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Sustituto (CTL-1) de la influenza A

Sustituto (CTL-1) de la influenza A


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¿Alguien puede recomendar algunas posibles alternativas de nivel 1 disponibles comercialmente (listas para usar) para el virus de la gripe? La idea es capturar este virus en un material especial. Entonces, el 'reemplazo' debería ser muy similar en términos de su estructura más externa y bioquímica (en términos de cómo interactúa externamente; los aspectos internos no deberían importar). Tener CTL-1 sería perfecto.

Tenga en cuenta que no tengo experiencia en biología.


Terapia antiviral para la influenza

Cada año, las epidemias de influenza causan una carga considerable de morbilidad. La vacunación contra los virus de la influenza A y B ha sido y sigue siendo la piedra angular de la prevención de la influenza, pero la terapia antiviral puede servir como un complemento importante de la vacunación para controlar el impacto de la enfermedad. Actualmente hay dos clases de medicamentos autorizados en un gran número de países para el tratamiento de la influenza. Los bloqueadores de los canales iónicos M2 o amantadanos (amantadina y rimantadina) son inhibidores específicos de la replicación del virus de la influenza A, mientras que los inhibidores de la neuraminidasa (zanamivir y oseltamivir) son activos contra los virus de la influenza A y B. Los virus resistentes a fármacos fácilmente transmisibles se desarrollan con frecuencia durante el tratamiento con amantantano, pero no durante el tratamiento con inhibidores de la neuraminidasa.

En esta revisión, se evalúan los datos de eficacia y seguridad de los ensayos controlados aleatorios para comprender lo que podemos y no podemos esperar del tratamiento antiviral. Los cuatro medicamentos acortan el curso de la influenza en aproximadamente 1 día y alivian los síntomas hasta cierto punto, pero aún existe incertidumbre sobre si la terapia antiviral conduce a una reducción de las complicaciones graves y la hospitalización. Los resultados de los análisis de rentabilidad son muy diversos, en parte debido a diferencias en la metodología, pero también porque no existe consenso sobre qué probabilidades asignar a los riesgos y beneficios clave que forman la base de estos estudios.

Las declaraciones de consenso de los órganos asesores en Inglaterra y Alemania recomiendan inhibidores de la neuraminidasa para el tratamiento de la influenza en personas de alto riesgo, como personas mayores de 65 años o menores de 2 años, y personas con enfermedad cardiovascular, pulmonar o renal crónica, diabetes mellitus o inmunosupresión. Sin embargo, no hay acuerdo sobre si la terapia antiviral puede recomendarse en general para niños y adultos por lo demás sanos. El médico en ejercicio debe tener en cuenta la disponibilidad de opciones de terapia antiviral seguras y efectivas, mientras que las recomendaciones y la formulación de políticas más específicas dependerán de datos de eficacia adicionales que incluyan la frecuencia de complicaciones y la hospitalización como medidas de resultado.

La influenza es una enfermedad altamente infecciosa que se presenta en epidemias estacionales anuales y afecta al 10-20% de la población mundial en un año promedio. La OMS calcula que cada año las epidemias de influenza provocan entre 3 y 5 millones de casos de enfermedades respiratorias graves y hasta 500 000 muertes. La mayoría de las muertes asociadas con la influenza en los países industrializados se deben a complicaciones de enfermedades subyacentes en personas con riesgos bien definidos, como mayores de 65 años o menores de 2 años, enfermedad cardiovascular, pulmonar o renal crónica, diabetes mellitus o inmunosupresión. [1] Solo en los EE. UU., La influenza se asocia con más de 50 000 muertes en exceso por todas las causas al año. [2] Además de la enorme carga de enfermedad en términos de morbilidad y mortalidad, las epidemias de influenza también infligen una carga económica considerable, tanto en los costos directos de atención de la salud como en los costos indirectos, como las pérdidas de productividad.

La vacunación contra los virus de la influenza A y B ha sido y sigue siendo la piedra angular de la prevención de la influenza. Las vacunas inactivadas se han empleado con éxito durante más de 60 años y recientemente se han puesto a disposición nuevas vacunas, como las vacunas intranasales vivas atenuadas. [3,4] No obstante, debido principalmente a la cobertura vacunal insuficiente [5], pero también a la falta de inmunogenicidad protectora en los ancianos y, en algunos años, un desajuste entre las cepas de la vacuna y las cepas circulantes, la influenza sigue siendo un problema importante de salud pública. Por lo tanto, se necesitan con urgencia terapias antivirales eficaces.

Actualmente, dos grupos de medicamentos antivirales contra la influenza están autorizados en un gran número de países, lo que ofrece a los médicos una opción en el tratamiento y la prevención de la influenza. Si bien el primer grupo de medicamentos antivirales, los bloqueadores de los canales iónicos M2, ha estado en el mercado durante mucho tiempo, el grupo de medicamentos antivirales inhibidores de la neuraminidasa ingresó al mercado en 1999. Aún existe una incertidumbre considerable en cuanto al papel de estos medicamentos para controlar las epidemias de influenza y reducir la carga de morbilidad.

Basado en una búsqueda en PubMed de artículos que contienen al menos uno de los nombres de medicamentos genéricos y el término 'influenza', y en base a información adicional proporcionada por los fabricantes de los medicamentos en cuestión, esta revisión examina la evidencia clínica de la eficacia de los medicamentos antivirales. en el tratamiento de la influenza, y resume brevemente una serie de análisis de costo-beneficio y recomendaciones para el uso de la terapia antiviral en epidemias de influenza entre pandemias. La quimioprofilaxis y el papel de los fármacos antivirales en la influenza pandémica se han revisado recientemente [6,7] y no se incluyen aquí.


Artículo de revisión

Lucas J. Kerstetter 1 & # x2020, Stephen Buckley 1 & # x2020, Carly M. Bliss 2 & # x2020 y Lynda Coughlan 1,3 * & # x2020
  • 1 Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, Baltimore, MD, Estados Unidos
  • 2 División de Cáncer y Genética, División de Infecciones e Inmunidad, Facultad de Medicina, Universidad de Cardiff, Gales, Reino Unido
  • 3 Centro para el Desarrollo de Vacunas y Salud Global, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, Baltimore, MD, Estados Unidos

Es evidente que la aparición de enfermedades infecciosas, que tienen el potencial de extenderse a los reservorios animales, representan una amenaza constante para la salud mundial. Los eventos de transmisión zoonótica han aumentado en frecuencia en las últimas décadas debido a cambios en el comportamiento humano, incluido el aumento de los viajes internacionales, el comercio de vida silvestre, la deforestación y la intensificación de las prácticas agrícolas para satisfacer la demanda de consumo de carne. Los virus de la influenza A (IAV) poseen una serie de características que los convierten en una amenaza pandémica y una gran preocupación para la salud humana. Su genoma segmentado y su proceso de replicación propenso a errores pueden conducir a la aparición de nuevos virus reagrupados, para los cuales la población humana es inmunológicamente inocente. Además, la capacidad de los IAV para infectar aves acuáticas y animales domésticos, así como a los seres humanos, aumenta la probabilidad de reordenamiento y la posterior aparición de nuevos virus. Los eventos de desbordamiento esporádicos de las últimas décadas han provocado infecciones humanas por virus de la influenza aviar altamente patógena (IAAP), con una alta mortalidad. La aplicación de plataformas de vacunas convencionales utilizadas para la prevención de los virus de la influenza estacional, como las vacunas antigripales inactivadas (IIV) o las vacunas antigripales vivas atenuadas (LAIV), en el desarrollo de vacunas para los virus de la influenza aviar altamente patógena está plagada de desafíos. Estos problemas están asociados con la fabricación bajo una contención mejorada de bioseguridad y las dificultades para propagar los virus de la influenza aviar altamente patógena en huevos embrionados, debido a su propensión a la letalidad en los huevos. Superar los obstáculos de fabricación mediante el uso de cadenas principales más seguras, como los virus de la influenza aviar de baja patogenicidad (LPAI), también puede ser un desafío si es incompatible con los virus de la cepa maestra. Los vectores adenovirales (Ad) no replicantes ofrecen una serie de ventajas para el desarrollo de vacunas contra los virus de la influenza aviar altamente patógena. Su genoma es estable y permite la inserción de antígenos del virus de la influenza aviar altamente patógena (Ag), que se expresan en vivo después de la vacunación. Por lo tanto, su fabricación no requiere mejores instalaciones o procedimientos de bioseguridad y es independiente del huevo. Es importante destacar que las vacunas Ad tienen un perfil de seguridad e inmunogenicidad ejemplar en numerosos ensayos clínicos en humanos, y pueden termoestabilizarse para almacenamiento y preparación para pandemias. Esta revisión discutirá el estado de las vacunas basadas en anuncios diseñadas para proteger contra los virus de la influenza aviar con potencial pandémico.


Estrategias dirigidas a la hemaglutinina como vacuna universal contra la influenza

Gracias por la oportunidad de revisar este manuscrito. Bullard et al resumieron el desarrollo y los conocimientos recientes sobre una estrategia de vacuna universal contra los virus de la influenza. Este manuscrito está bien escrito y estructurado, por lo que aprendí mucho de este manuscrito de revisión. Hay algunas sugerencias que podrían mejorar este manuscrito de revisión. Consulte mis comentarios específicos indicados en los comentarios de los autores.

  1. Me gustaría sugerirle que agregue una descripción más detallada de por qué el desarrollo de sistemas de vacunas eficaces contra virus de ARN como la influenza es tan desafiante (por ejemplo, comparar tasas de mutación).
  2. A lo largo del texto, confundí la palabra "secuencia". ¿Te refieres a "secuencia de nucleótidos"? o "secuencia de aminoácidos" ?. Describa esto con precisión.

Gracias por sus valiosas sugerencias. Consulte las respuestas a sus comentarios a continuación. Verá que corregimos el manuscrito e incluimos el texto insertado en la respuesta para ayudarlo a identificar mejoras. Agradecemos a los revisores por su tiempo y esfuerzo.

Gracias por la oportunidad de revisar este manuscrito. Bullard et al resumieron el desarrollo y los conocimientos recientes sobre una estrategia de vacuna universal contra los virus de la influenza. Este manuscrito está bien escrito y estructurado, por lo que aprendí mucho de este manuscrito de revisión. Hay algunas sugerencias que podrían mejorar este manuscrito de revisión. Consulte mis comentarios específicos indicados en los comentarios de los autores.

Me gustaría sugerirle que agregue una descripción más detallada de por qué el desarrollo de sistemas de vacunas eficaces contra virus de ARN como la influenza es tan desafiante (por ejemplo, comparar tasas de mutación).

Hemos agregado a la introducción para incluir los altos niveles de tasas de mutación de los virus de ARN. La introducción ahora dice: & ldquoEl desarrollo de vacunas contra la influenza se ve desafiado por la diversidad viral sustancial del virus de la influenza [14]. La ARN polimerasa del virus de la influenza no tiene actividad de corrección de pruebas, lo que da lugar a altas tasas de mutación y una considerable deriva antigénica [15]. Por lo tanto, las vacunas actuales contra la influenza estacional se actualizan anualmente y dependen de la vigilancia mundial para predecir las futuras cepas estacionales circulantes [16].

A lo largo del texto, confundí la palabra "secuencia". ¿Te refieres a "secuencia de nucleótidos"? o "secuencia de aminoácidos" ?. Describa esto con precisión.

