicer (Figs. 2 y & # x200B y3). 3). Sin embargo, también observamos que el oligómero de ARN complementario a la región del bucle terminal del precursor de miR-16-1 solo influyó débilmente en la maduración de este miARN (Fig. 3). Este resultado es consistente con las observaciones de Michlewski et al., Quienes informaron que los oligonucleótidos dirigidos al bucle terminal del precursor de miR-16-1 (pri-miR-16-1) no bloquearon la formación de miR-16-1 maduro. Michlewski y col. postuló que el procesamiento del precursor de miR-16-1 no se vio afectado por los oligonucleótidos complementarios porque carece de un elemento estructural conservado y, en consecuencia, no es reconocido por factores auxiliares. Nuestros resultados indican que la composición de nucleótidos del fragmento apical del precursor de miR-16-1 (secuencia rica en AU) puede ser responsable del efecto observado. Una secuencia rica en AU no puede formar un dúplex estable con un nucleótido complementario de 12 nt (Figuras 3 y & # x200B y 4). 4). Por tanto, este último no puede inhibir eficazmente el procesamiento de este pre-miRNA. Cuando aplicamos oligómeros de ARN que eran complementarios al otro fragmento parcialmente monocatenario de pre-miR-16-1, observamos un bloqueo más eficiente de la maduración de miR-16-1 (Fig. 5). En la actualidad, ninguna de estas explicaciones puede ser verificada o falsificada de manera inequívoca porque los estudios realizados por Michlewski et. Alabama. se refería al procesamiento de pri-miRNA mediado por Drosha en el núcleo, mientras que nuestra investigación se centró en la escisión de pre-miRNA mediada por Dicer, que se produce en el citoplasma. Además, se ha demostrado recientemente que los mismos precursores de miARN pueden ser dirigidos de manera diferente por factores casi idénticos en diferentes compartimentos celulares. Piskounova y col. informaron que aunque Lin28A y Lin28B bloquean selectivamente el mismo procesamiento de pre-miARN de let-7, y ambos tienen un alto grado de identidad de secuencia y organización de dominio conservada, actúan a través de diferentes mecanismos. Lin28A funciona en el citoplasma y Lin28B funciona en el núcleo [41]. También encontramos que los oligómeros AL-21 y 2OMe-AL-16-1 afectaron a la escisión del pre-miARN de manera diferente, aunque ambos son capaces de formar complejos con dúplex pre-miARN dirigidos con valores de Tm muy similares (Figs. 3B y & # x200B y4A). 4A). Estos resultados podrían indicar que la Tm del dúplex formado por el oligómero y el precursor de miARN no es el único factor que afecta la capacidad de un oligómero para reprimir el procesamiento de pre-miARN por Dicer. Aquí, mostramos que la accesibilidad de los precursores de miARN para unirse con otras moléculas también puede determinar el nivel de producción de miARN.

Para los pares pre-miR-16-1 / AL16-1_2 y pre-miR-21 / AL-21, observamos que los oligómeros inhibieron de manera similar el procesamiento de miARN en ambos sistemas probados (enzima comercial frente a extracto). Se observó un efecto diferente para otros dos pares examinados, pre-miR-33a / AL-33a y pre-miR-210 / AL-210. Observamos una inhibición marcadamente más débil de la formación de miARN en experimentos llevados a cabo en extractos citoplasmáticos que en los experimentos correspondientes realizados con Dicer comercial (Figuras 4A y & # x200B y6). 6). También notamos que en reacciones que carecen de un inhibidor (AL-33a o AL-210), la escisión del pre-miARN fue considerablemente menos eficiente en el sistema de extracto que en el sistema Dicer comercial. Obernosterer et al., Publicaron una observación similar, quienes postularon que los factores inhibidores específicos presentes en el citoplasma podrían unirse a precursores de miARN individuales y bloquear su conversión en miARN maduros [28]. Al parecer, observamos un fenómeno similar. Una hipótesis alternativa es que un factor no identificado interfiere con el oligómero, impidiendo su unión con el pre-miARN. Sin embargo, este no puede ser el caso porque también observamos una disminución del procesamiento de miARN en mezclas de reacción que carecen de un inhibidor en el sistema de extracto.

