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¿GPCR codificados espacialmente?

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Estoy leyendo este artículo y ya estoy perdido en términos de lo que quieren decir con que la señalización GPCR está codificada espacialmente.

El tráfico de receptores acoplados a proteína G (GPCR) es una de las áreas más interesantes de la biología celular debido a los avances recientes que demuestran que la señalización de GPCR es codificado espacialmente.


Algunos GPCR parecen regular su propia tasa endocítica mediante la modulación de la maduración del pozo recubierto de clatrina (CCP ).12-14 Esta regulación, que puede diferir entre los ligandos que actúan en el mismo GPCR, es un método adicional mediante el cual la señalización de GPCR puede ser codificado espacialmente.

¿Cómo se puede codificar espacialmente la señalización?


¿Cómo se puede codificar espacialmente la señalización (GPCR)?

Explicación concisa: durante la endocitosis, el receptor acoplado a proteína G puede estar restringido espacialmente.

Su artículo se refiere a: "Cumplir la promesa del agonismo del receptor acoplado a proteína G" sesgado ", por Luttrell LM, Maudsley S y Bohn LM, en Mol Pharmacol. 2015; 88 (3): 579-588. https://doi.org/10.1124/mol.115.099630.

Abstracto: El hecho de que más del 30% de los productos farmacéuticos actuales se dirijan a los receptores heptahelicales acoplados a proteína G (GPCR) da fe de su manejabilidad como dianas farmacológicas. Aunque el desarrollo de fármacos GPCR se ha centrado tradicionalmente en agonistas y antagonistas convencionales, la creciente apreciación de que los GPCR median efectos fisiológicamente relevantes a través de efectores tanto de proteína G como de proteína no G ha impulsado la búsqueda de ligandos que puedan "sesgar" la señalización aguas abajo a favor de uno o el otro proceso. Los ligandos sesgados son entidades novedosas con distintos perfiles de señalización dictados por la estructura del ligando, y se ha proclamado pleonásticamente la posibilidad potencial de ligandos sesgados como mejores fármacos. De hecho, los estudios preclínicos de prueba de concepto han demostrado que tanto la proteína G como los ligandos selectivos de la vía de la arrestina pueden promover efectos beneficiosos in vivo mientras simultáneamente antagonizan los deletéreos. Pero junto con la oportunidad viene una complejidad adicional y nuevos desafíos para el descubrimiento de fármacos. Si los ligandos pueden estar sesgados, la clasificación de ligandos se vuelve dependiente del ensayo y se necesitan enfoques de cribado más matizados para capturar la eficacia del ligando en varias dimensiones de señalización. Además, debido a que el repertorio de señalización de ligandos sesgados difiere del del agonista nativo, pueden surgir respuestas impredecibles in vivo a medida que se propagan estas señales desequilibradas ”.

Una explicación relativamente simple se ofrece en otro artículo: "Temporal Bias: Time-Encoded Dynamic GPCR Signaling", por Manuel Grundmann y Evi Kostenis DOI: https://doi.org/10.1016/j.tips.2017.09.004:

"La noción de que la información no solo está codificada por la química de los componentes de señalización, sino también por su ocurrencia espacial y temporal, dio lugar al término de 'señalización espacio-temporal' $^{[3]}$. Por tanto, la transducción de señales se puede clasificar en al menos tres dimensiones, (i) calidad (qué sustancias participan), (ii) espacio (donde tiene lugar el evento) y (iii) tiempo (cuando tiene lugar el evento). La interacción entre estas dimensiones se denominará en lo sucesivo "señalización dinámica" o "dinámica de señalización". La señalización dinámica está profundamente arraigada en la transducción de señales de GPCR, ya que un número creciente de informes nos brindan una idea de los aspectos espacio-temporales de la función del receptor. $^{[4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]}$.".

