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¿Qué es el análisis amplio del genoma y el análisis específico de locus?

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Estoy leyendo algunos artículos sobre variaciones genéticas y veo que hay dos tipos de análisis, uno es el análisis de variación genética de todo el genoma y el segundo es el análisis de variación genética específica del locus. No entiendo qué significan estos dos, análisis de genoma amplio y locus específico, y cuál es la diferencia entre estos dos análisis o por qué necesitamos ambos tipos de análisis.


¡Bienvenido a Biology.SE!

Un locus (plur. Loci) es una región de tamaño arbitrario en un cromosoma. Un locus puede ser de un solo nucleótido o puede ser mucho más grande (como sitios de $ 10 ^ 7 $).

Por lo tanto, un análisis de todo el genoma es un análisis que utiliza todo el genoma a la vez, mientras que un análisis específico de locus es el mismo análisis realizado a nivel de loci individuales.

Para hacer una analogía, si un análisis de todo el genoma es como un análisis de todo el país, entonces un análisis específico de locus es como un análisis específico de una ciudad.

¡Sin más contexto, no será posible decir más que eso!


Análisis de vías biológicas

Ramakanth Chirravuri Venkata, Dario Ghersi, en Enciclopedia de bioinformática y biología computacional, 2019

Análisis de vías en estudios de asociación de todo el genoma

Los estudios de asociación amplia del genoma (GWAS) utilizan modelos estadísticos para investigar la asociación entre variantes (polimorfismos de nucleótido único) y fenotipos. A pesar del debate sobre la importancia estadística frente a la relevancia biológica en la comunidad científica, los GWAS han sido una fuente importante para generar hipótesis novedosas en el campo de la genética. Los GWAS tienden a ser adecuados para detectar variantes comunes asociadas con fenotipos específicos (Teslovich et al., 2010 Visscher et al., 2012). Sin embargo, en el caso de enfermedades complejas, la asociación de variantes individuales a un fenotipo específico puede ser un desafío debido a sus pequeños tamaños de efecto. Otro problema considerable con GWAS es que utilizan umbrales de valor p estrictos que se corrigen para pruebas de hipótesis múltiples, con el fin de controlar los falsos positivos. Este umbral puede ocasionalmente eliminar genes moderadamente significativos que pueden representar candidatos biológicamente plausibles para asociaciones genotipo-fenotipo (Jia et al., 2011 ).

El análisis de la ruta puede aliviar sustancialmente estos problemas examinando los efectos combinados de variantes simples relacionadas, y también ayudando en la identificación de variantes novedosas relacionadas que están asociadas con los fenotipos. El análisis de la vía examina la asociación con el fenotipo de interés utilizando conjuntos de genes en lugar de genes individuales (Kao et al., 2016 Zhong et al., 2010). El análisis de la vía de los estudios de GWAS generalmente consta de tres pasos: (1) determinación de conjuntos de genes adecuados para el análisis de la vía (p. Ej., Gene Ontology (Ashburner et al., 2000) o KEGG (Ogata et al., 1999)) (2) mapear variantes de sus genes respectivos y (3) usar modelos estadísticos para examinar asociaciones.


Base molecular de la insuficiencia venosa

GEERT W. SCHMID-SCHÖNBEIN, en The Vein Book, 2007

MECANISMOS GENÉTICOS

El análisis de ligamiento genético ha sacado a la luz que hay pacientes con factores de riesgo familiares. Se ha encontrado un desequilibrio entre el colágeno I y el colágeno III en los segmentos proximales de las venas safenas varicosas humanas además de la fragmentación de las fibrillas de elastina. 144 La proporción de colágeno tipo III está significativamente disminuida en cultivos de células musculares lisas y fibroblastos dérmicos derivados de pacientes con venas varicosas, lo que indica una deficiencia de colágeno tipo III. 145 Se ha propuesto que este tipo de remodelación de la matriz extracelular se debe a la activación de las metaloproteinasas de la matriz (MMP). Se ha propuesto 146,147 la expresión de MMP-1, MMP-2, MMP-9 e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 con un posible desequilibrio entre estas enzimas y sus inhibidores.