Basándonos en nuestras observaciones, podemos proponer una nueva estrategia para la regulación específica del precursor del procesamiento de miARN por Dicer (Fig. 7). El papel clave en esta estrategia lo desempeñarían moléculas de ARN cortas que sean capaces de interactuar con la enzima, el pre-miARN o ambos. Los datos recopilados indican que el procesamiento de miARN se puede regular a través de varios escenarios diferentes. En el primer escenario, el oligómero de ARN funciona como un competidor típico. Inhibe el procesamiento de miARN al interactuar con un bolsillo de unión al sustrato de Dicer. Sin embargo, en este escenario, Dicer no digiere el oligómero (Fig. 7, i). En el segundo escenario, el oligómero también funciona como un competidor, pero en este caso es escindido por la enzima. Además, uno de los productos de la escisión del oligómero por Dicer se une al pre-miARN y evita la digestión del precursor (Fig. 7, ii). En el tercer escenario, la aplicación de oligómeros muy cortos altera la estructura nativa de un precursor de miARN al interactuar con su fragmento apical. Dicer no reconoce ni digiere el complejo resultante (Fig. 7, iii). En el cuarto escenario, el oligómero también se hibrida con el precursor. En este caso, sin embargo, el complejo resultante es reconocido por Dicer y escindido, pero el patrón de escisión del precursor se altera y no se forma miARN funcional maduro (Fig. 7, iv). En todos estos casos, las interacciones impulsadas por la complementariedad son el factor clave responsable de la especificidad de la inhibición de la formación de miARN mediada por oligómeros.

Representación esquemática de una escisión estándar de pre-miARN por Dicer (Izquierda). Cuatro escenarios propuestos (i & # x02013iv) de la regulación mediada por oligoARN del procesamiento de miARN por Dicer. Los oligómeros que interactúan con Dicer se presentan como estructuras de tallo-bucle azul, y los oligómeros que no son capaces de interactuar con Dicer se presentan como líneas azules cortas. Una descripción detallada en el texto.

En nuestros experimentos, usamos in vitro-moléculas de ARN seleccionadas o diseñadas artificialmente. En consecuencia, nuestras observaciones pueden no reflejar las condiciones nativas. Sin embargo, existe una creciente evidencia de que el citoplasma contiene un amplio espectro de moléculas de ARN cortas que hipotéticamente pueden interferir con el procesamiento de miARN. Recientemente, se ha informado del descubrimiento de especies de ARN de 12 nt de longitud correspondientes a las regiones 5 & # x02032 de miARN, denominadas semi-miARN [46]. Se descubrió que estos pequeños ARN reguladores recientemente identificados modulan la actividad de los microARN de los que se derivan. Además, es cada vez más evidente que los intermedios estables de la degradación del ARN pueden acumularse en la célula y funcionar como moléculas de señalización o participar en los mecanismos que controlan las vías celulares [47], [48], [49], [50]. Sin embargo, se necesitan estudios más detallados para confirmar que estos ARN cortos influyen en la biogénesis de miARN. en vivo.


Conclusión

Utilizando todas las bases de datos de nucleótidos disponibles públicamente, se identificaron 682 miARN en 155 especies de plantas diversas. Al combinar el análisis de expresión con el enfoque computacional, encontramos que 6 miARN y 2 ARN pequeños que se han identificado solo en Arabidopsis hasta ahora, también se conservan en Brassica spp. Estos hallazgos serán útiles para rastrear la evolución de ARN pequeños al examinar su expresión en ancestros comunes de la Arabidopsis-Brassica linaje.