[3]Kholodenko B.N. et al. Señalización del ballet en el espacio y el tiempo. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010; 11: 414-426

[4]Irannejad R. Selectividad funcional de la acción del fármaco dirigida por GPCR a través del sesgo de ubicación. FASEB J. 2017; 31 (664,2)

[5]Mullershausen F. y col. La señalización persistente inducida por FTY720-fosfato está mediada por receptores S1P1 internalizados. Nat. Chem. Biol. 2009; 5: 428-434

[6]Irannejad R. y col. Los biosensores conformacionales revelan la señalización de GPCR de los endosomas. Naturaleza. 2013; 495: 534-538

[7]Eichel K. y col. La β-arrestina impulsa la señalización de la MAP quinasa de las estructuras recubiertas de clatrina después de la disociación de GPCR. Nat. Cell Biol. 2016; 18: 303-310.

[8]Thomsen A.R. et al. El supercomplejo GPCR-G proteína-β-arrestina media la señalización sostenida de la proteína G. Celda. 2016; 166: 907-919

[9]Jean-Alphonse F.G. et al. Control del receptor β2-adrenérgico de la señalización del receptor de PTH endosómico a través de Gβγ. Nat. Chem. Biol. 2016; 13: 259-261

[10]La localización de la membrana plasmática del receptor opioide μ controla la señalización espacio-temporal. Sci. Señal. 2016; 9: ra16

Ver: "Codificación espacial de la señalización de GPCR en el sistema nervioso", por Zara Y Weinberg, Stephanie E Crilly y Manojkumar A Puthenveedu, DOI: https://doi.org/10.1016/j.ceb.2018.12.006:

Recientemente se ha demostrado que varios GPCR, incluidos los receptores que antes se pensaba que emitían señales principalmente desde la superficie celular, emitían señales desde muchos compartimentos intracelulares. Esto plantea la idea de que la señalización de cualquier receptor está codificada espacialmente en la célula, con distintos sitios de origen de la señal. dictando distintas consecuencias posteriores. ".

Durante la endocitosis, el receptor acoplado a proteína G puede restringirse espacialmente.

Ver: "Resolución espacial de la señalización de cAMP por adenilil ciclasa soluble", por Giusi Caldieri y Sara Sigismund DOI: https://doi.org/10.1083/jcb.201606123 que ofrece una imagen fácil de entender:

Figura 1. Control espacial y temporal de la señalización GPCR por ACs. En las neuronas del hipocampo, CRHR1, al unirse al agonista CRH, activa el complejo de proteína G trimérica, compuesto por subunidades α, β y γ. La subunidad estimuladora Gα se libera y activa la producción de tmAC y cAMP (Irannejad y von Zastrow, 2014). En paralelo, el GPCR activado también puede inducir Ca local$^{2+}$ liberación que activa sAC, seguida de un aumento en los niveles de cAMP (Inda et al., 2016). (1) Estas dos fuentes de AMPc en la PM contribuyen a la fase temprana de la activación de ERK a través de la proteína quinasa efectora A (PKA) y las EPAC (Inda et al., 2016). Los GPCR activados una vez liberados de las proteínas G se fosforilan y reclutan β-arrestina (β-ARR) para ser internalizados a través de fosas recubiertas de clatrina (CCP; Irannejad y von Zastrow, 2014). (2) En la estación endosomal, los GPCR activan el sAC para desencadenar una segunda ola de producción de cAMP y para mantener la señalización de Erk de una manera dependiente de EPAC. La activación de sAC en la PM y en los endosomas requiere Ca$^{2+}$ y bicarbonato (no representado por simplicidad; Inda et al., 2016). La cascada de señalización que conduce a Ca$^{2+}$ y la liberación de bicarbonato (particularmente en la estación endosomal) y el mecanismo exacto de acción de la sAC no están completamente caracterizados. Las diferentes formas de AC, y los correspondientes gradientes de AMPc generados por ellos, se representan en diferentes colores para resaltar sus diferentes roles. Queda por aclarar si esta especificidad refleja diferentes isoformas y / o regulación.