En el lugar Control de picos en cada muestra

Se garantizan datos de alta calidad incluso en organismos no tradicionales

Correlación de la relación de metilación

Los niveles de metilación observados de un control de aumento compuesto por 6 amplicones sintéticos bicatenarios únicos que tienen niveles de metilación de ADN específicos que varían de 0 a 100% están altamente correlacionados con el nivel de metilación esperado usando WGBS convencional. El análisis del control de picos utilizando nuestro servicio bioinformático garantiza que se produzcan datos de alta calidad en cada muestra.

Eficiencia de conversión de bisulfito

La eficiencia de conversión de bisulfito de varias especies calculada utilizando tanto el contexto no CpG de gDNA como el control de aumento in situ muestra que el control de aumento es una mejor medida para la eficiencia de conversión de bisulfito cuando se trabaja con organismos no tradicionales que tienen metilación en Contexto CpG


Materiales y métodos

Cepas y genomas

La cepa K-10 (Li et al., 2005, 2019), Telford (Brauning et al., 2019) y S397 (Bannantine et al., 2012) se incluyeron en este estudio como referencias de los principales linajes que han surgido durante la evolución de Mapa. Los aislamientos se propagaron en pendientes de Middlebrook 7H11 modificado suplementado con suero de ternero recién nacido inactivado por calor al 20% (vol / vol), glicerol al 2,5% (vol / vol), asparagina 2 mM, ácido oleico-albúmina al 10% (vol / vol) de Middlebrook. medio de enriquecimiento de dextrosa-catalasa (OADC) (Becton Dickinson, Oxford, Oxfordshire, Reino Unido), Selectatabs (código MS 24 MAST Laboratories Ltd., Merseyside, Reino Unido) y 2 & # x03BCg ml-1 mycobactin J (Allied Monitor, Fayette, MO, Estados Unidos). La secuencia completa del genoma de K-10 (tipo C, NC_002944.2), Telford (subtipo I de tipo S, NZ_CP033688.1) y S397 (subtipo III de tipo S, NZ_CP053749.1) se descargaron de NCBI RefSeq ( O & # x2019Leary et al., 2016 Tabla 1). S397 se anotó utilizando PGAP (Tatusova et al., 2016).

Tabla 1. Detalles de las cepas y genomas utilizados e información sobre el número de copias del IS900.

In vitro ES900-RFLP

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis las cepas fueron tipificadas por BstEII ES900-RFLP como se describió anteriormente (Thibault et al., 2007). Los perfiles se designaron de acuerdo con la nomenclatura descrita anteriormente (Collins et al., 1997 Pavlik et al., 1999 Mobius et al., 2009). Los perfiles se analizaron utilizando el software Bionumerics TM versión 7.6.3 (Applied Maths, Bélgica).

Análisis bioinformático

ES900 Identificación de secuencia y en silico ES900 Flujo de trabajo RFLP

Desarrollamos un en silico canalización de análisis para SI900 Perfiles RFLP utilizando secuencias genómicas completas como entrada (Figura 1). Como primer paso, todos BstLos sitios de restricción EII se ubicaron en el genoma utilizando un script interno (disponible en: https://forgemia.inra.fr/public-pgba/is900-rflp-in-silico) desarrollado con Biopython (v1.76) (Cock et al., 2009). ES900 Las copias en la secuencia del genoma se identificaron mediante una búsqueda de blastn versión 2.9.0 (Altschul et al., 1990) de IS900 secuencia recuperada de la base de datos NCBI (número de acceso X16293) con un porcentaje de identidad del 99% y un mi-valor de 1e-100 para excluir todos los resultados positivos falsos. Para cada acierto, las secuencias ascendentes y descendentes más cercanas al BstLos sitios de restricción EII se recuperaron de la BstMapa de restricción EII y longitud del BstSe calculó el fragmento EII. Se determinó previamente una ecuación de migración de gel usando GelAnalyzer 19.1 1 y se usó para convertir la longitud del fragmento en distancia de migración para una mayor visualización del perfil RFLP. Datos de migración y coordenadas de IS900 las copias se guardaron en archivos .tsv y .rflp, respectivamente, para la visualización del perfil y una mayor investigación de la distribución del locus. La visualización de los perfiles RFLP se realizó utilizando la biblioteca de Python matplotlib (v3.3.0) 2.