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Discusión

Numerous miRNAs have been previously shown to be repeat-derived [12], [19]–[21] and many snoRNAs have been described as retrogenes [16],[17]. Here, we hypothesize that some reported miRNAs have evolved from box H/ACA snoRNAs or snoRTs. Several lines of evidence support this possibility. Fourteen known box H/ACA snoRNAs encode smaller fragments of miRNA size that have been experimentally detected, three of which are reported miRNAs. Analysis of mammalian conservation patterns suggests that these genomic regions originally encoded the full-length H/ACA snoRNA molecules and not only the miRNAs. If a subgroup of miRNAs has indeed evolved from box H/ACA snoRNAs, we reasoned that although some of these miRNAs might have sufficiently evolved to no longer bear measurable similarity to H/ACA snoRNAs, others might display detectable H/ACA snoRNA features. In an effort to further characterise the prevalence of the relationship between these two classes of small RNA molecules, we scanned the regions encoding known miRNAs for the presence of box H/ACA snoRNA features using the snoGPS predictor. We identified twenty reported miRNAs from miRBase [25] that are encoded in larger regions predicted with high scores to be box H/ACA snoRNAs. The predicted box H/ACA snoRNAs display usual box H/ACA snoRNA features and resemble the fourteen box H/ACA snoRNAs that encode experimentally detected smaller fragments. In addition, the genomic sequence surrounding several of the predicted snoRNA-like miRNAs very closely resembles those described for some snoRTs [16]. These analyses show that some genomic regions previously reported to encode miRNAs resemble regions that encode H/ACA snoRNAs on numerous levels. This suggests that these miRNAs have evolved from H/ACA snoRNAs or snoRTs. We applied stringent selection criteria in our analysis, so anticipate that other box H/ACA snoRNA-like miRNA precursors also exist but have not been identified here.

Due to the inherent similarity between miRNAs and snoRNAs, such a relationship is easy to overlook as once a region is categorized as belonging to one molecular class, it is often no longer considered when searching for other types of molecules. The human genome has been scanned previously for the presence of box H/ACA snoRNAs using mammalian snoGPS [32]. However, the search space was limited to the 20% most well conserved regions between the human, mouse and rat genomes. In addition, the dataset was repeat-masked, thus eliminating repeat-derived regions such as those encoding many miRNAs. Finally, the dataset was restricted to sequences that do not overlap with known features in the UCSC Human Genome Browser database, thus probably eliminating all known miRNAs. As a consequence, it is not surprising that no miRNA encoding regions were identified as also encoding predicted snoRNAs. Moreover, at least one recent snoRNA predictor, SnoReport [38] uses miRNAs as negative training examples, thus making it very unlikely to identify any of the snoRNA-like miRNA regions described here.

Although no significant sequence similarity is detected between predicted snoRNA molecules encoding miRNAs and the known snoRNAs that target the same pseudouridylation sites, it is interesting to note that three snoRNAs (ACA52, HBI-61 and ACA19) share their target pseudouridylation sites with eight of the predicted snoRNAs encoding miRNAs (Table 2). This situation also exists amongst known snoRNAs, some of which share the same target site without displaying significant sequence similarity. In particular, examples exist of a snoRNA harbouring two guide regions, each of which is shared with a different snoRNA. For example, ACA22 which shares one of its targets with ACA33 and the other with U64, has no significant sequence similarity with either molecule. Similarly, ACA50 shares target sites with ACA36, ACA8 and ACA62 but while it has high sequence identity with ACA62, it has no significant sequence similarity with ACA8 or ACA36.