Nos hemos asegurado de que cada aparición de la palabra & lsquosequence & rsquo se defina como una secuencia de proteína HA o secuencia de aminoácidos.

Los autores han revisado las estrategias para generar una vacuna universal contra la influenza dirigiéndose a la proteína hemaglutinina. La revisión está claramente organizada y redactada de forma exhaustiva y cubre una amplia gama de estrategias complementarias.

  • Líneas 97 a 99: esta oración debe reformularse.
  • Figura 2: El acrónimo & ldquoRBS & rdquo debe agregarse en la leyenda después del sitio de unión de la región (línea 108). Dividir la figura en 2 paneles para las vistas lineal y 3D, respectivamente, lo aclararía más.
  • Figura 4 y / o texto asociado: deben proporcionarse referencias para cada estrategia.
  • Líneas 177, 250 y siguiente ocurrencia: especifique que la evaluación de la morbilidad es por pérdida de peso (no solo por pérdida).

Gracias por sus valiosas sugerencias. Consulte las respuestas a sus comentarios a continuación. Verá que corregimos el manuscrito e incluimos el texto insertado en la respuesta para ayudarlo a identificar mejoras. Agradecemos a los revisores por su tiempo y esfuerzo.

Los autores han revisado las estrategias para generar una vacuna universal contra la influenza dirigiéndose a la proteína hemaglutinina. La revisión está claramente organizada y redactada de forma exhaustiva y cubre una amplia gama de estrategias complementarias.

Líneas 97 a 99: esta oración debe reformularse.

Hemos reformulado esta oración para que diga: & ldquoLa proteína HA de la influenza tiene la capacidad de aglutinar los glóbulos rojos. Los anticuerpos anti-influenza que se unen a HA e inhiben la actividad de hemaglutinación de HA se utilizan como una medida sustituta para determinar los títulos de anticuerpos neutralizantes (títulos HI). & Rdquo

Figura 2: El acrónimo & ldquoRBS & rdquo debe agregarse en la leyenda después del sitio de unión de la región (línea 108). Dividir la figura en 2 paneles para las vistas lineal y 3D, respectivamente, lo aclararía más.

Hemos agregado RBS a la leyenda y también dividimos la Figura 2 en el panel ayb para mayor claridad.

Figura 4 y / o texto asociado: deben proporcionarse referencias para cada estrategia.

Hemos agregado referencias a la leyenda para cada estrategia.

Líneas 177, 250 y siguiente ocurrencia: especifique que la evaluación de la morbilidad es por pérdida de peso (no solo por pérdida).

Hemos aclarado & lsquoweight loss & rsquo en todos los casos.

La revisión titulada & ldquoStrategies Targeting Hemaglutinin as a Universal Influenza Vaccine & rdquo por Brianna L. Bullard y Eric A Weaver está bien escrita y articulada.

Esta es una excelente contribución al diseño de la vacuna contra la influenza. Aunque se han realizado muchos esfuerzos para el desarrollo de vacunas universales contra la influenza, muy pocas están trabajando contra los virus de la influenza estacional. Por lo tanto, esta revisión sería una fuente de conocimiento para los investigadores que buscan múltiples estrategias de diseño de vacunas. Los autores han resumido de forma exhaustiva el conocimiento actual sobre los diseños de vacunas basadas en HA.

Aquí hay algunos comentarios menores.

VLP no se expandió en primera instancia, a pesar de que se expandió más tarde varias veces.

Línea 230: & ldquoparticipants which & rdquo ----- & ldquoparticipants who & rdquo

Gracias por sus valiosas sugerencias. Consulte las respuestas a sus comentarios a continuación. Verá que corregimos el manuscrito e incluimos el texto insertado en la respuesta para ayudarlo a identificar mejoras. Agradecemos a los revisores por su tiempo y esfuerzo.

La revisión titulada & ldquoStrategies Targeting Hemaglutinin as a Universal Influenza Vaccine & rdquo por Brianna L. Bullard y Eric A Weaver está bien escrita y articulada.

Esta es una excelente contribución al diseño de la vacuna contra la influenza. Aunque se han realizado muchos esfuerzos para el desarrollo de vacunas universales contra la influenza, muy pocas están trabajando contra los virus de la influenza estacional. Por lo tanto, esta revisión sería una fuente de conocimiento para los investigadores que buscan múltiples estrategias de diseño de vacunas. Los autores han resumido de forma exhaustiva el conocimiento actual sobre los diseños de vacunas basadas en HA.

Aquí hay algunos comentarios menores.

VLP no se expandió en primera instancia, a pesar de que se expandió más tarde varias veces.

Hemos definido partículas similares a virus (VLP) en la primera aparición.

Hemos definido el virus de la estomatitis vesicular (VSV).

Línea 230: & ldquoparticipants which & rdquo ----- & ldquoparticipants who & rdquo


Abstracto

Los avances recientes en el uso de virus como vectores de vacunas se han visto facilitados por una mejor comprensión de la biología viral. Los avances ocurren a medida que obtenemos una mayor comprensión de la interrelación de los virus y el sistema inmunológico. Las vacunas de vectores virales siguen siendo el mejor medio para inducir la inmunidad celular y ahora se muestran prometedoras para la inducción de fuertes respuestas humorales. Los beneficios potenciales para la salud global que ofrece este campo reflejan el alcance y la utilidad de los virus como vectores de vacunas para aplicaciones humanas y veterinarias, con objetivos que van desde ciertos tipos de cáncer hasta una amplia gama de enfermedades infecciosas.

Han transcurrido veinticinco años desde el primer uso publicado de un virus recombinante para administrar antígenos de otro agente infeccioso con fines de vacunación. Se demostró que el virus vaccinia (VACV) recombinante para el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) expresaba HBsAg y, posteriormente, inducía inmunidad en los chimpancés que era suficiente para proteger contra la infección por hepatitis B 1,2. A pesar de este comienzo temprano prometedor y un desarrollo sustancial adicional, la lista de vacunas de vectores virales autorizadas para uso humano es corta, en parte debido al largo y difícil camino hacia la licencia humana (para una revisión, ver Ref. 3). Las cuestiones relativas a la producción a gran escala y la estabilidad de tales vacunas a menudo requieren una inversión científica sustancial, y deben cumplirse estrictos requisitos de seguridad para los virus que, en su estado natural, tienen el potencial de ser patógenos humanos. Esto es especialmente cierto para aquellos vectores virales que siguen siendo competentes para la replicación o que, por su naturaleza, persisten en el hospedador más allá del período inflamatorio. De hecho, en el sentido más simple, sigue existiendo un rango de seguridad que aumenta con la atenuación, que históricamente tuvo que equilibrarse con la creencia de que una capacidad de replicación reducida daría como resultado una inmunogenicidad reducida. Sin embargo, a pesar de estos desafíos, posiblemente el factor más importante que impulsa el desarrollo continuo de vacunas de vectores virales es su inmunogenicidad prometedora, especialmente con algunos de los antígenos más difíciles de la naturaleza que pertenecen a algunos de los patógenos y cánceres más resistentes del mundo (Tabla 1).

En la mayoría de los casos, una infección viral que se replica es muy eficaz para provocar respuestas inmunes robustas en un huésped que pueden durar varios años. Esto contrasta con muchos antígenos recombinantes que se administran como proteínas o plásmidos de ADN de subunidad, aunque se considera que son razonablemente seguros (que dependen del adyuvante), con frecuencia han sufrido una inmunogenicidad deficiente. Por el contrario, los vectores de vacunas virales que se replican en vivo con un vigor que es similar a sus parentales de tipo salvaje, a menudo son altamente inmunogénicos, pero también conllevan el riesgo de recombinación, reactogenicidad o reversión a la virulencia. La búsqueda de un medio óptimo ha impulsado un renovado esfuerzo en el desarrollo de vectores virales atenuados con defectos de replicación, una estrategia dirigida a maximizar la inmunogenicidad y la seguridad (Fig. 1).

Se han desarrollado vectores virales atenuados con replicación defectuosa como parte de una estrategia para maximizar la inmunogenicidad y la seguridad. Se encuentran en medio de un rango de complejidad y potencial de replicación, entre tecnologías de vacunas en ambos extremos que han sido autorizadas para uso humano. Aunque el desarrollo de vacunas clínicas requiere un programa de trabajo a largo plazo, la licencia de tales vacunas vectorizadas (si se demuestra que son seguras y eficaces) sigue siendo un objetivo totalmente alcanzable y realista. AAV, virus adenoasociado AdV, adenovirus AS01, sistema adyuvante 01 de GlaxoSmithKline HPV, virus del papiloma humano MF59, adyuvante en emulsión de aceite en agua de Novartis MVA, virus vaccinia modificado Ankara VEE, virus de la encefalitis equina venezolana VLP, partículas similares a virus.

Virus atenuantes como vectores de vacunas.

Uno de los avances que sustentan el campo de las vacunas virales durante la última década ha sido la constatación de que la capacidad de replicación y la virulencia viral no siempre se correlacionan con la solidez inmunológica. Por ejemplo, el VACV y sus primos más seguros y altamente atenuados (con replicación defectuosa), el virus vaccinia modificado Ankara (MVA) 4,5,6 y el virus vaccinia atenuado de Nueva York (NYVAC) 7, han mostrado una inmunogenicidad comparable y, a veces, incluso mejor en animales. estudios 8,9,10,11. Actualmente, una amplia gama de familias de virus se encuentran en desarrollo intensivo como vectores de vacunas para uso humano o veterinario, incluidas algunas que son competentes para la replicación, pero también muchas que están específicamente atenuadas. La Tabla 1 describe las principales familias de virus que están en desarrollo como vectores y sus enfermedades asociadas.

Evasión inmune: implicaciones para la atenuación. Históricamente, la atenuación de los virus ha sido empírica, mediante el paso continuo en líneas celulares transformadas o en huéspedes atípicos, y mediante la administración por vías no naturales. Muchos virus son patógenos complejos, y los virus de ADN de gran tamaño, como los poxvirus, los adenovirus (AdV) y los herpesvirus, han dedicado gran parte de sus genomas a genes que les permiten evadir las respuestas inmunitarias del huésped. Muchos de estos genes virales codifican proteínas que afectan a las defensas inmunitarias específicas, incluidas aquellas que actúan sobre vías innatas tempranas como las vías que involucran interferones 12, receptores de reconocimiento de patrones (receptores tipo Toll TLR) 13,14, quimiocinas 15,16 y citocinas 17, como así como aquellos que actúan sobre las respuestas adaptativas posteriores al alterar el procesamiento del complejo principal de histocompatibilidad de los péptidos virales 18,19,20. Hasta la fecha, la mayoría de los procesos de atenuación, por ejemplo, a través de in vitro pasaje en líneas celulares: no son selectivos de los tipos de genes virales que se pierden o se alteran. En última instancia, las variantes virales se han seleccionado por su falta de efectos deletéreos en animales pequeños, de modo que ya no son patógenos y hacen poco o ningún daño al huésped. Sin embargo, los genes virales que se pierden o se alteran durante el proceso de atenuación inespecífica pueden no ser necesariamente los más óptimos en términos de mejorar un virus para la presentación inmune de insertos recombinantes con un efecto adyuvante más potente. Dado que muchos genomas virales ahora están bien caracterizados, los esfuerzos futuros para mejorar las propiedades adyuvantes de los vectores virales y diseñarlos para inducir diferentes tipos de respuestas se basarán en la selección de genes virales específicos que afectan de manera diferencial el sistema inmunológico del huésped. Por ejemplo, la eliminación de genes virales que han evolucionado para reducir las respuestas inmunitarias antivirales del huésped podría reducir las propiedades de evasión inmunitaria y mejorar las características específicas de los adyuvantes de ciertos vectores virales; sin embargo, las respuestas antivectoriales pueden impedir la reutilización posterior de ese vector en un individuo. .