Figura 1. Pipeline de análisis bioinformático. Detalles de los pasos realizados por el SI900 RFLP en silico tubería. A partir de secuencias genómicas completas, BstSitio de restricción EII e IS900 Se identificaron las posiciones de la secuencia. Ambos conjuntos de datos se fusionan para extraer el BstTamaños de fragmentos EII de la secuencia del genoma. Posiciones anteriores ES900 y la orientación de la secuencia se almacenan en un archivo .rflp para su posterior análisis. BstLos tamaños de los fragmentos EII se convierten en distancia de migración según el cálculo de un in vitro migración de gel (consulte la sección & # x201CMaterials and Methods & # x201D) y se guarda en el archivo .tsv para una visualización adicional del perfil RFLP.

ES900 Polimorfismo de secuencia

Para confirmar IS900 polimorfismos de secuencia previamente descritos (Semret et al., 2006 Castellanos et al., 2009), IS900 Se extrajeron y alinearon copias de los tres genomas usando Multalin (Corpet, 1988) con la tabla de comparación de símbolos & # x201CDNA & # x201D. IS más corto900 las copias en la alineación se comprobaron manualmente con el software Artemis versión 18.1.0 (Carver et al., 2008) para confirmar los resultados de la explosión.

Alineación malva

Las alineaciones de Synteny se determinaron con Mauve (snapshot_2015-02-13 build 0) (Darling et al., 2004). Para evitar falsas indicaciones de inversiones u otros reordenamientos, estos genomas se cambiaron primero para comenzar en el adn gen antes del análisis de Malva. Utilizando las secuencias del genoma completo de cada cepa, realizamos una alineación del genoma 1 frente a 1 utilizando Mauve progresivo (Darling et al., 2010) y también una alineación de las tres secuencias del genoma para visualizar las diferencias en la organización genómica.

Análisis de Ortología

Para identificar IS900 copias insertadas en sitios genómicos ortólogos entre los genomas de K-10, Telford y S397, realizamos búsquedas blastn utilizando como consultas, 2.000 pb de regiones genómicas ascendentes y descendentes que flanquean cada IS900 Copiar. Estas regiones flanqueantes ortólogas de un genoma se alinearon con los otros dos genomas y se compararon para identificar loci ortólogos. Por lo tanto, se analizaron los resultados de blastn para seleccionar la mejor coincidencia. La mejor coincidencia se definió con los siguientes criterios: (1) una mi-valor de 0 y (2) una cobertura mínima del 80%. Para muchas regiones flanqueantes, blastn arrojó solo un resultado. Pero para algunos otros, se devolvió más de un resultado. En los casos en que la cobertura del mejor resultado está por debajo del 80%, buscamos otros resultados alrededor de 4.000 pb del primer resultado para identificar reordenamientos / diferencias del genoma y los fusionamos. Finalmente, los loci ortólogos se consideraron vinculados a un IS900 loci si el centro del golpe BLAST cayera dentro de la región de 2000 pb que flanquea el IS900 elemento en el genoma objetivo.

ES900 Análisis de enriquecimiento de ontología genética de sitios

Este enfoque tenía como objetivo determinar si los genes cercanos a los sitios de inserción estaban enriquecidos para alguna función en particular. Secuencias de proteínas aguas arriba y aguas abajo de IS900 se extrajeron, si están disponibles, de la anotación RefSeq. La anotación funcional se realizó utilizando eggNOG-mapper-2.0.1 (Huerta-Cepas et al., 2017) con base en datos de ortología de eggNOG (Huerta-Cepas et al., 2019). Las búsquedas de secuencia se realizaron utilizando DIAMOND versión 2.0.5 (Buchfink et al., 2015).