"El trabajo informado por Inda et al. En este número integra y amplía nuestro conocimiento emergente de la señalización de GPCR localizada a nivel endosomal. En un trabajo anterior, estos autores demostraron que la activación de Erk por la señalización del receptor 1 de la hormona liberadora de corticotropina (CRHR1) es bifásico, con una respuesta temprana que se origina en el PM y una respuesta tardía que depende de la endocitosis (Bonfiglio et al., 2013). En su nuevo trabajo, Inda et al. (2016) refuerzan estos hallazgos, mostrando que distintas fuentes de cAMP son diferencialmente implicado en las dos fases de la señalización de Erk. Mientras que tmAC y sAC contribuyen a la respuesta de señalización aguda de Erk, sAC está implicado específicamente en la fase "endocítica" sostenida de la señalización de Erk en las células neuronales del hipocampo (Fig. 1). ".

Tenga en cuenta que las fases 1 y 2, que apuntan a una fase u otra, en lugar de la acción continua, están codificadas espacialmente.


Gα s señalización en el desarrollo esquelético, homeostasis y enfermedades

El desarrollo esquelético está exquisitamente controlado tanto espacial como temporalmente por redes de señalización celular. Gαs es la subunidad α estimuladora en un complejo de proteína G heterotrimérica que transduce la señalización de los receptores acoplados a proteína G (GPCR), responsables de controlar tanto el desarrollo esquelético como la homeostasis. Gαs, codificado por el gen GNAS en humanos, juega un papel fundamental en el desarrollo esquelético y la homeostasis al regular el compromiso, la diferenciación y la maduración de las células esqueléticas. GαsLa señalización mediada interactúa con las vías de señalización Wnt y Hedgehog, ambos reguladores cruciales del desarrollo esquelético, remodelación y reparación de lesiones. Mutaciones genéticas que alteran Gαs las funciones causan trastornos humanos con defectos esqueléticos graves, como displasia fibrosa del hueso y formación de hueso heterotópico. Este capítulo se centra en los roles cruciales de Gαs la señalización durante el desarrollo esquelético y la homeostasis, y los mecanismos patológicos subyacentes a las enfermedades esqueléticas causadas por mutaciones de GNAS.

Palabras clave: BMSC Fibrodisplasia de condrocitos óseos GNAS Gα (s) Señalización de erizo Osificación heterotópica Hipertrofia Osificación intramembranosa Síndrome de McCune-Albright Osteoblastos Osteoclasto PKA Heteroplasia ósea progresiva Señalización de Wnt cAMP.


Los químicos desarrollan una nueva estrategia de descubrimiento de fármacos para objetivos farmacológicos que no se pueden drogar

Un equipo de investigación dirigido por el Dr. Xiaoyu LI de la División de Investigación de Química de la Facultad de Ciencias, en colaboración con el profesor Yizhou LI de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Chongqing y el profesor Yan CAO de la Facultad de Farmacia de la Segunda Universidad Médica Militar de Shanghai ha desarrollado un nuevo método de descubrimiento de fármacos dirigido a proteínas de membrana en células vivas.

Las proteínas de membrana desempeñan un papel importante en la biología y muchas de ellas son objetivos de gran valor que se persiguen intensamente en la industria farmacéutica. El método desarrollado por el equipo del Dr. Li proporciona una forma eficiente de descubrir nuevos ligandos e inhibidores contra las proteínas de membrana, que siguen siendo en gran medida intratables con los enfoques tradicionales. El desarrollo de la metodología y sus aplicaciones ahora se publican en Química de la naturaleza.

Las proteínas de membrana en la superficie celular realizan una gran variedad de funciones biológicas que son vitales para la supervivencia de células y organismos. No es sorprendente que numerosas enfermedades humanas estén asociadas con funciones de proteínas de membrana aberrantes. De hecho, las proteínas de membrana representan más del 60% de los objetivos de todos los fármacos de molécula pequeña aprobados por la FDA. La superfamilia del receptor acoplado a proteína G (GPCR) por sí sola, como la clase más grande de receptores de superficie celular, son los objetivos de

34% de todos los fármacos clínicos. Sin embargo, a pesar de la importancia, el descubrimiento de fármacos contra las proteínas de membrana es un desafío notorio, principalmente debido a la propiedad especial de su hábitat natural: la membrana celular. Además, las proteínas de membrana también son difíciles de estudiar en forma aislada, ya que tienden a perder características celulares esenciales y pueden desactivarse. De hecho, las proteínas de membrana se han considerado durante mucho tiempo como un tipo de dianas "indiscutibles" en la industria farmacéutica.