Atenuación empírica versus atenuación racional. Los poxvirus atenuados se utilizaron por primera vez durante la campaña de erradicación de la viruela y desde entonces se han desarrollado y explotado como vectores de vacunas. Uno de estos, MVA, se pasó más de 570 veces en fibroblastos de embriones de pollo, perdió aproximadamente el 15% de su genoma y, en última instancia, tuvo una replicación defectuosa en células de mamíferos 4, 21, 22. Por el contrario, NYVAC se derivó del aislado de Copenhague de VACV mediante la eliminación de 18 ORF diferentes a través de in vitro recombinación, que causó deficiencia de replicación 7. Varios estudios recientes han indicado que el MVA mantiene una fuerte capacidad inmunoestimuladora, quizás incluso mayor que la del NYVAC 23,24,25,26, mientras que un estudio reciente en primates de candidatos a vacuna contra el VIH-1 mostró que estos dos vectores derivados de la vacuna inducían cualitativamente diferentes tipos de respuestas inmunitarias codificadas Gag-Pol-Nef (antígeno específico de grupo-polimerasa-factor negativo del VIH-1) y antígenos de la envoltura (Env) - NYVAC indujo una respuesta dominante de linfocitos T CD4 +, mientras que MVA indujo un CD8 más fuerte + Respuesta de células T y respuestas de células T CD4 + acompañantes 27. La acción combinada de muchas proteínas virales, algunas de las cuales actúan sobre las vías de señalización de TLR y otras funciones de las células presentadoras de antígenos, probablemente explica estas diferencias. Hasta que haya mejores ensayos predictivos para en vivo resultado, el proceso seguirá siendo en gran medida empírico y dependerá de los mejores en vivo modelos para evaluar las propiedades inmunoestimuladoras de cada vector. No obstante, en el caso de MVA atenuado empíricamente, la deleción racional de genes puede mejorar aún más la inmunogenicidad, con dos informes que demuestran que la deleción de B15R, que codifica un receptor soluble de interleucina-1β (IL-1β), puede aumentar la respuesta de las células T CD8 + de memoria específica del virus 28,29. De manera similar, al reducir la expresión génica específica del vector de un VACV recombinante, la respuesta de las células T CD8 + al vector en sí puede disminuir y, en consecuencia, aumentarse contra el transgén 30. Se espera que los esfuerzos futuros continúen en esta línea, con el objetivo de eliminar más genes, solos y en combinación, en un intento de mejorar racionalmente la inmunogenicidad de estos vectores virales.

Mejora de la inmunogenicidad

Regímenes de prime-boost. En la década de 1990, la emoción rodeó el advenimiento de las vacunas de plásmido de ADN. Sin embargo, pronto se hizo evidente que las vacunas de ADN por sí mismas no eran suficientemente inmunogénicas para generar respuestas de células T de una magnitud suficiente para proteger contra enfermedades difíciles en humanos 31,32. Con los avances en los ensayos cuantitativos de células T que se utilizan en los ensayos clínicos, incluido el ex vivo interferón-γ ELISPOT (mancha inmunoabsorbente ligada a enzimas) y ensayos ELISPOT de interferón-γ cultivado, así como citometría de flujo multiparamétrica 33,34, los vectores virales volvieron a ocupar un lugar central tras la demostración de su potencia mejorada para la respuesta inmunitaria celular en comparación con otros tipos de vacunas 35 , 36. Sin embargo, a diferencia de las vacunas de ADN, después de una o dos administraciones en vivo, las respuestas del huésped a las proteínas estructurales del propio vector viral se vuelven autolimitantes, lo que conduce a una disminución de las respuestas contra el inserto de vacuna cuando el vector se usa para múltiples inmunizaciones. Se ha requerido el desarrollo de protocolos de cebado-refuerzo para superar estas respuestas anti-vector mientras se maximiza la respuesta del huésped al inserto de la vacuna.

Inicialmente, los protocolos de cebado-refuerzo heterólogos con insertos de vacunas comunes a menudo usaban un plásmido de ADN para cebar el sistema inmunológico; sin embargo, más recientemente ha crecido el interés en el uso de combinaciones de diferentes vectores virales recombinantes y en cómo su secuencia de administración puede influir en la naturaleza de la respuesta inmune inducida. Se han probado múltiples enfoques tanto en modelos animales como en humanos, incluidos ADN – MVA, ADN – NYVAC, virus de la viruela aviar (FPV) –MVA, influenza – MVA, AdV – MVA, heterólogo AdV – AdV y ADN – Sendai virus, dirigidos una amplia gama de enfermedades, desde malaria, VIH-1, tuberculosis (TB) y hepatitis C hasta cánceres (Tabla 2). Una observación constante a lo largo de todos estos estudios es la capacidad diferencial de ciertos vectores para cebar o potenciar las respuestas. Las vacunas de ADN, el FPV y el virus de la influenza son buenos vectores de cebado, mientras que los poxvirus (MVA y NYVAC) pueden estimular constantemente las respuestas de las células T que se activan por otros medios. Una gran cantidad de datos indica ahora que, en general, el AdV recombinante puede cebar y potenciar las respuestas de las células T y de las células B notablemente bien 10,31,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. Más recientemente, se ha utilizado una combinación de tres modalidades de vectores no relacionados que expresan el mismo inserto de vacuna 47,48. La evaluación de estos vectores ha sido ayudada por un análisis más profundo, en particular utilizando citometría de flujo multiparamétrica 34, que permite la disección de las diferentes poblaciones de células T, tanto fenotípicamente como en términos de producción de citocinas y función efectora, que son inducidos por vectores y regímenes tan diferentes 27,37,49,50,51,52,53. Correlacionar los resultados protectores de "calidad versus cantidad" de las respuestas de las células T que son inducidas por estos diferentes regímenes de inmunización y estrategias de vectores sigue siendo un desafío para el campo.

Mejora de la inmunidad humoral. Un trabajo más reciente ha establecido el uso de regímenes de inmunización de refuerzo para inducir respuestas de células B y T, en particular AdV-MVA o regímenes heterólogos AdV-AdV 39,40. Es probable que la inducción de ambos brazos de la respuesta inmune adaptativa sea beneficiosa para la protección contra patógenos como los parásitos de la malaria y muchos virus, en contraste con las micobacterias, para las cuales la inmunidad celular es probablemente el mecanismo protector dominante. Los vectores AdV parecen ser capaces de cebar y aumentar las respuestas de las células B, en contraste con los vectores MVA, que son mucho más capaces de impulsar la respuesta que de cebarla. Esto puede ser el resultado de una expresión de antígeno prolongada de alto nivel después de la inmunización con AdV que es más beneficiosa para el cebado de células B, en comparación con una breve ráfaga de antígeno de MVA que es más adecuado para el refuerzo de células B 54. Alternativamente, los estudios sobre células dendríticas plasmocitoides han demostrado que una ola de citocinas, específicamente el interferón tipo I (IFN) y luego la IL-6, es esencial para impulsar la diferenciación de las células B en células plasmáticas efectoras en respuesta a la infección por el virus de la influenza 55. Por el contrario, el cebado de las respuestas de anticuerpos específicos del transgén por los vectores AdV parece correlacionarse negativamente con la producción de IFN tipo I 56,57, que también se asocia con una expresión transgénica reducida 58. En el caso de MVA, E3L confiere resistencia al IFN tipo I y es esencial para el crecimiento sostenido de los fibroblastos de embriones de pollo, y E3LEl virus -knockout induce niveles mejorados de IFN e IL-6 de tipo I de pollo en cultivo celular 59,60. Si el cebado de células B por MVA ocurre de manera similar a la inducida por el virus de la influenza, la E3LEl mecanismo de evasión inmune mediado podría explicar el cebado débil de las células B que se observa con este vector. En última instancia, una comprensión mucho mejor de cómo las citocinas pueden afectar la inducción de las respuestas de las células B por diferentes familias de virus es esencial para mejorar el diseño racional de los vectores y las estrategias de cebado y refuerzo que se pueden adaptar para inducir respuestas óptimas de anticuerpos.

Eludir la inmunidad preexistente. Los virus que comúnmente infectan a la población humana traen consigo el problema de la inmunidad preexistente. Para ciertos vectores virales, como los basados ​​en AdV y herpesvirus humanos, esto puede ser un gran obstáculo. Por ejemplo, recientemente se evaluó una vacuna candidata contra el VIH-1 basada en el vector humano AdV serotipo 5 (HAdV-5) en un ensayo de fase II que se llevó a cabo en personas que tenían un alto riesgo de infección por VIH-1. El ensayo se detuvo debido a la falta de eficacia, pero en ese momento se observó una tendencia no significativa hacia una mayor adquisición de la infección por VIH-1 en aquellos individuos con títulos más altos de anticuerpos neutralizantes de HAdV-5 preexistentes en el momento de la inscripción 52, 61. Este problema provocó un intenso debate sobre el uso de este virus humano común como vector de vacuna, pero a pesar de este revés para la plataforma del vector HAdV-5, se están siguiendo activamente otras estrategias para proporcionar alternativas viables que puedan superar la inmunidad vectorial preexistente 62. Estos incluyen modificar el vector para expresar hexones de adenovirus heterólogos 63 o usar adenovirus humanos de serotipos más raros 40,44,64,65 o aquellos de otras especies tales como chimpancés 66,67,68,69,70. Es importante destacar que todos estos nuevos vectores, especialmente los exógenos a una especie, deberán superar los obstáculos regulatorios, de seguridad y de fabricación.

Diseño empírico versus racional de vacunas vectorizadas. Con nuestro creciente conocimiento de inmunología y biología viral, se ha establecido una nueva era de la ciencia en vacunología que ha proporcionado una base futura para el desarrollo racional de vacunas de vectores virales. Optimización del diseño del antígeno de la vacuna de subunidades y comprensión del tropismo del vector, incluido el procesamiento y la presentación del antígeno diana en vivo, es crucial para este enfoque. En el caso de VACV, se ha demostrado que la vía de administración 71, así como el promotor poxviral utilizado para impulsar la expresión del transgén 72, pueden influir en el grado en que los antígenos se presentan directamente o de forma cruzada a las células T. De manera similar, nuevos datos indican que los antígenos estructurales de ortopoxvirus, que se expresan tardíamente en la infección y normalmente se les impide ingresar a la vía de presentación directa debido a una infección abortiva en las células presentadoras de antígenos, también se ocultan específicamente en las fábricas de virus, escapando así de la presentación cruzada. vía y obstaculizar la inducción de respuestas de células T CD8 + específicas de poxvirus 73. Este no es el caso de los antígenos extraños dirigidos por los promotores tempranos o tardíos del poxvirus, porque estos antígenos no suelen dirigirse a tales fábricas de poxvirus. Es importante que se comprendan mejor las consecuencias de tales observaciones para las respuestas de las células T inducidas por la vacuna contra el vector y el transgén, y estos datos pueden comenzar a explicar por qué los vectores de poxvirus como el MVA han demostrado ser efectivos para reforzar la inmunidad. respuestas en humanos 12 meses después de una inmunización previa con el mismo vector 74.

