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¿Incorporación incorrecta de dUTP en el ADN?

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El uracilo, la base del ARN, ha sido reemplazado en el ADN por timina (que tiene el mismo emparejamiento de bases con la guanina). Sin embargo, la síntesis de dTTP (más generalmente escrito TTP) requiere dUTP:

¿Hasta qué punto se incorpora dUTP (mis) en el ADN?


Sigue un intento de responder a mi propia pregunta, que creo que es importante considerar en el contexto general de publicaciones en SE Biology sobre uracilo y timina en la síntesis de ADN y ARN.

  1. Parece haber poca incorporación errónea debido a las bajas concentraciones de dUTP en las células.

  2. Cualquier pequeña cantidad de incorporación errónea puede ser manejada por el sistema de reparación del ADN que existe en las células.

Baso la declaración 1 en el trabajo de Grogan et al., publicado en Bioquímica 50, 618 - 627 (2011). Demostraron que tanto en las líneas celulares de ratón como en las humanas, la concentración normal de dUTP (y dUMP) era baja. I asumir que esto debe reflejar que las actividades celulares de dUTPasa y timidilato sintasa son suficientemente altas para eliminar dUTP y dUMP, respectivamente, a medida que se forman. Cuando los fármacos contra el cáncer inhibieron la actividad de la timidilato sintasa, estos nucleótidos se acumularon, como se esperaba.

En apoyo de la Declaración 2, me refiero a un estudio anterior separado sobre levadura de fisión realizado por Seiple et al. en Investigación de Ácidos Nucleicos 34140-151 (2006). Utilizaron el fármaco, 5-fluorouracilo, para inhibir la timidilato sintasa y descubrieron que causaba una incorporación incorrecta de uracilo en el ADN con daño celular concomitante. El papel del sistema de reparación del ADN en la mitigación de este daño se demostró utilizando un mutante en el Ung1 gen, que codifica la ADN glicosilasa; aquí la toxicidad celular fue mucho mayor.

Aunque existen algunas inconsistencias entre los diferentes sistemas utilizados, y dificultades de interpretación. Creo que brindan un apoyo general para los dos postulados. Sería útil si fuera posible localizar datos cinéticos sobre las enzimas relevantes para probar mis suposiciones sobre el motivo de la baja concentración de dUTP.


Monofosfato de timidina

Síntesis de timidilato: La timidilato sintetasa (EC2.1.1.45) metila 2′-desoxiuridina 5′-monofosfato (dUMP) a dTMP usando 5,10-metilen-THF como donante de un carbono.

Síntesis de purinas: Tanto el tercer paso de la síntesis de purinas, catalizado por la transformilasa de glicinamida ribonucleótido (GAR) (EC2.1.2.2), como el penúltimo paso, catalizado por la proteína bifuncional de biosíntesis de purinas (fosforribosil aminoimidazol carboxamida formiltransferasa, EC2.1.2.3), utilizar 10-formil-THF como donante de un carbono.

Metabolismo de los aminoácidos: La homocisteína se remetila en metionina mediante 5-metiltetrahidrofolato-homocisteína S-metiltransferasa (EC2.1.1.13), una enzima citoplasmática con metilcobalamina unida covalentemente. La remetilación de homocisteína convierte el cosustrato 5-metil-THF nuevamente en THF y hace que esta forma esté disponible nuevamente para otras reacciones. El metabolito de la metionina S-adenosil-metionina es el principal donante de grupos metilo para la metilación del ADN y para la síntesis de numerosos compuestos esenciales, incluyendo catecolaminas, carnitina, colina, melatonina y creatina.

La glicina hidroximetiltransferasa (EC2.1.2.1), citosólica y mitocondrial, metila la glicina en serina o cataliza la reacción inversa. El paso final de la conversión de l -histidina en l-glutamato es catalizado por la enzima glutamato formiminotransferasa dependiente de PLP (EC2.1.2.5). El metabolito generado en esta reacción y excretado con la orina en respuesta a una carga de histidina, formiminoglutamato (FIGLU), se ha utilizado en el pasado como marcador de deficiencia de folato.