En los últimos años, ha surgido una biblioteca química codificada por ADN (DEL) y se ha convertido en una poderosa tecnología de detección de fármacos. Para simplificar, podemos usar una biblioteca de libros como ejemplo. En una biblioteca, cada libro se indexa con un número de catálogo y se codifica espacialmente con una ubicación específica en una estantería. De manera análoga, en un DEL, cada compuesto químico se adjunta con una etiqueta de ADN única, que sirve como el "número de catálogo" que registra la información estructural del compuesto. Con la codificación del ADN, todos los compuestos de la biblioteca pueden mezclarse y cribarse contra la diana simultáneamente para descubrir los que pueden modular las funciones biológicas de la diana, p. Ej. inhibiendo las proteínas que son aberrantemente activas en cánceres malignos. Los DEL pueden contener una cantidad asombrosamente grande de compuestos de prueba (miles de millones o incluso billones), y el examen DEL puede realizarse en solo unas pocas horas en un laboratorio de química normal. Hoy en día, DEL ha sido ampliamente adoptado por casi todas las principales industrias farmacéuticas del mundo. Sin embargo, DEL también había encontrado dificultades significativas para interrogar proteínas de membrana en células vivas.

2 Hallazgos clave: seguimiento y refuerzo

Hay dos obstáculos que el equipo ha superado para permitir la aplicación de DEL en células vivas. Primero, la superficie celular no tiene una forma convexa suave como un globo, es extremadamente compleja con cientos de biomoléculas diferentes con una topología rugosa, por lo tanto, ubicar el objetivo deseado en la superficie celular es como encontrar un solo árbol en un espeso bosque tropical. El equipo ha superado este problema de "especificidad del objetivo" mediante el uso de un método que desarrollaron previamente: el etiquetado de afinidad programado por ADN (DPAL). Este método utiliza un sistema de sonda basado en ADN que puede entregar específicamente una etiqueta de ADN a la proteína deseada en células vivas, y la etiqueta de ADN sirve como una baliza para dirigir la detección de DEL específico del objetivo. En otras palabras, el equipo primero instaló un "rastreador" en el objetivo para lograr la especificidad del cribado.

El segundo desafío es la abundancia de objetivos. Por lo general, las proteínas de membrana existen en concentraciones nanomolares a micromolares bajas, que están muy por debajo de la concentración micromolar alta necesaria para capturar la pequeña fracción de aglutinantes entre miles de millones de no aglutinantes en una biblioteca. Para resolver este problema, el equipo empleó una estrategia novedosa mediante el uso de secuencias complementarias en la etiqueta de ADN de la proteína objetivo y la biblioteca real, de modo que la biblioteca pueda hibridar cerca del objetivo, "aumentando" así la concentración efectiva de la proteína objetivo. . En otras palabras, el "rastreador" no solo puede ayudar a la biblioteca a localizar el objetivo, sino que también puede crear una fuerza atractiva para concentrar la biblioteca alrededor del objetivo, sin distraerse con la población no vinculante.

En la publicación, el equipo informa el desarrollo de su metodología detallada, y también demuestran la generalidad y el rendimiento de este método mediante el cribado de una biblioteca de 30,42 millones de compuestos contra el receptor de folato (FR), anhidrasa carbónica 12 (CA-12) y epidérmica. receptor del factor de crecimiento (EGFR) en células vivas, todos son objetivos importantes en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer. Se espera que este enfoque sea ampliamente aplicable a muchas proteínas de membrana. Por ejemplo, los objetivos de fármacos clásicos, como los GPCR y los canales iónicos, pueden revisarse en un entorno de células vivas para identificar nuevas oportunidades de descubrimiento de fármacos aprovechando el poder de DEL.

"Esperamos que la utilidad de este método no se limite al descubrimiento de fármacos, sino también a la investigación académica para explorar sistemas biológicos desafiantes, como los complejos de proteínas de membrana oligomérica y las comunicaciones célula-célula", dijo el Dr. Xiaoyu Li.