This redundancy in rRNA complementarity may suggest some box H/ACA snoRNAs and snoRTs are not under as much selective pressure to avoid mutations. We hypothesize that some of these snoRNA encoding regions might be in the process of evolving from functional snoRNAs to miRNA-like precursors. This process might be facilitated by the fact that box H/ACA snoRNAs have a structure (2 hairpins) that is probably favourable to the formation of miRNAs. los in silico data presented here support these ideas. We tested the predictions by experimentally showing that the precursors of five of the predicted snoRNA-like miRNAs, mir-664, mir-151, mir-605, mir-215 and mir-140, interact with dyskerin, a protein component of functional H/ACA snoRNPs. While a lack of interaction to dyskerin could not rule out an evolutionary relationship between these miRNAs and snoRNAs as the miRNAs might have evolved sufficiently to no longer interact with functional protein components of snoRNPs, the detection of such an interaction considerably reinforces such claims. These results show that the snoRNA-like miRNA precursors sufficiently resemble box H/ACA snoRNAs to bind dyskerin, strengthening the possibility of an evolutionary relationship between these molecules. Further experiments will be necessary to investigate whether these molecules also retain the capability of targeting rRNA en vivo. It will also be necessary to experimentally test whether the remaining fifteen predicted snoRNA-like miRNA precursors also display aspects of H/ACA snoRNA functionality. The fact that three of these molecules (mir-548d-1, mir-1297 and mir-616) display the sequence AGA instead of the canonical ACA box could indicate that they have evolved sufficiently to no longer retain H/ACA snoRNA functionality. We do note that while identifying molecules that display both miRNA and snoRNA functionality supports our evolutionary hypothesis, we also expect to find a larger number of molecules that display features of both molecules but do not represent completely prototypical examples.

It is interesting to note that Saccharomyces cerevisiae has snoRNAs but no reported miRNAs, consistent with a relationship where primordial snoRNAs may have given rise to certain classes of miRNAs. This idea is supported by a recent article by Saraiya and Wang reporting that the primitive parasitic protozoan Giardia lamblia, which does not have RNA interference capabilities but has miRNA processing machinery, uses box C/D snoRNAs as miRNA precursors [39]. In addition to this, Taft and colleagues have recently reported that most snoRNAs in animals, Arabidopsis y Schizosaccharomyces pombe generate small RNAs (of ∼20–24 nucleotides in length for animal box H/ACA snoRNAs), which are associated with argonaute proteins [40]. Current data such as these dual function molecules with both miRNA and snoRNA capabilities which exist in both human [24] and Giardia [39] and likely many other organisms [40] suggest this process of evolving from a snoRNA encoding genomic region to a miRNA-like encoding region could be ongoing.

In addition to investigating whether some of the H/ACA snoRNA-like miRNA precursors display functional H/ACA snoRNA capability by binding to dyskerin (Figure 5), we have also characterised the cellular localisation of two of these molecules: the precursors of mir-151 and mir-664 (Figure 6). While bands of the size of the predicted full-length H/ACA snoRNA molecules localise to the nucleolus, consistent with their binding to dyskerin, bands of the size of the predicted hairpin form of these miRNAs can be found in all three fractions considered but accumulate mainly in the nucleolus (in the case of mir-151) and in the nucleoplasm and cytoplasm (in the case of mir-664). The mature form of mir-151 accumulates mainly in the nucleoplasm which is unusual for a miRNA but might be a consequence of the snoRNA features displayed by its precursor. These results are consistent with a recent study showing that the precursors and/or mature form of a number of rat miRNAs accumulate in the nucleolus [41]. Further studies will be required to investigate the exact nature and role of each of these molecules in these cellular compartments as well as how they are processed.

While all the miRNAs characterised in Table 2 are classified as miRNAs in miRBase [25], they have not all been extensively analysed. Of the five extended miRNA regions that we experimentally found to be bound by dyskerin, three (mir-151, mir-140 and mir-215) have been further characterized and functionally validated, either by studies of their processing into their mature form or validation of their targets and effects. Indeed, mir-151 has been shown to be processed into its mature form by usual miRNA processing machinery [42] while functional targets of mir-140 have been experimentally validated [43]. And mir-215, which has been shown to have reduced expression in cancer tissues compared to normal cells, is capable of inducing cell-cycle arrest, colony suppression and cell detachment from a solid support when transfected into cells [44]. Mir-664 and mir-605 have not, to our knowledge, been further functionally validated and will require additional experimental evidence to confirm they are true miRNAs. In particular, mir-605 has only been identified previously with one sequence read [45]. Given that the extended region of mir-605 is predicted to serve as a guide for an experimentally validated pseudouridylation site whose guide is unknown, we postulate that this region encodes an H/ACA snoRNA rather than a miRNA. This type of analysis can thus be used to filter out unlikely miRNA candidates from the large miRNA repositories which contain many poorly characterized molecules.