Utilización de formato: El metabolismo de la colina genera formaldehído en los dos últimos pasos oxidativos. El formaldehído puede reaccionar de forma no enzimática con THF y ATP para generar 10-formil-THF (Figura 10.31) o se convierte en formiato en una reacción que requiere NAD catalizada por formaldehído deshidrogenasa glutatión-dependiente (EC1.2.1.l, idéntica a la clase de alcohol deshidrogenasa III cadena chi, contiene zinc). Una fuente importante de formiato es la liberación no oxidativa de 10-formil-THF por la formiltetrahidrofolato deshidrogenasa (EC1.5.1.6). La principal actividad de esta deshidrogenasa es la liberación oxidativa del grupo formilo del 10-formil-THF en una reacción generadora de NADPH. La formiltetrahidrofolato deshidrogenasa contiene pentaglutamil-THF como cofactor no catalítico fuertemente unido. Las cantidades de formiato generadas a partir del metabolismo del metanol suelen ser pequeñas, pero pueden ser significativas con una alta exposición alimentaria o industrial (Bouchard et al., 2001). El formiato se mueve hacia el citosol donde el formiato-THF ligasa (EC6.3.4.3, una actividad de la proteína trifuncional C1-THF sintasa, MTHFD1) puede unirlo al THF en una reacción dependiente de ATP. Una enzima de eliminación de formiato alternativa es la ligasa de formiato-dihidrofolato (EC6.3.4.17). Esta enzima citosólica dependiente de magnesio une el formiato con el dihidrofolato en una reacción dependiente de ATP. Luego, el dihidrofolato de 10-formilo puede ser utilizado por la fosforribosilaminoimidazol carboxamida formiltransferasa (transformilasa AICAR, EC2.1.2.3) para generar 5-formarnido-l- (5-fosfo-d-ribosil) imidazol-4-carboxarnida (formil-AICAR), el precursor de la síntesis de purinas. Algo de 10-formil-dihidrofolato puede oxidarse de forma no enzimática al producto sin salida 10-formil-folato (Baggott et al., 2001).

El formiato también es un producto liberado en el núcleo como resultado de la desmetilación del ADN y necesita desintoxicarse localmente mediante conversión a 10-formil-THF.

Ritmo circadiano: El criptocromo 1 y el criptocromo 2 son proteínas en las mitocondrias que parecen actuar como fotorreceptores que ayudan a mantener la duración y la ritmicidad del período circadiano; utilizan FAD y folato como cofactores (Sancar, 2000).

El desarrollo fetal: El suministro inadecuado de folato durante las primeras semanas de embarazo aumenta el riesgo de defectos del tubo neural, paladar hendido (Martinelli et al., 2001), cardiopatías congénitas (Kapusta et al., 1999) y otras malformaciones orgánicas. Los mecanismos causales exactos aún no se comprenden bien. Se sabe o se sospecha que las formas menos activas de varios productos génicos implicados en el metabolismo del folato aumentan el riesgo de defectos del tubo neural, incluida la metilen THF reductasa (EC1.5.1.20 Rosenberg et al., 2002), la pteroilpoli-gamma-glutamato carboxipeptidasa (EC3.4.17.21 Devlin et al., 2000), metilentetrahidrofolato deshidrogenasa (MTHFD, C1-THF sintasa, Hal et al., 1998) y RFC1 (De Marco et al., 2001). El riesgo de desprendimiento de placenta y fracaso del embarazo también puede estar relacionado en parte con la disponibilidad inadecuada de folato (Eskes, 2001).

Síntesis de folato en microorganismos: Las sulfamidas inhiben la conjugación del ácido para-aminobenzoico (pABA) con la pterina en las bacterias. Dado que los humanos no pueden sintetizar folato a través de esta reacción, no se ven afectados por su inhibición (Figura 10.32).

Figura 10.32. La desintoxicación con formiato requiere THF como cosustrato y como cofactor enzimático fuertemente unido.