El coautor correspondiente, el profesor Yizhou Li de la Universidad de Chongqing, dijo: "Este método tiene el potencial de facilitar el descubrimiento de fármacos para proteínas de membrana con el poder de una gran y compleja diversidad química de bibliotecas químicas codificadas por ADN". El coautor correspondiente, el profesor Yan Cao de la Segunda Universidad Médica Militar en Shanghai, agregó: "Esta tecnología es una herramienta eficaz para caracterizar la interacción ligando-objetivo, arrojará nueva luz sobre el desarrollo de métodos de detección de alto rendimiento y, por lo tanto, facilitará la pesca de ligandos dirigidas a las proteínas de la membrana ".


Agradecimientos

Agradecemos a J. Tesmer su ayuda con la preparación de la Tabla complementaria 1. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud de Australia (NHMRC) (número de subvención del programa APP1055134). D.M.T. y A.G. son becarios del premio Discovery Early Career Research Award del Australian Research Council, P.M.S. es un investigador principal del NHMRC y A.C. es un investigador principal sénior del NHMRC.

Información del revisor

Naturaleza agradece a A. Jazayeri, R. Lefkowitz y A. Manglik por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.


Los químicos y colaboradores desarrollan una nueva estrategia de descubrimiento de fármacos para objetivos farmacológicos "indiscutibles"

Ilustración gráfica del trabajo: el etiquetado de afinidad programado por ADN (DPAL) permite el cribado directo de bibliotecas químicas codificadas por ADN (DEL) contra objetivos de proteínas de membrana en células vivas para crear nuevas oportunidades de descubrimiento de fármacos.

Un equipo de investigación dirigido por el Dr. Xiaoyu Li de la División de Investigación de Química de la Facultad de Ciencias, en colaboración con el profesor Yizhou Li de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Chongqing y el profesor Yan Cao de la Facultad de Farmacia de la Segunda Universidad Médica Militar de Shanghai ha desarrolló un nuevo método de descubrimiento de fármacos dirigido a proteínas de membrana en células vivas.

Las proteínas de membrana desempeñan un papel importante en la biología y muchas de ellas son objetivos de gran valor que se persiguen intensamente en la industria farmacéutica. El método desarrollado por el equipo del Dr. Li proporciona una forma eficaz de descubrir nuevos ligandos e inhibidores contra las proteínas de la membrana, que siguen siendo en gran medida intratables con los enfoques tradicionales. El desarrollo de la metodología y sus aplicaciones ahora se publican enQuímica de la naturaleza, una prestigiosa revista de química de la Naturaleza Grupo Editorial (NPG).

Las proteínas de membrana en la superficie celular realizan una gran variedad de funciones biológicas que son vitales para la supervivencia de células y organismos. No es sorprendente que numerosas enfermedades humanas estén asociadas con funciones de proteínas de membrana aberrantes. De hecho, las proteínas de membrana representan más del 60% de los objetivos de todos los fármacos de molécula pequeña aprobados por la FDA. La superfamilia del receptor acoplado a proteína G (GPCR) por sí sola, como la clase más grande de receptores de superficie celular, son los objetivos de

34% de todos los fármacos clínicos. Sin embargo, a pesar de la importancia, el descubrimiento de fármacos contra las proteínas de membrana es un desafío notorio, principalmente debido a la propiedad especial de su hábitat natural: la membrana celular. Además, las proteínas de membrana también son difíciles de estudiar en forma aislada, ya que tienden a perder características celulares esenciales y pueden desactivarse. De hecho, las proteínas de membrana se han considerado durante mucho tiempo como un tipo de dianas "no farmacológicas" en la industria farmacéutica.