Inmunidad a la "ingeniería". En contraste con las formidables complejidades de la inmunidad anti-vector que está asociada con los virus de ADN persistentes como los adenovirus, los lentivirus modificados genéticamente desprovistos de gran parte de sus antígenos estructurales se han desarrollado como vectores para administrar genes a células específicas. en vivo para la inmunización intracelular 75. Esto es posible en parte por la mínima expresión de los genes del vector de lentivirus y en parte porque se repiten en vivo la administración (como en la inmunización tradicional) no es el objetivo. De hecho, los lentivirus se están utilizando actualmente para "diseñar inmunidad" para el cáncer y el VIH-1 (Refs. 76, 77). La transducción de células madre hematopoyéticas con lentivirus que contienen genes de receptores de células T ha entrado ahora en pruebas clínicas para la inmunoterapia del cáncer. También se ha logrado un progreso preclínico sustancial usando estos vectores para transducir células CD34 + humanas con genes de receptores de células B que codifican anticuerpos monoclonales neutralizantes contra VIH-1 (Ref. 76). También se han desarrollado estrategias para dirigir vectores lentivirales a tipos de células específicos, como subconjuntos de células dendríticas (DC) de la piel, por ejemplo, una versión mutada de la proteína fusogénica del virus Sindbis que conserva la capacidad de unirse a DC-SIGN (células dendríticas específicas Se han desarrollado proteínas no integrinas que capturan ICAM3 78. El desarrollo de nuevas tecnologías de focalización específicas podría mejorar en gran medida el diseño racional de vacunas de vectores virales que inducen respuestas inmunes efectivas y personalizadas para la prevención de una amplia gama de enfermedades infecciosas y cánceres.

Avances en vacunas veterinarias

Las aplicaciones más exitosas de las vacunas de vectores virales han sido sin duda en el campo veterinario. Esto contrasta con el desarrollo de vacunas para uso humano, que implica requisitos reglamentarios más estrictos, ensayos clínicos escalonados en voluntarios humanos y un mayor tiempo para obtener la licencia y el retorno de la inversión. Actualmente, al menos 12 vacunas de vectores virales están autorizadas para uso veterinario (Tabla 3), y muchas más están en desarrollo (para una revisión, ver Refs 79, 80). No obstante, estas tecnologías aún enfrentan una lucha cuesta arriba contra la competencia de las vacunas inactivadas clásicas, que a menudo son más fáciles de producir. Los desafíos de controlar la influenza aviar en las aves de corral están impulsados ​​por la economía y requieren estrategias de vacunación masiva, como la administración en el agua potable, mediante aerosol o mediante inmunización. en ovo 81 (Figura 2). Mantener bajos los costos de estas vías de administración mientras se mantiene la eficacia de la vacuna plantea desafíos considerables para las tecnologías de vectores virales recombinantes. Un enfoque exitoso ha sido utilizar el nuevo virus recombinante de la enfermedad de Newcastle (NDV), que proporciona un método bivalente para el control de dos patógenos aviares diferentes a la vez mediante en ovo inmunización 82. Se están estudiando nuevas estrategias de vacuna para otro patógeno veterinario importante y altamente contagioso, el virus de la fiebre aftosa (FADV) 83, utilizando HAdV-5 de replicación defectuosa. Se ha obtenido inmunidad protectora en bovinos y cerdos 7 días después de una única inmunización con HAdV-5 recombinante que expresa la cápside del virus de la fiebre aftosa y los antígenos de proteasa 84,85. A diferencia de las vacunas de virus completo inactivado, la capacidad de distinguir entre animales infectados y vacunados (DIVA, véase el recuadro 1) utilizando esta plataforma de vacuna de vectores, junto con una bioseguridad mucho mayor, haría que esta tecnología eficaz fuera muy deseable para los países libres del virus de la fiebre aftosa. De manera similar, con respecto a patógenos respiratorios importantes del ganado como la tuberculosis bovina, se están explorando vectores de vacunas recombinantes HAdV-5 o MVA. Estos vectores, que expresan el antígeno micobacteriano micolil transferasa 85A, se han descrito como agentes estimulantes eficaces para la Mycobacterium bovis Vacuna contra el bacilo de Calmette-Guérin (BCG) en bovinos 86,87,88. Ahora se requieren experimentos de desafío para evaluar la protección con estos regímenes de refuerzo de vectores primarios de BCG en rebaños de ganado vacuno inmunizado después de la exposición directa y también en un entorno de transmisión natural. Si es más eficaz que la vacuna BCG por sí sola, el uso de vacunas vectorizadas para estimular las respuestas preparadas con BCG podría ser prometedor para el control de la tuberculosis bovina, que se estima que le cuesta al mundo aproximadamente US $ 3.000 millones por año. Es importante destacar que el entorno de la tuberculosis bovina sigue proporcionando información inmunológica útil para el diseño y la prueba de vacunas contra la tuberculosis humana candidatas 89.

Se muestran las posibles ventajas (+) y desventajas (-) para varias posibles vías de vacunación. a | La inmunización intramuscular constituye el enfoque principal de la vacunación humana, con pequeñas excepciones como Mycobacterium bovis vacuna contra el bacilo de Calmette-Guérin (BCG) que se administra de forma rutinaria por vía intradérmica. En la actualidad, avanza el trabajo para desarrollar dispositivos transcutáneos sin aguja, como parches recubiertos con vacuna, que se pueden aplicar por sí mismos en ausencia de una persona capacitada, una ventaja obvia para la vacunación masiva y de emergencia. Ciertas vacunas contra el cáncer también se pueden administrar por vía intravenosa, pero en general las preocupaciones de seguridad siguen siendo altas para esta vía. La inmunidad de las mucosas se puede mejorar en el tracto gastrointestinal (GI) y respiratorio mediante el uso de vacunas orales o en aerosol. Esto puede mejorar la inmunidad protectora frente a patógenos, por ejemplo, frente a la infección por tuberculosis en los pulmones o la infección por VIH en el tejido mucoso. El adenovirus recombinante humano de serotipo 41 (HAdV-41), un patógeno entérico natural, puede resultar un vector más adecuado para la vía oral, dado que se ha informado que estimula las respuestas inmunitarias en condiciones ácidas 127. Sin embargo, todavía queda mucho trabajo por hacer en términos de demostrar y mantener la seguridad, eficacia, estabilidad y dosificación de la vacuna antes de que estas vías de vacunación puedan usarse ampliamente en humanos.Mantener bajos los costos de usar cualquiera de estas vías de administración menos estándar en humanos mientras se mantiene la eficacia de la vacuna y, lo que es más importante, la seguridad plantea desafíos considerables para las tecnologías de vectores virales recombinantes, y aún se requiere mucha investigación de prueba de concepto. B | Las vacunas veterinarias también utilizan las vías de inmunización parenteral estándar (intradérmica e intramuscular), pero el uso de vías alternativas como la administración en el agua de bebida, mediante aerosol o mediante inmunización. en ovo están impulsados ​​por la economía, los requisitos de seguridad menos estrictos en los animales y la necesidad frecuente de estrategias de vacunación masiva.

Vacunas para enfermedades infecciosas humanas

Las vacunas de vectores virales se desarrollaron originalmente para inducir respuestas protectoras de células T contra patógenos intracelulares. Sin embargo, hasta la fecha, ni una vacuna de vector viral ni una vacuna que actúa directamente por inmunidad mediada por células T (con la posible excepción de BCG) ha sido autorizada para uso humano. Esta situación se ve agravada por el hecho de que estos nuevos enfoques se han elegido para algunos de los patógenos humanos más complejos para los que los enfoques de vacunas convencionales no han sido efectivos. Éstos incluyen Plasmodium falciparum malaria, Tuberculosis micobacteriana y VIH-1. No obstante, se han logrado avances sustanciales con las tecnologías de vacunas víricas recombinantes. En la Tabla 2 se presenta una lista de vectores que se encuentran actualmente en desarrollo para uso humano. Actualmente se reportan niveles impresionantes de inmunogenicidad de células T por primera vez en ensayos clínicos en humanos, un objetivo que, a pesar de los grandes esfuerzos, aún no se ha logrado. solo mediante tecnologías de vacuna de plásmido de ADN. La clave de este avance ha sido el desarrollo de vacunas con vector de AdV: AdV tiene una capacidad notable para cebar respuestas inmunes contra un transgén que se puede impulsar a niveles altos con un segundo vector que es recombinante para el mismo antígeno, típicamente MVA o un segundo AdV de serotipo heterólogo. De manera similar, tanto el MVA como el AdV pueden estimular sustancialmente las respuestas inmunes preparadas por otros medios, por ejemplo, la vacuna BCG. En la Tabla 4 se proporciona una comparación de estos dos vectores ampliamente utilizados.

Vacunas contra la malaria. Se han logrado avances recientes utilizando una mezcla de dos vectores HAdV-5 que expresan la proteína circumsporozoíto del antígeno de la malaria en etapa preeritrocítica (CSP) o el antígeno 1 de la membrana apical del antígeno de la malaria en etapa sanguínea (AMA1) 90. Después de una única inmunización en voluntarios humanos, se midió una respuesta media impresionante a cada antígeno de 500 a 1000 unidades formadoras de manchas (SFU) por millón de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante ex vivo IFN-γ ELISPOT. Los estudios de depleción definieron la respuesta como una respuesta mixta de células T CD8 + y CD4 +, con el fenotipo CD8 + de tres a cinco veces más frecuente que el fenotipo CD4 + entre las células respondedores secretoras de IFN-γ, según lo medido por citometría de flujo (M. Sedegah y T. Richie, comunicación personal). En un esfuerzo por evitar el problema de las respuestas preexistentes del huésped al HAdV-5, también se están desarrollando adenovirus recombinantes de serotipos humanos raros o de primates no humanos como candidatos a vacunas contra la malaria. El cebado y refuerzo con AdV heterólogos, como HAdV-35 y HAdV-11, se está explorando preclínicamente 44 y, de manera alentadora, un adenovirus recombinante de chimpancé serotipo 63 (AdCh63) 70 que expresa el antígeno en etapa preeritrocítica con proteína de adhesión relacionada con trombospondina fusionada a una cadena de múltiples epítopos (ME-TRAP) seguido de un refuerzo con MVA provoca niveles medios de & gt1.000 SFU por millón de PBMC contra el antígeno de la malaria en voluntarios humanos (A. Hill, comunicación personal). Otros estudios preclínicos también han informado del uso de un régimen AdV-MVA en ratones para inducir respuestas de anticuerpos de títulos altos y respuestas potentes de células T. Este régimen específico de HAdV-5-MVA, que utiliza vectores que son recombinantes para la proteína de superficie del merozoíto del antígeno del paludismo en estadio sanguíneo 1 (MSP1), indujo respuestas protectoras de anticuerpos contra la infección en estadio sanguíneo 39, así como respuestas de células T que fueron parcialmente efectivas contra la infección previa en estadio hepático 91.