Abstracto

La pirofosfatasa dUTP cataliza la hidrólisis de trifosfato de desoxiuridina (dUTP) a monofosfato de desoxiuridina (dUMP) y pirofosfato inorgánico (PPi). La eliminación de dUTP es vital, ya que su incorporación incorrecta en el ADN por parte de las ADN polimerasas puede iniciar un ciclo de reparación iterativo perjudicial y una incorporación incorrecta, lo que da como resultado la fragmentación del ADN y la muerte celular. Se cree que la actividad antitumoral de los agonistas de folato y los inhibidores de timidilato sintasa se basa en la incorporación errónea de dUTP. Además, la producción de ADNc retrovírico puede ser particularmente susceptible a los efectos de la incorporación errónea de dUTP en virtud de la naturaleza propensa a errores de la transcriptasa inversa. En consecuencia, la actividad de la dUTPasa es un punto de intervención ideal tanto en la quimioterapia como en la terapia antirretroviral. En particular, se ha sugerido que la dUTPasa codificada por un retrovirus endógeno humano (HERV-K) complementa la infección por VIH y, por lo tanto, es un objetivo atractivo para la inhibición específica. Por lo tanto, utilizamos el etiquetado de fotoafinidad del sitio, la mutagénesis dirigida al sitio y el modelado molecular para asignar funciones catalíticas a los residuos de aminoácidos conservados en el sitio activo de la dUTPasa de HERV-K y para identificar diferencias estructurales con otras enzimas dUTPasa. Encontramos que el etiquetado de fotoafinidad de dUTP era específico para un motivo de horquilla β en la dUTPasa de HERV-K. La mutagénesis de los residuos de aspartato Asp84 y 86 a asparagina dentro de esta horquilla β mostró que el resto carboxilato de ambos residuos era necesario para la catálisis pero no para la unión de dUTP. Un aumento en la pKade ambos residuos de aspartato provocados por la sustitución de un residuo de serina con un residuo de glutamato adyacente a los residuos de aspartato aumentaron la actividad en un factor de 1,67 a pH 8,0, lo que implica que la catálisis básica general es el mecanismo catalítico de la enzima. La mutagénesis conservadora de Tyr87 a Phe resultó en una reducción siete veces mayor de la actividad dUTPasa y una reducción de 3.3 veces en la actividad de unión, mientras que la sustitución con un residuo de isoleucina abolió totalmente tanto la actividad catalítica como la unión de dUTP, lo que sugiere que la unión / actividad depende de un lado aromático. -cadena en la base de la horquilla. La comparación de una estructura de modelo tridimensional basada en homología de HERV-K dUTPasa con una estructura cristalográfica de la dUTPasa humana reveló el desplazamiento de una hélice α conservada en la enzima HERV-K que causa la expansión del sitio activo de HERV-K. Esta expansión puede ser responsable de la capacidad de la enzima HERV-K para hidrolizar dTTP y unirse a los dNTP más voluminosos en contraste con la mayoría de las dUTPasas que son altamente específicas para dUTP. El conocimiento del mecanismo catalítico de la dUTPasa y la topografía distintiva del sitio activo de HERV-K proporciona una base molecular para el diseño de inhibidores específicos de la dUTPasa de HERV-K.


¿Incorporación incorrecta de dUTP en el ADN? - biología

Se analizó una línea de células linfoides humanas para determinar la presencia de dUMP en el ADN con o sin tratamiento con el inhibidor de la dihidrofolato reductasa, metotrexato. Las células tratadas con metotrexato y marcadas con [3 H] dUrd contenían dUMP en el ADN en cantidades fácilmente detectables (≈0,8 pmol de dUMP por μmol de nucleótido de ADN total), y esto aumentó ≈3 veces si las células también se trataron con Ura. al mismo tiempo. No se pudo detectar dUMP (& lt1 fmol / μmol de ADN) mediante estos métodos en el ADN de células no tratadas con metotrexato, independientemente de si Ura estaba presente o ausente. La presencia de dUMP en el ADN de las células tratadas con metotrexato es el resultado del gran aumento de la concentración intracelular de dUTP y la caída de dTTP que acompañan a la inhibición de la timidilato sintetasa (5,10-metilentetrahidrofolato: dUMP C-metiltransferasa EC 2.1.1.45) por la droga. Estos cambios son aparentemente suficientes para superar los mecanismos normales que excluyen dUMP del ADN, y la mejora por Ura refleja la supresión de uno de los mecanismos, la eliminación de Ura del ADN por la enzima Ura-ADN glicosilasa. Los resultados sugieren una lesión activa del ADN en las células en las que se inhibe la timidilato sintetasa. En estas condiciones, parece haber una incorporación y eliminación cíclicas de dUMP como resultado de la reinserción de dUMP durante la reparación del hueco en los sitios de eliminación de Ura. Esta consecuencia del proceso normal de escisión-reparación, que ocurre cuando los niveles intracelulares de dUTP se acercan a los de dTTP, puede tener efectos relacionados con la citotoxicidad de los fármacos inhibidores de la timidilato sintetasa, deficiencias clínicas de folato y vitamina B-12, y muerte sin timina. en general.