A recent large-scale study defining an expression atlas for mammalian miRNAs, by Landgraf and colleagues, classifies known miRNAs into four different groups: prototypical, repeat-derived, repeat-clustered and unclassified [46]. A lack of repetitiveness, evolutionary conservation and 5′ end processing were considered to classify miRNAs as prototypical. Only two (mir-215 and mir-140) of our twenty miRNAs encoded in predicted snoRNAs are classified as protypical in this study. The remaining eighteen miRNAs were either classified as repeat-derived (5 miRNAs), repeat-clustered (1 miRNA), unclassified (2 miRNAs) or were not considered in the study (10 miRNAs). The results of a recent deep-sequencing study [45] analysed in the context of the Landgraf study reveals that only 17% of all miRNAs identified in this manner are prototypical [46]. The remaining miRNAs displayed irregularities in their processing or unusual sequence conservation patterns [46]. The authors further went on to investigate possible functional implications, determining that unlike non-prototypical miRNAs, prototypical miRNAs showed enrichment of putative target sites in 3′UTRs [46]. In light of the relationship uncovered here between box H/ACA snoRNAs and miRNAs, it is reasonable to speculate that snoRNA-encoded miRNAs might be in the process of evolving into functional miRNAs but still retain some non-miRNA-like features which could preclude them from being classified as prototypical. Alternatively, perhaps these molecules should be classified as a separate small RNA class. Further analysis will be necessary to clarify the role and exact relationship of these molecules.


A dicistronic precursor encoding miR398 and the legume-specific miR2119 coregulates CSD1 and ADH1 mRNAs in response to water deficit

J. L. Reyes, Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, UNAM, Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos 62210, Mexico.

Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 2001, Cuernavaca, Morelos, 62210 Mexico

Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 2001, Cuernavaca, Morelos, 62210 Mexico

Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 2001, Cuernavaca, Morelos, 62210 Mexico

J. L. Reyes, Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, UNAM, Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos 62210, Mexico.

Abstracto

Plant microRNAs are commonly encoded in transcripts containing a single microRNA precursor. Processing by DICER-LIKE 1 and associated factors results in the production of a small RNA, followed by its incorporation into an AGO-containing protein complex to guide silencing of an mRNA possessing a complementary target sequence. Certain microRNA loci contain more than one precursor stem-loop structure, thus encoding more than one microRNA in the same transcript. Here, we describe a unique case where the evolutionary conserved miR398a is encoded in the same transcript as the legume-specific miR2119. The dicistronic arrangement found in common bean was also observed in other legumes. En Phaseolus vulgaris, mature miR398 and miR2119 are repressed in response to water deficit, and we demonstrate that both are functional as they target the mRNAs for CSD1 and ADH1, respectively. Our results indicate that the repression of miR398 and miR2119 leads to coordinated up-regulation of CSD1 and ADH1 mRNAs in response to water deficit in common bean and possibly in other legumes. Furthermore, we show that miRNA directed CSD1 and ADH1 mRNAs up-regulation also occurs when common bean plants are exposed to flooding, suggesting that plant redox status and fermentation metabolism must be closely coordinated under different adverse conditions.