Los regímenes de inmunización contra el poxvirus heterólogo y el ADN-poxvirus establecieron el valor de los enfoques de refuerzo en humanos, logrando respuestas de células T mucho más fuertes en los ensayos clínicos que los enfoques de un solo vector 31,38,92. No obstante, la eficacia fue limitada, por lo que serán importantes los estudios de provocación contra el paludismo en fase IIa de estas nuevas vacunas con vectores de AdV, programados para 2009-2010. Incluso si tienen éxito, estos candidatos a vacunas prometedoras enfrentarán desafíos adicionales, incluidos los problemas potenciales de inmunidad preexistente de alto nivel al vector HAdV-5 en la población humana (especialmente africana) 93. Además, queda por ver cómo serán los vectores de AdV inmunogénicos en la población objetivo de niños africanos pequeños. En niños entre 1 y 6 años de edad, que viven en áreas de alta transmisión de la malaria, se ha informado de una inmunogenicidad reducida de la vacuna en comparación con los adultos africanos naturalmente inmunes y los voluntarios sin experiencia en malaria en los países desarrollados 94.

Vacunas contra la tuberculosis. Al igual que ocurre con la malaria, se están llevando a cabo programas de vacunas vectoriales muy prometedores para la tuberculosis humana. Estos permanecen algo obstaculizados en ausencia de un modelo experimental de desafío humano, aunque se están realizando esfuerzos para desarrollar M. bovis BCG como desafío sustituto para M. tuberculosis en humanos 86. En consecuencia, los ensayos de campo de eficacia siguen siendo esenciales una vez que se han seleccionado las vacunas candidatas, un proceso que es largo y costoso. Un régimen de refuerzo de BCG prime y MVA-85A (un vector MVA que contiene el gen que codifica el antígeno micobacteriano micolil transferasa 85A) está entrando ahora en un estudio de eficacia de fase IIb en Sudáfrica y hasta ahora ha demostrado altos niveles de inmunogenicidad de células T tanto en el Reino Unido y África, y un excelente historial de seguridad en más de 500 personas, incluidos adultos, adolescentes, lactantes, personas con VIH y personas infectadas de forma latente con M. tuberculosis 51,95,96,97. El campo de la vacuna contra la tuberculosis también está desarrollando vacunas candidatas a vectores de AdV y utilizando enfoques similares para eludir las respuestas anti-HAdV-5 humanas mediante el uso de serotipos humanos raros como el HAdV-35. Un candidato a vacuna HAdV-35 que exprese una fusión de tres antígenos de TB, 85A, 85B y 10.4 (Ref.98), puede estimular las respuestas de las células T que son cebadas por BCG o BCG recombinante en primates no humanos 99, estableciendo un enfoque que se está probando en humanos 100. Se ha informado de una respuesta mixta de células T CD8 + y CD4 + en estudios de fase I tanto en EE.UU. como en Sudáfrica 137, pero la contribución de las respuestas de células T CD8 + a la inmunidad humana contra la tuberculosis sigue sin estar clara. Para las dos principales candidatas a vacunas de vectores virales, los estudios preclínicos ahora están investigando activamente el potencial de administración en aerosol en lugar de sistémica, posiblemente usando nebulizadores, para tratar de mejorar la inmunidad de la mucosa que puede ser más protectora contra M. tuberculosis infección 50 (Fig. 2). Se necesitan más datos preclínicos de primates no humanos si queremos abordar estas cuestiones inmunológicas pendientes.

Flavivirus. La fiebre amarilla, una enfermedad viral, está resurgiendo en humanos ingenuos debido a un cambio en su epidemiología. Una vacuna atenuada de gran eficacia (YFV-17D) se ha utilizado en seres humanos durante más de 70 años 101. Con el desarrollo de vectores de flavivirus vivos atenuados basados ​​en YFV-17D, se ha desarrollado un programa de desarrollo racional de vacunas de flavivirus 102 en el que el preM – Env Los genes, que codifican las proteínas de la envoltura y la premembrana del flavivirus, han sido reemplazados por los del virus del Nilo Occidental, el virus de la encefalitis japonesa o el virus del dengue para generar vectores quiméricos. Ha sido mucho más difícil expresar de forma estable antígenos distintos de flavivirus en estos vectores, pero se ha informado de la inserción de epítopos distintos de flavivirus 103, al igual que la inserción estable de GFP 104. Después de pruebas extensivas y exitosas de seguridad e inmunogenicidad en ensayos de Fase I-III, el flavivirus quimérico para la encefalitis japonesa bien puede ser la primera vacuna de vector viral que se autorice para su uso en humanos 105.

Virus de la gripe. El desarrollo de una vacuna contra la influenza de cepas cruzadas sería un logro importante y buscado desde hace mucho tiempo, especialmente dada la emergencia estacional continua de nuevas variantes de influenza, la actual pandemia del virus de influenza A H1N1 y la posibilidad de un brote de influenza aviar altamente patógena. La inducción de respuestas protectoras de células T contra antígenos internos conservados de la influenza, en lugar de respuestas de anticuerpos específicos de variantes contra antígenos de hemaglutinina y neuraminidasa de superficie, es un enfoque que puede tener posibilidades de éxito. Actualmente se están realizando ensayos de fase I de una nueva vacuna candidata contra la influenza de cepas cruzadas, utilizando un vector MVA que expresa la nucleoproteína interna altamente conservada y los antígenos de la influenza A de la matriz 1 (NP-M1). Este vector puede estimular las respuestas de las células T en individuos que presumiblemente están preparados por exposición natural (S. Gilbert, comunicación personal). Si estas respuestas de células T están asociadas con protección, como sugiere alguna evidencia 106, entonces un enfoque de vacuna con vector viral podría resultar altamente rentable en comparación con las inmunizaciones contra la influenza estacional destinadas a inducir anticuerpos contra los antígenos de la capa superficial específicos de la variante.

VIH. Quizás un desafío mayor para el desarrollo de vacunas que la variabilidad estacional y la deriva antigénica del virus de la influenza es la epidemia del VIH en constante evolución. Las vacunas inductoras de células T para el VIH-1 tienen como objetivo reducir la carga viral y la pérdida de células T CD4 +, prolongar la supervivencia y reducir la transmisión 107. Los esfuerzos renovados se centran en los regímenes de poxvirus que utilizan el virus de la viruela del canario atenuado (ALVAC), MVA o NYVAC. Cada uno de estos vectores de vacunas de poxvirus se ha desarrollado y evaluado por su capacidad para inducir respuestas inmunitarias específicas del VIH-1 en humanos. El ensayo clínico de Fase III VIH-1 más reciente utilizó una combinación de ALVAC y AIDSVAX (glucoproteína 120 monomérica del VIH-1) en una gran población comunitaria en la que el riesgo de transmisión se basa en el estilo de vida heterosexual. Aunque el estudio encontró una tendencia alentadora hacia la prevención de la infección por VIH-1 (31,2% de eficacia), no hubo ningún beneficio para la carga viral posterior a la infección o el recuento de células T CD4 + 108. En estudios preclínicos de eficacia en primates no humanos, se ha informado sobre el control de la carga viral y la conservación de los recuentos de células T CD4 + cuando se han utilizado ciertos vectores basados ​​en la viruela en combinaciones heterólogas de cebado y refuerzo para estimular las respuestas cebadas con ADN 41,48. Son capaces de inducir respuestas de anticuerpos contra Env y provocar respuestas de células T de diferentes niveles. En los seres humanos, las respuestas de las células T son de un fenotipo mixto CD4 + y CD8 + y son ampliamente multifuncionales en términos de producción de citocinas 37,109,110. No obstante, existe consenso en que estos regímenes de vacunas deben mejorarse para aumentar la magnitud y amplitud de las respuestas de las células T CD8 + y CD4 + contra antígenos como Gag y Pol, y para inducir anticuerpos neutralizantes de títulos altos o anticuerpos de alta avidez. contra la proteína Env trimérica nativa.

El desarrollo de recombinantes HAdV-5 para la vacunación contra el VIH-1 produjo la vacuna candidata más inmunogénica hasta la fecha, que se llevó adelante en un ensayo de eficacia en humanos, denominado STEP. Los recombinantes HAdV-5 siguieron siendo un enfoque líder para los desarrolladores de vacunas contra el VIH-1 hasta que se terminó el ensayo STEP por motivos de inutilidad 52,61,111. Aunque se han obtenido respuestas de células T mucho más fuertes en los programas de vacunación contra la malaria y la TB en humanos, algunos sugirieron el fracaso del ensayo STEP como motivo para descartar el concepto de vacunas destinadas a inducir la inmunidad mediada por células T. Sin embargo, es alentador que después de cierto desaliento inicial, la discusión se haya reenfocado en una mayor optimización de los inmunógenos y tecnologías de las vacunas 62. De hecho, ahora que se está reportando una inducción de células T mucho más alta para infecciones no relacionadas con el VIH, es hora de igualarlas en el campo de las vacunas contra el VIH. Los desarrolladores de vacunas para el VIH-1 ya han comenzado a centrarse en otras tecnologías de vectores virales quiméricos menos establecidas. El virus Sendai, el citomegalovirus (CMV), el reovirus, el virus del herpes simple y el NDV están siendo evaluados actualmente por una variedad de grupos, incluida la Iniciativa Internacional de Vacunas contra el SIDA (IAVI). El uso reciente de CMV como vector ha demostrado que este vector tiene una eficacia sustancial en el riguroso SIVMAC (virus de inmunodeficiencia de simios del macaco) modelo de desafío con macaco rhesus, excediendo la supresión de la carga viral que se observó con otro estudio utilizando HAdV-5 (Refs 112, 113). Es probable que las estrategias alternativas combinen los regímenes de estimulación inicial más inmunogénicos que están disponibles actualmente, como los regímenes AdV-MVA o heterólogos AdV-AdV o incluso combinaciones triples, para facilitar el reclutamiento de las respuestas tanto de células T como de células B 41,114. Recientemente se ha descrito un régimen de HAdV-26-HAdV-5 recombinante que puede inducir una respuesta de las células T contra el VIS.MAC Mordaza en macacos rhesus que es más fuerte, más polifuncional y más protectora que la respuesta inducida por un régimen homólogo de HAdV-5 40. De hecho, se logró una media de & gt2.000 SFU por millón de PBMC en estos macacos 40, en comparación con alrededor de 300 SFU por millón de PBMC en promedio en voluntarios en el ensayo STEP primo-boost homólogo de HAdV-5 52. Los estudios futuros revelarán si estos enfoques pueden mejorar constantemente los puntos de referencia de control inmunológico y viral que se establecieron mediante la combinación de vectores de vacuna de ADN y HAdV-5 en el VIS.MAC modelo de desafío de macacos rhesus.