Incorrecta incorporación de monofosfato de desoxiuridina en el ADN inducida por antifolato: inhibición de la síntesis de ADN de alto peso molecular en células linfoblastoides humanas

La exposición in vitro de una línea celular linfoblastoide humana (WIL-2) al antifolato metoprina (DDMP), cuando fue seguida por la adición de desoxiuridina exógena, condujo a la acumulación intracelular de trifosfato de desoxiuridina (dUTP) y la incorporación de monofosfato de desoxiuridina (dUMP) en ADN. Cuando se extrajo el ADN recién sintetizado de células tratadas con DDMP que se habían marcado con desoxiuridina durante un máximo de 3 minutos, la mayor parte del ADN sintetizado no superaba los 4 S en gradientes de sacarosa alcalina. Por el contrario, la forma predominante de ADN estable en álcalis recién sintetizado en las células no tratadas con el fármaco era mayor de 4 S. La progresión anormal de la síntesis de ADN, la degradación del ADN recién sintetizado o ambos ocurrieron como una consecuencia tardía del tratamiento con DDMP en ausencia de desoxiuridina exógena cuando se usó timidina para marcar el ADN del tratado con DDMP. células.


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Incorrecta incorporación de uracilo en el ADN inducida por metotrexato

Se analizó una línea de células linfoides humanas para determinar la presencia de dUMP en el ADN con o sin tratamiento con el inhibidor de la dihidrofolato reductasa, metotrexato. Las células tratadas con metotrexato y marcadas con [(3) H] dUrd contenían dUMP en el ADN en cantidades fácilmente detectables (aproximadamente 0,8 pmol de dUMP por mumol de nucleótidos de ADN total), y esto se incrementó aproximadamente 3 veces si las células también fueron tratadas con Ura al mismo tiempo. No se pudo detectar dUMP (& lt1 fmol / mumol de ADN) mediante estos métodos en el ADN de células no tratadas con metotrexato, independientemente de si Ura estaba presente o ausente. La presencia de dUMP en el ADN de las células tratadas con metotrexato es el resultado del gran aumento de la concentración intracelular de dUTP y la caída de dTTP que acompañan a la inhibición de la timidilato sintetasa (5,10-metilentetrahidrofolato: dUMP C-metiltransferasa EC 2.1.1.45) por la droga. Estos cambios son aparentemente suficientes para superar los mecanismos normales que excluyen dUMP del ADN, y la mejora por Ura refleja la supresión de uno de los mecanismos, la eliminación de Ura del ADN por la enzima Ura-ADN glicosilasa. Los resultados sugieren una lesión activa del ADN en las células en las que se inhibe la timidilato sintetasa. En estas condiciones, parece haber una incorporación y eliminación cíclicas de dUMP como resultado de la reinserción de dUMP durante la reparación del hueco en los sitios de eliminación de Ura. Esta consecuencia del proceso normal de escisión-reparación, que ocurre cuando los niveles intracelulares de dUTP se acercan a los de dTTP, puede tener efectos relacionados con la citotoxicidad de los fármacos inhibidores de la timidilato sintetasa, deficiencias clínicas de folato y vitamina B-12, y muerte sin timina. en general.


Incorrecta incorporación de uracilo en el ADN inducida por metotrexato

Se analizó una línea de células linfoides humanas para determinar la presencia de dUMP en el ADN con o sin tratamiento con el inhibidor de la dihidrofolato reductasa, metotrexato. Las células tratadas con metotrexato y marcadas con [3 H] dUrd contenían dUMP en el ADN en cantidades fácilmente detectables (≈0,8 pmol de dUMP por μmol de nucleótido de ADN total), y esto aumentó ≈3 veces si las células también se trataron con Ura. al mismo tiempo. No se pudo detectar dUMP (& lt1 fmol / μmol de ADN) mediante estos métodos en el ADN de células no tratadas con metotrexato, independientemente de si Ura estaba presente o ausente. La presencia de dUMP en el ADN de las células tratadas con metotrexato es el resultado del gran aumento de la concentración intracelular de dUTP y la caída de dTTP que acompañan a la inhibición de la timidilato sintetasa (5,10-metilentetrahidrofolato: dUMP C-metiltransferasa EC 2.1.1.45) por el fármaco. Estos cambios son aparentemente suficientes para superar los mecanismos normales que excluyen dUMP del ADN, y la mejora por Ura refleja la supresión de uno de los mecanismos, la eliminación de Ura del ADN por la enzima Ura-ADN glicosilasa. Los resultados sugieren una lesión activa del ADN en las células en las que se inhibe la timidilato sintetasa. En estas condiciones, parece haber una incorporación y eliminación cíclicas de dUMP como resultado de la reinserción de dUMP durante la reparación del hueco en los sitios de eliminación de Ura. Esta consecuencia del proceso normal de escisión-reparación, que ocurre cuando los niveles intracelulares de dUTP se acercan a los de dTTP, puede tener efectos relacionados con la citotoxicidad de los fármacos inhibidores de la timidilato sintetasa, deficiencias clínicas de folato y vitamina B-12, y muerte sin timina. en general.