En los últimos años, ha surgido una biblioteca química codificada por ADN (DEL) y se ha convertido en una poderosa tecnología de detección de fármacos. Para simplificar, podemos usar una biblioteca de libros como ejemplo. En una biblioteca, cada libro se indexa con un número de catálogo y se codifica espacialmente con una ubicación específica en una estantería. De manera análoga, en un DEL, cada compuesto químico se adjunta con una etiqueta de ADN única, que sirve como el "número de catálogo" que registra la información estructural del compuesto. Con la codificación del ADN, todos los compuestos de la biblioteca pueden mezclarse y cribarse contra la diana simultáneamente para descubrir los que pueden modular las funciones biológicas de la diana, p. Ej. inhibiendo las proteínas que son aberrantemente activas en cánceres malignos. Los DEL pueden contener una cantidad asombrosamente grande de compuestos de prueba (miles de millones o incluso billones), y la detección del DEL se puede realizar en solo unas pocas horas en un laboratorio de química regular. Hoy en día, DEL ha sido ampliamente adoptado por casi todas las principales industrias farmacéuticas del mundo. Sin embargo, DEL también había encontrado dificultades significativas para interrogar proteínas de membrana en células vivas.

2 Hallazgos clave: seguimiento y refuerzo

Hay dos obstáculos que el equipo ha superado para permitir la aplicación de DEL en células vivas. Primero, la superficie celular no tiene una forma convexa suave como un globo, es extremadamente compleja con cientos de biomoléculas diferentes con una topología rugosa, por lo tanto, ubicar el objetivo deseado en la superficie celular es como encontrar un solo árbol en un espeso bosque tropical. El equipo ha superado este problema de "especificidad del objetivo" mediante el uso de un método que desarrollaron previamente: el etiquetado de afinidad programado por ADN (DPAL). Este método utiliza un sistema de sonda basado en ADN que puede entregar específicamente una etiqueta de ADN a la proteína deseada en células vivas, y la etiqueta de ADN sirve como una baliza para dirigir la detección de DEL específico del objetivo. En otras palabras, el equipo primero instaló un "rastreador" en el objetivo para lograr la especificidad del cribado.

El segundo desafío es la abundancia de objetivos. Por lo general, las proteínas de membrana existen en concentraciones nanomolares a micromolares bajas, que están muy por debajo de la concentración micromolar alta necesaria para capturar la pequeña fracción de aglutinantes entre miles de millones de no aglutinantes en una biblioteca. Para resolver este problema, el equipo empleó una estrategia novedosa mediante el uso de secuencias complementarias en la etiqueta de ADN en la proteína objetivo y en la biblioteca real, de modo que la biblioteca pueda hibridar cerca del objetivo, "aumentando" así la concentración efectiva de la proteína objetivo. . En otras palabras, el "rastreador" no solo puede ayudar a la biblioteca a localizar el objetivo, sino que también crea una fuerza atractiva para concentrar la biblioteca alrededor del objetivo, sin distraerse con la población no vinculante.

En la publicación, el equipo informa el desarrollo de su metodología detallada, y también demuestran la generalidad y el rendimiento de este método mediante el cribado de una biblioteca de 30,42 millones de compuestos contra el receptor de folato (FR), anhidrasa carbónica 12 (CA-12) y epidérmica. receptor del factor de crecimiento (EGFR) en células vivas, todos son objetivos importantes en el descubrimiento de fármacos contra el cáncer. Se espera que este enfoque sea ampliamente aplicable a muchas proteínas de membrana. Por ejemplo, los objetivos de fármacos clásicos, como los GPCR y los canales iónicos, pueden revisarse en un entorno de células vivas para identificar nuevas oportunidades de descubrimiento de fármacos aprovechando el poder de DEL.

"Esperamos que la utilidad de este método no se limite al descubrimiento de fármacos, sino también a la investigación académica para explorar sistemas biológicos desafiantes, como los complejos de proteínas de membrana oligomérica y las comunicaciones célula-célula", dijo el Dr. Xiaoyu Li.

El coautor correspondiente, el profesor Yizhou Li de la Universidad de Chongqing, dijo: "Este método tiene el potencial de facilitar el descubrimiento de fármacos para proteínas de membrana con el poder de una gran y compleja diversidad química de bibliotecas químicas codificadas por ADN". El coautor correspondiente, el profesor Yan Cao de la Segunda Universidad Médica Militar en Shanghai, agregó: "Esta tecnología es una herramienta eficaz para caracterizar la interacción ligando-objetivo, arrojará nueva luz sobre el desarrollo de métodos de detección de alto rendimiento y, por lo tanto, facilitará la pesca de ligandos dirigidas a las proteínas de la membrana ".