Vacunas contra el cáncer. El campo de las vacunas contra el cáncer (para revisiones integrales, ver Refs. 115, 116) no solo ha sufrido el problema de inducir respuestas inmunes fuertes, duraderas y efectivas (un problema compartido con muchas vacunas contra enfermedades infecciosas), sino que también ha intentado hacerlo en ante el desafío único y complejo de romper la tolerancia contra los autoantígenos, que son, por definición, débilmente inmunogénicos o funcionalmente no inmunogénicos en un entorno inmunológicamente comprometido. Curiosamente, parece haber esperanza para ciertas vacunas contra el cáncer en entornos específicos. El uso de vacunas terapéuticas con vectores virales dirigidas al antígeno carcinoembrionario (CEA), en combinación con radiación local, quimioterapia o anticuerpos monoclonales específicos de la proteína 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4), ha mejorado la supervivencia de algunos pacientes 117. En este contexto, se ha observado una `` cascada de antígenos '', en la que las respuestas de las células T al CEA se observaron no solo después de la vacunación, sino también como de novo respuestas a otros antígenos asociados a tumores (TAA), que posiblemente fueron inducidos después de un direccionamiento inmunológico más eficaz de las células cancerosas. Los vectores de MVA que expresan TAA también se encuentran actualmente en ensayos clínicos avanzados como una adición a las terapias de primera línea para los cánceres renal, de próstata y de pulmón de células no pequeñas 118,119,120. Los análisis inmunológicos recientes han indicado que existe una correlación significativa entre el nivel de células asesinas naturales activadas al inicio del estudio y la eficacia posterior en pacientes que reciben quimioterapia más MVA-MUC1-IL-2 para el cáncer de pulmón 121. El nivel de células asesinas naturales activadas podría potencialmente usarse como un biomarcador predictivo para pacientes que podrían beneficiarse de la terapia de combinación de inmunización viral-vector. Al igual que con las infecciones virales inmunocomprometidas, el uso de vacunas contra el cáncer en un entorno terapéutico requerirá el restablecimiento de una respuesta inmunitaria funcional y sólida que pueda mantenerse en un entorno potencialmente tolerogénico, un entorno inducido como parte de la estrategia de evasión inmunitaria. de algunos cánceres. En este sentido, las terapias combinadas albergan la mayor esperanza en el campo de las vacunas contra el cáncer, aunque los datos preclínicos de estudios en ratones 122 y primates 123 no humanos indican que los vectores AdV que expresan TAA candidatos pueden romper la tolerancia. Queda por ver si las vacunas contra el cáncer candidatas basadas en vectores AdV pueden lograr una inmunogenicidad incluso mejor en ensayos en humanos que la observada con inmunoterapias basadas en poxvirus.

La mayoría de los virus han desarrollado mecanismos para evadir las respuestas inmunitarias del huésped y modular el entorno inflamatorio subsiguiente de diferentes formas. Estos atributos evasivos son contrarios a las propiedades inmunoestimuladoras de los adyuvantes de vacunas ideales. Sin embargo, en la nueva era de la genómica, se están dirigiendo genes virales específicos que codifican factores con propiedades inmunoevasivas para mejorar estas propiedades inmunoestimuladoras. Esta nueva ciencia en vacunología no solo utiliza vectores virales bien establecidos, sino que, a medida que se descubren y caracterizan nuevos virus, también se está explorando su utilidad como vectores de vacunas. Por ejemplo, se están llevando a cabo investigaciones que utilizan múltiples estrategias para encontrar vectores alternativos para eludir el problema de la inmunidad del vector preexistente. Estos vectores, combinados con los nuevos regímenes de cebado y refuerzo de vacunas que inducirán respuestas efectoras más fuertes, más amplias y duraderas, ofrecen soluciones prometedoras a los problemas inmunológicos. La aparición de muchos sistemas de vectores nuevos no debe distraer la atención de las grandes oportunidades para mejorar los vectores actuales. Los enfoques que eliminan los genes virales y dan como resultado una mejor presentación de antígenos, mejores efectos adyuvantes y un sesgo intencional de las respuestas inmunitarias son nuevas líneas de investigación importantes. Las nuevas tecnologías incluyen la manipulación más fácil de los genomas del poxvirus mediante la 'recombinación' en los cromosomas artificiales bacterianos 28,124, y la inserción de transgén de alto rendimiento en los vectores AdV, incluido el uso de bacterias. tet elementos operadores en el promotor del transgén para detener la transcripción de transgenes que pueden ser tóxicos o perjudiciales para el crecimiento viral 125. El uso de tales tecnologías se adoptará para una gama de diferentes plataformas de vectores, lo que permitirá el cribado de nuevos vectores de vacunas virales que siguen siendo seguros pero muestran una inmunogenicidad mejorada para los antígenos de vacunas recombinantes que liberan.

El desarrollo de vacunas de vectores virales para su uso en animales y seres humanos enfrenta desafíos sustanciales, tanto en el ámbito científico como en el regulador. Sin embargo, estas tecnologías finalmente están logrando la eficacia en animales y las fuertes respuestas inmunitarias en humanos que se han buscado durante tanto tiempo, en particular en los campos de la malaria, la tuberculosis y la influenza. La traducción de estas nuevas tecnologías facilitará el desarrollo de vacunas contra algunos de los desafíos más difíciles en el campo, como el cáncer y el VIH-1. La licencia de vacunas de vectores virales de replicación deficiente es factible, dado que se encuentran entre los dos extremos de las vacunas de proteína en adyuvante y las vacunas de virus vivos, las cuales, después de un esfuerzo considerable, ya han sido autorizadas anteriormente. Con la primera vacuna quimérica de flavivirus contra el virus de la encefalitis japonesa pendiente de aprobación regulatoria, el camino está allanado para muchas otras vacunas de vectores virales en desarrollo clínico avanzado. Los próximos 25 años serán un momento desafiante pero emocionante para este renacimiento de la ciencia de las vacunas.

Recuadro 1 | Diferenciación de animales infectados de vacunados

En el caso de determinadas infecciones del ganado, se dispone de vacunas convencionales eficaces, pero no se pueden utilizar sin interferir con el seguimiento de la enfermedad basado en pruebas serológicas. Tanto la infección natural como la vacunación dan como resultado un animal seropositivo. Un ejemplo clásico es el virus de la fiebre aftosa (FAF) en el ganado: aunque las vacunas inactivadas se pueden utilizar de forma eficaz para controlar la enfermedad, no se utilizan de forma rutinaria en los países `` libres de fiebre aftosa '', ya que esto comprometería un país libre de enfermedad. estatus y dar lugar a importantes repercusiones económicas para el comercio internacional. Las vacunas contra el virus de la fiebre aftosa se han utilizado para reducir la propagación de la enfermedad durante un brote, aunque los animales vacunados deben ser sacrificados posteriormente para permitir el restablecimiento del estado libre de virus de la fiebre aftosa en ese país 126. Otros ejemplos incluyen la infección del ganado bovino por herpesvirus bovino tipo 1 (que conduce a una rinotraqueítis infecciosa bovina), la peste porcina clásica y la enfermedad de Aujeszky (causada por el virus de la pseudorrabia o el herpesvirus suido 1) en los cerdos 79.

Una alternativa para prevenir este escenario es el desarrollo de vacunas que permitan diferenciar animales infectados de vacunados (DIVA). Esto se logra mediante el uso de vacunas de subunidades (por ejemplo, vectores virales que expresan un solo antígeno del patógeno) o la deleción selectiva de genes identificados de vacunas atenuadas convencionales. Por lo tanto, la vacunación y la infección natural se pueden distinguir serológicamente utilizando ensayos de diagnóstico adecuados que identifiquen las respuestas de anticuerpos contra un antígeno en la vacuna frente a aquellas contra un antígeno que está eliminado o ausente de la vacuna, al que el animal solo está expuesto por infección natural con el medio silvestre. -tipo patógeno.


Vacunas basadas en otras proteínas virales

Además de aprovechar y mejorar la respuesta inmunitaria humoral al antígeno HA, las vacunas universales contra el virus de la influenza podrían beneficiarse de la incorporación de antígenos diversos y más conservados.

Neuraminidasa

Un estudio reciente que utilizó un modelo de desafío de influenza humana sugirió que la actividad de inhibición de la neuraminidasa sérica puede predecir más la susceptibilidad al desafío de virus vivo que el predictor estándar actual de protección, el título de HAI 127,128,129. NA es una glicoproteína transmembrana de tipo II compuesta por 11 subtipos que se dividen en tres grupos genéticos (Fig. 3a). Esta proteína tetramérica elimina los ácidos siálicos terminales y facilita la liberación de partículas virales 130 recién formadas (Fig. 3b). Aunque se han identificado anticuerpos contra NA 131,132,133,134, se sabe poco sobre cómo afectan el resultado de la infección por el virus de la influenza 135. La NA es un fármaco diana validado ya que los inhibidores de molécula pequeña de NA, como el oseltamivir, el zanamivir y el laninamivir, pueden modular la gravedad de la enfermedad 136. La reciente identificación y caracterización de anticuerpos ampliamente protectores que reconocen el sitio activo de NA sugiere que estos anticuerpos podrían potencialmente ser inducidos por vacunas 137. Se cree que la deriva antigénica y el desplazamiento de NA ocurren independientemente de HA. Como resultado, los anticuerpos N2 pueden haber ayudado a limitar la gravedad de la pandemia de H3N2 de 1968, en la que la HA cambió pero la NA no 138. Aunque la importancia potencial de NA como inmunógeno de la influenza se reconoció en el momento de esa pandemia 139,140, ​​los fabricantes actuales de vacunas contra la influenza estacional no están obligados a medir la cantidad o calidad de NA en los productos comercializados. La simple adición de una cantidad conocida de NA conformacionalmente correcta a las vacunas estacionales actuales puede mejorar la eficacia y, potencialmente, la amplitud contra las cepas derivadas de la influenza 141,142. Se están probando esfuerzos adicionales, como la creación de inmunógenos de NA de "consenso" en modelos animales, y pueden ser prometedores para el uso de NA como un componente de una vacuna más universal 143.

a | Árbol filogenético de los subtipos de neuraminidasa (NA) de la influenza A y la influenza B. Influenza A NA se puede dividir en tres subgrupos genéticamente distintos: el grupo 1 consta de N1, N4, N5 y N8, el grupo 2 consta de N2, N3, N6, N7 y N9 y el grupo 3 tiene dos subtipos de NA de murciélagos frugívoros (* N10 y * N11). La barra de escala indica el número de sustituciones de aminoácidos por sitio. B | Estructura de influenza NA. Se muestran las vistas superior e inferior de los tetrámeros de NA. Conservación de secuencias de NA seleccionadas de 1977 a 2018 representadas en rojo (variable) y cian (conservadas) y mapeadas en la estructura cristalina del ectodominio NA de A / California / 04/2009 (H1N1) (PDB 3TI6).

Ectodominio de proteína 2 de matriz

Se ha propuesto el ectodominio de la proteína 2 de la matriz del virus de la influenza A (M2e) como un antígeno de vacuna universal 144,145, pero M2e presenta múltiples desafíos. Aunque el canal iónico M2 es esencial para la gemación del virus de la influenza y el desmontaje del núcleo viral y, por lo tanto, está muy conservado, su ectodominio amino terminal expuesto a la superficie es poco inmunogénico 146. Si M2e se conjuga con varios portadores o se administra como una partícula similar a un virus, su inmunogenicidad mejora 147. De hecho, la protección mediada por IgG de una amplia gama de cepas del virus de la influenza se ha demostrado en modelos animales 148. Sin embargo, esta protección se deriva de las funciones efectoras de Fc, y no se ha establecido un correlato inmunitario sólido de protección 149, lo que dificulta la cuantificación de la inmunidad basada en M2e y limita la medición de la eficacia de la vacuna a grandes ensayos de campo. Un anticuerpo monoclonal humano transferido pasivamente a M2e disminuyó la carga viral en un modelo 150 de exposición a la influenza humana. La respuesta inmune de M2e se puede mejorar con adyuvantes y, en un ensayo clínico de fase I, una vacuna de proteína de fusión de M2e-flagelina indujo fuertes respuestas de anticuerpos a dosis altas, aunque el perfil de reactogenicidad sistémica fue inaceptable 146. Dado que M2e es una proteína relativamente pequeña y se han identificado mutantes de escape viral, es más probable que una vacuna basada en M2e se utilice como complemento de las vacunas basadas en HA para proporcionar inmunidad protectora adicional, especialmente cuando hay un desajuste entre la vacuna y las cepas epidémicas circulantes 151.