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ABSTRACTO

Fondo: El mecanismo de acción del 5-fluorouracilo (5-FU) se ha asociado con la inhibición de la timidilato sintasa (TS) y la incorporación de 5-FU en el ARN y el ADN, pero se dispone de datos limitados en tejido tumoral humano para este último. Por lo tanto, medimos la incorporación en muestras de biopsia de tumores humanos después de la administración de una dosis de prueba de 5-FU solo o con leucovorina.

Pacientes y métodos: Los pacientes recibieron 5-FU (500 mg / m 2) con o sin leucovorina en dosis alta, leucovorina en dosis baja o l-leucovorina, y se tomaron muestras de biopsia después de aproximadamente 2, 24 o 48 h. Los tejidos se pulverizaron y extrajeron para obtener ácidos nucleicos. La incorporación de 5-FU se midió usando cromatografía de gases / espectrometría de masas después de la degradación completa a bases de ARN y ADN aislados.

Resultados: La incorporación máxima en ARN (1.0 pmol / μg ARN) y ADN (127 fmol / μg ADN) de 59 y 46 muestras de biopsia, respectivamente, se encontró 24 h después de la administración de 5-FU. La incorporación en el ARN pero no en el ADN se correlacionó significativamente con los niveles de 5-FU intratumoral. Sin embargo, la incorporación de ADN se correlacionó significativamente con la incorporación de ARN. El tejido tumoral primario, la metástasis hepática y la mucosa normal no mostraron diferencias significativas, mientras que la leucovorina no tuvo efecto. Ni para la incorporación de ARN (30 pacientes) ni de ADN (24 pacientes) se encontró una correlación significativa con la respuesta a la terapia con 5-FU. Sin embargo, en el mismo grupo de pacientes, la respuesta se correlacionó significativamente con la inhibición del TS (TS medio en los grupos que respondieron y no respondieron 45 y 231 pmol / h / mg de proteína, respectivamente PAG=0.001).

Conclusiones: El 5-FU se incorpora a niveles detectables en el ARN y el ADN de tejido tumoral humano, pero no se encontró relación entre la eficacia del tratamiento con 5-FU y la incorporación, en contraste con el TS.


Aumento de la incorporación incorrecta de uracilo en linfocitos de ratas con deficiencia de folato

El desarrollo de ciertos cánceres humanos se ha relacionado con una ingesta inadecuada de folatos. Se determinaron los efectos de la deficiencia de folato in vivo sobre la estabilidad del ADN (rotura de la hebra, uracilo incorporado incorrectamente y daño de la base oxidativa) en linfocitos aislados de ratas alimentadas con una dieta deficiente en ácido fólico. Debido a que las vías metabólicas del folato y otros donantes de metilo están estrechamente acopladas, se determinaron los efectos de la deficiencia de metionina y colina solas o en combinación con la deficiencia de folato. La alimentación de ratas macho Hooded Lister con una dieta libre de folato durante 10 semanas creó una deficiencia moderada de folato (25 & # x0201350 & # x00025 (aprox.) Disminución en las concentraciones de folato en plasma, glóbulos rojos y hepáticos (P & # x02008 & # x0003c 0.05) y un 20 & # x0201350 & # x00025 (aprox.) # x00025 aumento de homocisteína plasmática (P & # x02008 & # x0003c 0,05)). La rotura de la cadena de ADN de linfocitos se incrementó sucesivamente en todos los grupos después de 4 semanas y 8 semanas con la dieta (50 & # x02013100 & # x00025 (aprox.) Después de 8 semanas). Solo el bajo nivel de folato indujo específica y progresivamente la incorporación errónea de uracilo durante todo el estudio (100 & # x00025 (aprox.) Después de 8 semanas). Ni la deficiencia de folato ni la deficiencia de colina / metionina alteraron el daño oxidativo de la base del ADN. En resumen, la deficiencia moderada de folato in vivo se asocia con una disminución en la estabilidad del ADN, medida como una mayor rotura de la cadena de ADN y uracilo incorporado incorrectamente. & # x000a9 2000 Campaña de investigación sobre el cáncer http://www.bjcancer.com


Ver el vídeo: MECANISMOS DE REPARACIÓN DEL ADN. Directa de Bases, Por Escisión, SOS, Por Recombinación (Diciembre 2022).