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Introducción

La visión clásica de la señalización de la proteína G comienza con un estímulo extracelular. Una amplia gama de moléculas, incluidos fotones, átomos individuales (p.ej. protones y calcio), olores, aminas biogénicas (p.ej. epinefrina y dopamina), fosfolípidos, hormonas glicoproteicas e incluso enzimas (p.ej. trombina), son detectados por receptores acoplados a proteína G. Una vez activados, estos receptores activan un heterotrímero de proteína G o, en algunos casos, arrestinas. Las proteínas G intercambian GDP por GTP, y las subunidades disociadas & # x003b1 y & # x003b2 / & # x003b3 inician procesos bioquímicos dentro de la célula, más clásicamente la producción de segundos mensajeros como cAMP.

El Journal of Biological Chemistry tiene una rica tradición en la publicación de artículos sobre GPCR, proteínas 2 G y sus reguladores. Por ejemplo, las proteínas RGS (reguladoras de la señalización de la proteína G) aceleran la hidrólisis de GTP y, por lo tanto, actúan en oposición a los receptores para limitar la transducción de señales. Gran parte de esta literatura se ha centrado en los aspectos mecánicos de la función o modificación de la proteína G, prestando menos atención al movimiento y distribución de las proteínas componentes dentro de la célula. Dado que la mayoría de las hormonas y neurotransmisores no pueden atravesar la membrana plasmática, parecía natural suponer que los receptores y las proteínas G también deben residir en la membrana plasmática para funcionar. Se pensaba que las proteínas ubicadas en otros lugares estaban en tránsito, ya sea hacia o desde su sitio principal de acción. Sin embargo, se sabe desde hace mucho tiempo que al menos una familia de GPCR, los receptores de luz personificados por la rodopsina, no se encuentran en la superficie celular, sino que están densamente empaquetados dentro de & # x0201cdiscs & # x0201d de forma ovalada dentro de las células del bastón y del cono de la retina. . Por tanto, al menos algunos receptores acoplados a proteínas G actúan principalmente desde el interior de la célula. Esta vista ha sido ampliada por hallazgos recientes que son el foco de esta serie de minireview. Los artículos aportados son de tres laboratorios líderes que son pioneros en sus respectivos campos.

La primera minirrevisión de la serie es de Terri Clister, Sohum Mehta y Jin Zhang (1). Este artículo comienza con un buen resumen de la señalización de la proteína G, que incluye nuevos conocimientos sobre cómo se regula la función de la proteína G en el espacio y el tiempo. Gran parte del trabajo que describen se ha beneficiado del desarrollo de biosensores sensibles y versátiles. En general, estos consisten en proteínas o fragmentos de proteínas que emiten una señal óptica (generalmente fluorescente) basada en cambios en la actividad bioquímica. Cuando estos biosensores se combinan con microscopía de alta resolución, pueden revelar información espacial y temporal muy detallada sobre los cambios moleculares dentro de la célula, como ocurre cuando una célula se mueve hacia un estímulo de gradiente. Estas herramientas proporcionan información que a menudo se pierde en los datos agregados del análisis bioquímico, y han comenzado a revelar una variación dramática de célula a célula en la respuesta a los estímulos. Los autores describen el diseño actual de biosensores y continúan proporcionando ejemplos específicos de biosensores que se utilizan para monitorear la activación del receptor y la proteína G (o arrestina), la translocación hacia y desde la membrana plasmática y la producción localizada de segundos mensajeros químicos. Finalmente, discuten nuevos esfuerzos para manipular los procesos celulares, por ejemplo, utilizando GPCR activados por luz para apuntar a la activación de la proteína G dentro de un segmento estrecho de una célula. La capacidad de medir y activar localmente la señalización de la proteína G seguramente hará avanzar nuestra comprensión de los gradientes de señalización celular, tanto dentro como fuera de la célula.