Nucleoproteína

La estimulación de las respuestas de las células T CD4 + y / o CD8 +, incluido el reclutamiento de las células de memoria del pulmón 152 residentes en el tejido intraepitelial o las células auxiliares foliculares T que son cruciales para la formación del centro germinal en el ganglio linfático 153, puede mejorar la durabilidad, la potencia y la amplitud de la influenza inmunidad. Se ha demostrado que las respuestas de las células T CD4 + y CD8 + están asociadas con la inmunidad heterosubtípica contra la influenza 154,155,156,157,158. Las células T han sido implicadas, tanto directamente a través de la citotoxicidad mediada por CD8 como indirectamente a través de la ayuda de CD4, en una amplia protección en modelos murinos 159 y primates no humanos 160 de infección por influenza. Aunque la inmunidad basada en células T varía según el tipo de HLA, y aún no se ha establecido una correlación absoluta de protección, los estudios en humanos han asociado un mayor número de células T con reactividad cruzada con protección contra la infección por influenza 161,162. NP es una proteína interna conservada en las cepas de influenza A que se ha identificado como un objetivo de la inmunidad de las células T y se ha estudiado en ensayos clínicos de fase inicial. Una vacuna NP + M1 vectorizada por MVA indujo respuestas de linfocitos T CD4 + y CD8 +, detectadas por inmunospot ligado a enzimas de interferón-γ (IFNγ), en cohortes de edades más jóvenes y mayores (Tabla 2). Esta vacuna también mejoró las respuestas de anticuerpos específicos de la cepa y de las células T cuando se usó junto con las vacunas estacionales 163,164. En una prueba de influenza, los individuos vacunados con MVA NP + M1 tuvieron puntuaciones de síntomas más bajas que los controles no vacunados, aunque el número de individuos estudiados fue pequeño: 66,165. Al igual que en los estudios mencionados anteriormente, se ha descubierto que las plataformas de vacunas basadas en ácidos nucleicos y vectores virales inducen respuestas mejoradas de células T sobre las vacunas tradicionales inactivadas contra la influenza en modelos animales y en un desafío con el virus de la influenza humana 59, 60, 166 y tales plataformas alternativas puede ser necesaria para que una vacuna universal reclute células T.


Discusión

Por primera vez, hemos generado mAbs específicos contra la influenza porcina a partir de los ganglios linfáticos que drenan los pulmones de cerdos infectados con H1N1pdm09. Los anticuerpos son principalmente contra la cabeza HA y están dirigidos hacia dos epítopos inmunodominantes principales: el sitio Sa (residuos 160 y 163) y el sitio Ca (residuo 130), también reconocidos por los seres humanos. La actividad neutralizante de estos mAb de cerdo es comparable a la de los mAb humanos más fuertes. El mAb seleccionado, pb27, redujo la carga viral y la patología después de la administración a 10 mg / kg, lo que resultó en una concentración sérica sostenida de 100 μg / ml con aproximadamente tres logaritmos menos en BAL. Se abolió la carga de virus pulmonar y BAL y se eliminó la patología pulmonar con una dosis de 10 mg / kg. La muda nasal, aunque reducida, no se eliminó.

Aunque recientemente se han generado mAbs porcinos contra la diarrea epidémica porcina, la peste porcina clásica y los virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, aquí mostramos que los mAbs porcinos podrían producirse con alta eficiencia utilizando ganglios linfáticos drenantes en lugar de sangre [9-11]. Detectamos una frecuencia muy baja de células B específicas de HA en la sangre, pero una frecuencia mucho mayor en los tejidos pulmonares locales y las amígdalas. El acceso a los ganglios de drenaje (mediante biopsia con aguja), las amígdalas y el BAL es ciertamente posible en humanos u otros animales grandes y puede aumentar la eficiencia de la generación de mAbs contra una variedad de agentes patógenos.

El repertorio de segmentos de genes IGLV e IGKV de nuestros mAb no tiene, como se esperaba para los cerdos, un sesgo de uso aparente [25, 26]. Es interesante observar que las cadenas de IGH más largas tienden a emparejarse con IGL mientras que las cadenas de IGH más cortas tienden a emparejarse con IGK. Además, las cadenas de IGL tienden a emparejarse con cadenas de IGH que contienen un doble Cys (probablemente un enlace disulfuro) en el CDRH3. Desde un punto de vista evolutivo, es interesante observar que el ganado vacuno utiliza casi exclusivamente IGL y tiene CDRH3 ricas en cisteínas más largas de lo habitual [34,35]. Sin embargo, se analizaron relativamente pocos clones en el presente estudio (n = 45) y es necesario un trabajo futuro para determinar si este fenómeno sigue siendo cierto para un mayor número de clones en todo el repertorio porcino.

Hemos demostrado que un anticuerpo monoclonal fuertemente neutralizante 2-12C contra la cabeza de HA administrado profilácticamente (a 15 mg / kg) a cerdos redujo la carga viral y la patología pulmonar después de la exposición a la influenza H1N1pdm09 en un experimento a corto plazo [23]. Sin embargo, los experimentos terapéuticos más prolongados encuentran el problema de las respuestas de anticuerpos antihumanos. El uso de mAb de cerdo evitará esta dificultad. Aunque todavía no hemos medido las propiedades farmacocinéticas de los mAbs porcinos, su disponibilidad permitirá investigar cómo utilizar los mAbs de manera óptima para prevenir o tratar enfermedades. Es interesante que pb27, un mAb IgG1 porcino, no eliminó la diseminación del virus en los hisopos nasales. Puede ser que una subclase de IgG diferente o una administración local en el tracto respiratorio sea más eficaz para suprimir el desprendimiento nasal.

En nuestro experimento, pb27 se administró 24 h antes de la exposición al virus, mientras que en humanos probablemente se administrarán mAb después de la infección. Se necesitarán más experimentos para determinar la eficacia de la terapia con mAb después de la infección en el modelo porcino. El modelo de influenza porcina también podría usarse para evaluar las plataformas de administración de anticuerpos, el efecto de IgA y diferentes subclases de IgG y el papel de las funciones mediadas por Fc. En particular, dado que los anticuerpos de unión al tallo no neutralizantes se han implicado previamente en el aumento de la enfermedad en el modelo porcino, será importante evaluar la en vivo efecto de anti-tallo mAb pb29, que mejorará nuestra comprensión de la función mediada por Fc en este importante modelo de huésped natural [36].

Todos nuestros mAb son IgG1, mientras que en los cerdos se han informado 6 subclases de IgG diferentes: IgG1, IgG3, IgG5a, IgG5b, IgG6a e IgG6b [37]. No hay información sobre su función Fc y no se dispone de anticuerpos antiinmunoglobulina específicos de subclase debido a la baja demanda del mercado. Se cree que la IgG3 es la secuencia ancestral y el análisis predice que contiene motivos que probablemente permitan la activación del complemento y la unión al receptor de transporte de IgG FcRn [37]. Sin un análisis más detallado, no podemos descartar la posibilidad de que se induzcan otras subclases y no sabemos si la IgG1 es la respuesta predominante a la infección por influenza. Claramente, los ligantes altos de IgG1 mediaron CDC y ADCC, mientras que, por el contrario, el anti-tallo pb29 putativo no logró mediar ni en CDC ni en ADCC. Estudios adicionales determinarán si otros anticuerpos anti-tallo y otras subclases de IgG pueden llevar a cabo funciones mediadas por Fc.

La especificidad de los mAb de cerdo es muy similar a la de los mAb humanos que se sabe que se dirigen a H1N1pdm09 HA. Reconocieron los dos sitios principales Sa (residuos 160 y 163) y Ca (residuo 130). En 2014, los virus H1N1pdm09 adquirieron deriva antigénica por sustitución en la posición K163. Sin embargo, los antisueros de hurón utilizados para el seguimiento de los virus no lograron detectar este cambio antigénico [31,38,39]. Si bien el H1N1pdm09 se originó en los cerdos, se requieren más análisis para confirmar si la especificidad de la respuesta de anticuerpos en los cerdos será similar a la de los humanos para los virus de la influenza estacional, que se replican mal y necesitan adaptación para causar una infección en los cerdos. Sin embargo, hemos demostrado que la LAIV estacional tetravalente 2017-2018 adaptada al frío humana podría inducir respuestas inmunitarias en cerdos, que hubo replicación del componente H3N2 de la vacuna en hisopos nasales y una respuesta inmunitaria más fuerte al H3N2 en comparación con el componente H1N1 [40]. Además, 4 de cada 6 cerdos se infectaron con A / Hong Kong / 4801/2014 (H3N2) y diseminaron virus, aunque a un nivel más bajo y durante un tiempo más corto en comparación con H1N1pdm09 [40].

En general, nuestros resultados indican que el cerdo es un modelo excelente para comprender la mejor manera de aplicar mAbs como terapia en humanos y, dado que los cerdos parecen tener una respuesta de anticuerpos similar a la de los humanos, los antisueros de cerdo podrían ser un mejor sustituto que los antisueros de hurón para detectar la deriva antigénica de la influenza y así informar las recomendaciones de vacunas para humanos.


Resultados

Análisis de secuencia

Se realizó un análisis completo de la secuencia de la proteína HA utilizando secuencias de los subtipos H1, H2, H3 y H5 de Influenza A que estaban disponibles en la base de datos del NCBI, para identificar todas las regiones invariables. El análisis se realizó en dos pasos primero, se generaron perfiles individuales de cada subtipo y luego cada perfil se alineó con el perfil H2 para obtener las alineaciones más significativas. Las gráficas de correlación de H2 con otros subtipos reflejan que los subtipos H2 y H5 y H2 y H1 eran claramente más similares que el par H2-H3 (Figura 1). Los pares H2-H5 y H2-H1 tenían puntuaciones de correlación que oscilaban entre 0,8 y 1,0 para el 66% y el 56% de los residuos de aminoácidos en HA1, respectivamente. Sin embargo, se observó una puntuación de correlación de 0,8-1,0 para sólo el 33% de los residuos en el par H2-H3. Nobusawa ha informado anteriormente de resultados similares. et.al. [18], quienes mostraron que el subtipo H1 exhibía 58,7% y 55,7% de identidad de la subunidad HA1 con las HA1 en los subtipos H2 y H5 respectivamente, y la menor identidad con el subtipo H3 (35,2%).

Se muestra la correlación de H2-H5, H2-H3 y H2-H1 en el dominio HA1. En este análisis se siguió la numeración de los residuos H3.

Los datos de alineación de secuencias se distribuyeron en dos componentes: los residuos con una puntuación de conservación de 0,9 a 1,0 se consideraron residuos conservados y las regiones que contenían 6 residuos o más, donde más del 50% de los residuos tenían una puntuación de conservación de 0,9 a 1,0 se agruparon como regiones conservadas . Usando estos criterios, esperábamos perder algunas posiciones importantes de un solo aminoácido y epítopos conformacionales, pero identificar regiones adecuadas para terapias antivirales / peptídicas. Estos datos identificaron claramente las nueve regiones más conservadas dentro de todos los subtipos, como se muestra en la Tabla 1 y 2. La puntuación de conservación de cada residuo variable dentro de la región conservada identificada se representó entre corchetes, si la variación era el resultado de un residuo similar que no conduciría a ningún cambio. a cargo / hidrofobicidad. La conservación final en cada posición en las regiones conservadas seleccionadas fue mayor de lo que aparece en la Tabla 1 y 2, ya que la variación en las regiones seleccionadas, entre subtipos a menudo resultó en sustituciones similares.