Figura S1. Predicted RNA secondary structure of miR398a-miR2119 precursors in legumes. Sequences containing the mature miR398a and miR2119 were obtained from different sequence databases including NCBI Expressed Sequence Tags (EST) for P. acutifolius, G. max, M. truncatula y L. japonicus. Genomic sequences for V. angularis y V. radiata were obtained from Vigna Genome server (www.viggs.dna.affrc.go.jp) and for C. cajan y C. arietinum from the Legume Information System website (www.legumeinfo.org). EST accession numbers, a ‘-‘sign indicating minus strand orientation, or chromosome positions are indicated when available. Predicted structures were obtained using the MFold software (www.unafold.rna.albany.edu).

Figura S2. mRNA splicing signal sequences in pvu-miR398a-miR2119 precursor. The aligned sequences corresponding to the full-length precursor (pri-miR398a-miR2119) and the fragment lacking a 76 nt segment (proc-mi398a-miR2119) from Figure 3C are shown along with the positions for mature miR398a (blue box), miR2119 (orange box). The positions for the putative 5′ splice site, branch site and 3′ splice site are also indicated, consistent with consensus sequences found in plants (Lorkovic, Wieczorek Kirk, Lambermon, & Filipowicz, 2000 . Pre-mRNA splicing in higher plants. Trends in Plant Science, 5: 160–167).

Figura S3. Transient expression of precursor miRNA transcripts in Nicotiana benthamiana sale de. The precursor for miR398a (shown as a blue box) and miR2119 (red box), with or without the intron (indicated by a green box with *), and derivatives including only pre-miR398a or only pre-miR2119 (1–4) were placed under the control of the 35S viral promoter (green arrow) and transiently expressed in N. benthamiana sale de. The empty vector served as a negative control (5). Two days after infiltration, RNA was purified and used for RT-qPCR experiments to determine mature microRNA abundance. Endogenous miR159 abundance served as reference. The graph shows mature microRNA expression for each construct relative to that determined for the full-length bicistronic precursor (set arbitrarily to 1). Error bars indicate standard deviation for three technical replicates. Bottom panel shows a semi-quantitative RT-PCR amplification for the BAR gene present in the plasmid constructs to show similar infiltration efficiencies.

Figura S4. Overexpression of pre-miR398a-miR2119 reduces accumulation of target mRNAs. Transgenic hairy roots were generated carrying the pBA-pre-miR398a-miR2119 plasmid or empty vector. Total RNA was purified and used to determine levels of A) mature miR398a (blue), miR2119 (red), miR398b (green), or B) CSD1 (grey), ADH1.1 (green) and ADH1.2 (light green) mRNAs. Accumulation of microRNAs was normalized to U6 snRNA and mRNAs were normalized to Act11 mRNA. Accumulation levels are represented relative to those determined for the empty vector samples (arbitrarily set to 1). Error bars represent standard deviation of three technical replicates.

Figure S5. Expression levels of ADH1.1 y CSD1 transcripts in leaves during water deficit. Total RNA samples from leaves of water-deficit treated plants (0, 10, 18 and 20 days) or control untreated plants were used for RT-qPCR assays. The accumulation of A) ADH1.1 (Phvul.009G134700) and B) CSD1 (Phvul.006G097000) mRNAs was normalized using Act11 mRNA as reference, and subsequently represented relative to levels of the untreated plants at each time point examined, arbitrarily set as 1.0. Results from one representative experiment are shown. Error bars represent standard deviation of three technical replicates.

Table S1. Oligonucleotides used in this study

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Abstracto

G-quadruplexes (G4s) are extremely stable DNA or RNA secondary structures formed by sequences rich in guanine. These structures are implicated in many essential cellular processes, and the number of biological functions attributed to them continues to grow. While DNA G4s are well understood on structural and, to some extent, functional levels, RNA G4s and their functions have received less attention. La presencia de bona fide RNA G4s in cells has long been a matter of debate. The development of G4-specific antibodies and ligands hinted on their presence en vivo, but recent advances in RNA sequencing coupled with chemical footprinting suggested the opposite. In this review, we will critically discuss the biology of RNA G4s focusing on the molecular mechanisms underlying their proposed functions.


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