El segundo artículo de la serie está escrito por Nikoleta G. Tsvetanova, Roshanak Irannejad y Mark von Zastrow (2). Estos autores se centran en el tráfico de proteínas GPCR y G al compartimento endosómico. Esbozan un mecanismo por el cual la internalización de los receptores activados conduce a una & # x0201csegunda onda & # x0201d de señalización de la proteína G desde los endosomas. Los estudios genéticos más antiguos en levaduras, así como los estudios farmacológicos en cultivos de células de mamíferos, habían indicado un papel para los conjuntos de endomembranas de proteínas G activadas. La evidencia directa de la activación de la proteína GPCR y G en los endosomas proviene de un trabajo reciente del grupo de von Zastrow. Adaptaron fragmentos de anticuerpos de dominio único, desarrollados originalmente para estabilizar GPCR activados y proteínas G con el propósito de cristalografía de rayos X, como biosensores codificados genéticamente. Cuando estos fragmentos se utilizaron junto con imágenes de fluorescencia de células vivas, estos investigadores notaron dos ondas de activación, una en la membrana plasmática y una segunda onda, más sostenida, en los endosomas. Estas ondas de activación de proteínas se correlacionan con ondas de producción de segundos mensajeros, y estas dos lecturas muestran sensibilidades similares a los inhibidores endocíticos y la abstinencia de agonistas. Estos hallazgos desafían las opiniones arraigadas que equiparan la endocitosis del receptor con la desensibilización. Dado que muchos procesos fisiológicos dependen del momento y la ubicación de las señales intracelulares, comprender estos procesos es de suma importancia en fisiología y farmacología.

El tercer artículo es de Mikel García-Marcos, Pradipta Ghosh y Marilyn G. Farquhar (3). Estos autores se centran en las nuevas funciones de GIV (también conocido como Girdin), uno de un grupo en expansión de proteínas que activan las proteínas G pero que no están localizadas en la membrana plasmática y no se parecen a los GPCR típicos. La GIV se encuentra predominantemente en las membranas internas, más que en la membrana plasmática, y es activada por receptores tirosina quinasas, en lugar de GPCR. Aunque todavía se están dilucidando los detalles mecánicos, existen datos genéticos convincentes que indican un papel importante de GIV en la migración celular y en la progresión de la metástasis del cáncer, así como en la nefrosis y la fibrosis hepática.

¿Qué significan estos hallazgos para los químicos biológicos? Dada la larga historia de los GPCR, así como de las tirosina quinasas receptoras, como dianas farmacológicas, existe una fuerte justificación para investigar también los activadores no receptores como posibles dianas farmacológicas. De hecho, los esfuerzos de descubrimiento de fármacos anteriores se basaron en opiniones arraigadas que pueden ya no ser del todo válidas. Con la evidencia emergente de activadores de proteínas G que no son receptores, y que ni siquiera están en la membrana plasmática, tal vez podamos esperar una & # x0201csegunda onda & # x0201d de descubrimientos relacionados con la proteína G en las páginas del Journal of Biological. Química.


Ejemplo 4: adaptación del ensayo a una muestra biológica

Se inmoviliza una plantilla de ARN de control en un soporte sólido para crear un sistema artificial. El ensayo se realiza utilizando ADN ligasa T4, que puede reparar mellas en híbridos de ADN / ARN. Los ensayos se llevan a cabo en portaobjetos emparejados, o en diferentes secciones del mismo portaobjetos, donde en un caso se analiza el ADNg y en el otro se analiza el ARN. Cuando se analiza el ADNg, el portaobjetos se puede pretratar con RNasa, y cuando se analiza el ARN, el portaobjetos se trata previamente con DNasa. Los resultados del ensayo se confirman extrayendo gDNA o RNA y cuantificando las cantidades relativas por qPCR o RT-qPCR respectivamente.

Para que los ensayos de ARN de la sección de tejido sean lo más informativos posible, en el diseño del ensayo se utiliza información preexistente sobre los niveles de expresión en tejidos específicos para apuntar a las transcripciones en una variedad de abundancias. Tanto las transcripciones de alta abundancia, como algunas transcripciones de abundancia media y baja, están destinadas a permitir una evaluación inicial de las características de rendimiento cuantitativas del ensayo.


Ver el vídeo: A distinct activation mechanism in GPCR dimers: Insights from cryo-EM.. - Dr. Vaithish Velazhahan (Diciembre 2022).