Llegamos a la conclusión de que, a pesar de las grandes diferencias en los subtipos, había regiones de baja variabilidad que podrían ser los principales objetivos de las respuestas antipéptido / antiviral.

Análisis de estructura

El direccionamiento de agentes / anticuerpos antivirales a regiones específicas de la proteína es complejo y no se comprende completamente. Actualmente, no existe un método eficaz para predecir la estructura del epítopo del patógeno y dirigir la respuesta del anticuerpo a regiones predefinidas utilizando proteína como antígeno. Sin embargo, existe evidencia de que los péptidos cortos con especificidad de secuencia predeterminada pueden usarse para generar anticuerpos anti-péptido, que reconocen la región específica de péptido de la proteína [19], [20] y los anticuerpos monoclonales generados contra péptidos sintéticos pueden cruzarse reaccionan con la molécula de proteína intacta [21]. Una gran mayoría de la literatura sugiere que no todas las regiones de proteína reaccionan de forma cruzada con anticuerpos de péptidos sintéticos y una serie de parámetros estructurales como la exposición superficial [22], [23], la hidrofilicidad y el tipo de residuo [17], influyen en esta propensión. Por lo tanto, los parámetros anteriores se evaluaron en cada uno de los nueve sitios identificados para predecir su accesibilidad a los anticuerpos anti-péptido.

La estructura de HA del virus de la influenza A (subtipo H3) cepa A / Aichi / 2/68 fue determinada por Wilson et al., 1981 [24] y, posteriormente, los estudios de virus variantes permitieron el mapeo de sitios antigénicos en la proteína (revisado en ref.10). Más recientemente, se resolvieron las estructuras del virus de la influenza A HA para tres subtipos adicionales: H1 [25], [26], H5 [27] y H9 [28]. Elegimos la estructura H3 (PDB: 1HGJ) para que nuestro análisis se adhiriera a la numeración utilizada en el análisis de secuencia.

La posición de nueve regiones identificadas se mapeó en la estructura tridimensional del monómero HA y se muestra en la Figura 2A como un modelo de cinta. Cada región identificada también se amplió para representar los detalles de la estructura 3-D (Figura 2B). Todos los sitios identificados 1-9 fueron coloreados en rojo (Figura 2B) y sus detalles de estructura secundaria, valor de hidrofobicidad y área de superficie accesible al solvente fueron tabulados (Tabla 3). El sitio 1 estaba presente en el extremo N de HA1. Este sitio contiene el residuo de cisteína conservado que forma un enlace disulfuro con HA2 [10]. El sitio existe como un bucle en el monómero HA con una gran superficie accesible al disolvente. El sitio 2 y el sitio 7 tenían pocos residuos que formaban parte de los sitios de unión de anticuerpos conocidos E y C, respectivamente [10]. El sitio 2 era principalmente α-helicoidal mientras que el sitio 7 tenía principalmente una estructura β. Ambos sitios tenían pequeñas áreas superficiales accesibles al solvente y pueden ser inaccesibles / enterrados en el monómero.

(A) La posición de las regiones conservadas se representó en el monómero HA, que se muestra como un modelo de cinta plana. Se utilizó la estructura cristalina del subtipo H3 (PDB: 1HGJ) para mapear las regiones conservadas identificadas (coloreadas en rojo). (B) Las regiones conservadas que se muestran en la Figura 2A se ampliaron para representar los detalles de la estructura 3-D.

El sitio 3 estaba compuesto por una región α-helicoidal y un bucle con una gran área de superficie accesible al solvente, similar al sitio 1. Esta región era altamente hidrófila y se ha demostrado que es inmunodominante para provocar anticuerpos contra un péptido sintético [29 ], [30]. Sin embargo, esta región no forma parte del sitio de unión del anticuerpo conocido, lo que indica que en solución, esta región puede adquirir alguna conformación que sea accesible solo para los anticuerpos peptídicos.

Los sitios 4 y 6 estaban presentes principalmente como una hoja β y parecían estar ocultos en el monómero. El sitio 8 y el sitio 9 se encontraron ambos en el extremo C-terminal de HA1 y eran principalmente bucles con una gran área superficial accesible al solvente y alta hidrofilia. También se ha demostrado que el sitio 9 provoca una respuesta de anticuerpos neutralizantes contra múltiples subtipos de HA [31].

Este trabajo no identificó el sitio de unión al receptor por separado, pero algunos de los residuos del sitio de unión conservados se ubicaron dentro de los sitios 3, 4 y 5. Esta falta de identificación específica podría deberse a que el sitio de unión al receptor está compuesto por residuos que no son adyacentes en la estructura de la proteína 3-D y varios de los residuos no se conservan [18].

Es más probable una respuesta de anticuerpos con reactividad cruzada general, si los nueve sitios identificados han adoptado estructuras conformacionales similares en los subtipos H1, H2 y H5, como las del subtipo H3. Para probar esto, evaluamos la estructura de los sitios identificados utilizando la estructura H1 (PDB: 1RVZ). Elegimos la estructura H1 sola debido al alto grado de similitud de secuencia entre los subtipos H1, H2 y H5. Además de la similitud de secuencia, los nueve sitios tenían un alto grado de conservación de la estructura, con una superficie y una estructura secundaria accesibles a solventes similares (Tabla 3). Se observaron algunas pequeñas diferencias en la estructura secundaria en los sitios 3, 6 y 7. La naturaleza hidrofóbica / hidrofílica de los sitios también permaneció sin cambios, excepto en el sitio 9, que había aumentado la hidrofobicidad en la estructura H1. Para identificar los sitios que tenían un alto potencial de generar una respuesta anti-péptido, los sitios se clasificaron en función de su superficie accesible al disolvente y su hidrofobicidad. Los sitios hidrófilos se seleccionaron y clasificaron en primer lugar según su superficie accesible al disolvente, seguidos de los sitios hidrófobos (Tabla 3).

Cinco (1, 3, 5, 8, 9) de las nueve regiones invariables identificadas tenían un alto nivel de conservación de la estructura entre los subtipos, una estructura secundaria adecuada y una superficie accesible al solvente significativamente grande para apuntar a un anti-péptido / anti-viral. respuesta.


Desafíos actuales para la fabricación y el uso efectivo de vacunas

El mayor desafío para la fabricación de vacunas para la influenza tanto animal como humana es la alta variabilidad y la rápida evolución del virus que resulta en una búsqueda constante del virus de la vacuna para que coincida con las cepas circulantes. Como resultado, los programas de vacunas actuales dependen de una vigilancia exhaustiva, a escala mundial para las vacunas humanas y a escala regional / local para las vacunas animales. Dado que no existen programas estandarizados para la selección de vacunas en el campo veterinario, las cepas de vacunas a menudo no coinciden y ofrecen una protección subóptima que puede promover, en lugar de detener, la propagación de cepas de campo. Además, los cerdos vacunados con IIV con adyuvante y luego desafiados con un virus heterólogo del mismo subtipo pueden mostrar una patología respiratoria mejorada debido a una fuerte estimulación de la respuesta de anticuerpos no neutralizantes, denominada enfermedad respiratoria mejorada asociada a la vacuna (VAERD Gauger et al., 2011) . Además, una vacuna subóptima puede resultar en mutantes de escape que supondrán una mayor amenaza para las poblaciones de na & # x000EFve.

Otro obstáculo para una vacuna eficaz es el cronograma necesario para la fabricación de la vacuna y las reglamentaciones para su aprobación. El cronograma para la recopilación de datos de vigilancia para la influenza humana intenta incluir el pico de la temporada actual y aumentar las probabilidades de pronosticar correctamente qué virus tienen más probabilidades de circular durante la próxima temporada. Sin embargo, debido a que los fabricantes deben dejar tiempo suficiente para que la producción tenga en cuenta los posibles retrasos, este no es siempre el caso y, en algunos casos, la distribución y composición antigénica de los virus circulantes al final de la temporada difiere de la cepa de vacuna seleccionada, que podría resultar en un desajuste. Desde la selección de la cepa hasta la distribución de la vacuna se necesitan al menos 6 meses, sin considerar posibles contratiempos, como obstáculos en el suministro de huevos o problemas para cumplir con los requisitos de bioseguridad y estabilidad. En cuanto a las vacunas para animales, las cepas no se actualizan con tanta frecuencia y el proceso para obtener licencias de productos nuevos o actualizados podría llevar incluso más tiempo que para las vacunas humanas. Los cambios recientes implementados por el USDA Center for Veterinary Biologics ahora permiten a los fabricantes cambiar o reemplazar cepas bajo una licencia existente sin tener que pasar por un proceso de licencia completamente nuevo (Center for Veterinary Biologics, 2007), lo que representa un avance en el camino hacia el avance. programas de vacunas.

La variación inherente en el estado inmunológico de una población determinada también es un factor importante que influye en la seguridad y eficacia de la vacuna. Por ejemplo, es posible que los grupos de alto riesgo, como los ancianos o las personas inmunodeprimidas, no respondan de manera óptima a la vacunación debido al deterioro de la función inmunitaria (Kunisaki y Janoff, 2009 Lambert et al., 2012). La inmunidad previa de un individuo puede tener un impacto importante en las respuestas a la vacuna. Está bien aceptado que el primer encuentro inmunológico con la influenza, ya sea por infección natural o por vacunación, moldeará las respuestas futuras en la vida de un individuo, un proceso que a menudo se denomina pecado antigénico original y más recientemente como impronta antigénica. Las exposiciones secundarias resultantes tienden a potenciar la respuesta de anticuerpos a la exposición de cebado en detrimento total o parcial de la respuesta inmunológica contra la nueva cepa, un proceso conocido como o estimulante (Fazekas de St y Webster, 1966 Ma et al., 2011 Fonville et al., 2014).

En los sistemas de producción porcina y avícola, los anticuerpos de origen materno en animales jóvenes pueden interferir con las respuestas inmunitarias activas a la vacuna dependiendo de la edad en el momento de la vacunación (Loeffen et al., 2003 De Vriese et al., 2010). Otros obstáculos para la implementación de programas de vacunación en animales de agricultura son los costos, el período prohibitivo de retiro posvacunación, la dificultad para diferenciar los animales vacunados de los infectados y el enmascaramiento de los signos clínicos que pueden resultar en restricciones comerciales (Spackman y Pantin-Jackwood, 2014). ).


Observaciones finales

Hemos descrito el diseño y caracterización de una serie de inmunógenos HA solubles compuestos únicamente por el tallo HA. Aunque todos los mini-HA seleccionados provocaron niveles comparables de anticuerpos contra FL HA, la amplitud y la capacidad protectora de los anticuerpos provocados aumentaron progresivamente con la evolución estructural de la configuración de mini-HA. El candidato final, mini-HA # 4900 trimérico estabilizado, demostró su capacidad única para provocar una respuesta inmunitaria amplia y protectora en ratones y primates no humanos. Ha sido reportado (42, 43) que la estabilización del antígeno F del virus sincitial respiratorio mejora la respuesta inmunitaria y la protección. Nuestros resultados demuestran que el mismo principio se aplica a la influenza HA y proporcionan más orientación para el diseño de una vacuna universal contra la influenza basada en epítopos.