Identificación de los sitios de inserción candidatos

Para identificar motivos de sitios de inserción dirigidos en los genomas de Mapa, 10 pb de secuencia ascendente y descendente de cada IS900 fueron extraídos. Se consideró cada hebra del elemento IS y las secuencias extraídas se complementaron de forma inversa si era necesario. Las secuencias de inserción que contienen deleciones o duplicaciones se excluyeron del análisis. Se usó multalina (Corpet, 1988) para alinear secuencias aguas arriba y aguas abajo usando la tabla de comparación de símbolos & # x201CDNA & # x201D. La alineación de la secuencia aguas arriba se realizó con & # x201C penalización de espacio en la apertura & # x201D establecida en 1 y & # x201C penalización de espacio en la extensión & # x201D establecida en 0. La alineación de la secuencia aguas abajo se realizó con parámetros predeterminados. IS ascendente y descendente900 las regiones flanqueantes de cada genoma se alinearon con el M. avium subsp. hominissuis (Mah) 104 genoma usando blastn para encontrar regiones ortólogas. Solo se han conservado las regiones adyacentes. Las supuestas secuencias diana, previamente identificadas en los tres genomas, se extrajeron manualmente de la Mah 104 genoma usando el software Artemis versión 18.1.0 (Carver et al., 2008) basado en resultados de blastn. Se utilizó MEME versión 5.3.1 (Bailey y Elkan, 1994) para identificar un motivo de sitio objetivo putativo.


Introducción

Las hemorroides son almohadillas vasculares anales normales llenas de sangre en la unión del recto y el ano. Se supone que su función principal en los seres humanos es mantener la continencia1, pero se han sugerido otras funciones como la sensación de plenitud, la presión y la percepción del contenido anal dada la inervación sensorial.2 La enfermedad hemorroidal (en lo sucesivo denominada HEM) se produce cuando las hemorroides aumentan de tamaño y sintomático (a veces asociado con sangrado rectal y picor / suciedad) debido al deterioro o prolapso del tejido conjuntivo de anclaje, la dilatación del plexo hemorroidal o la formación de coágulos sanguíneos. Las formas graves de HEM a menudo requieren tratamiento quirúrgico y la eliminación de hemorroides anormalmente agrandadas y / o trombosadas.1 La prevalencia de HEM aumenta con la edad y muestra cifras asombrosas en todo el mundo (hasta un 86% de prevalencia en algunos informes), 3 por lo que permanece una gran proporción de casos no detectado como asintomático o lo suficientemente leve como para autotratarse con un tratamiento de venta libre. La HEM representa una carga médica y socioeconómica considerable con un costo anual estimado de US $ 800 millones solo en EE. UU., Principalmente relacionado con el gran número de hemorroidectomías realizadas cada año4.

Se han sugerido varios factores de riesgo de HEM, incluida la posición erguida humana. El sellado anal estrecho proporcionado por el elaborado plexo hemorroidal puede haberse desarrollado durante la evolución humana coexistiendo con el bipedalismo permanente, como muestra nuestra comparación histológica de cuatro mamíferos diferentes (humano, gorila, babuino, ratón, figura suplementaria en línea 1, material suplementario en línea 1). ). Otros factores de riesgo sugeridos son un estilo de vida sedentario, obesidad, ingesta reducida de fibra dietética, exceso de tiempo en el inodoro, esfuerzo durante la defecación, levantamiento vigoroso, estreñimiento, diarrea, disfunción del suelo pélvico, embarazo y parto natural, y varios de ellos han sido controvertidos. El modelo hipotético que se muestra en la figura complementaria en línea 2 resume los conceptos contemporáneos sobre la fisiopatología del desarrollo de HEM.5 Hasta el día de hoy, la etiopatogenia de HEM está poco investigada, y no se conocen ni los mecanismos moleculares exactos ni las razones por las que solo algunas personas desarrollan HEM. . La susceptibilidad genética puede desempeñar un papel en el desarrollo de HEM, pero nunca se ha realizado ningún estudio de asociación de genoma completo (GWAS) a gran escala para HEM. Para evaluar la contribución de la variación genética a la arquitectura genética de HEM, llevamos a cabo un metaanálisis GWAS en 218 920 individuos afectados y 725 213 controles de población de ascendencia europea.

Material suplementario


10.5: Análisis de locus de rasgos cuantitativos (QTL)

  • Contribuido por Todd Nickle e Isabelle Barrette-Ng
  • Profesores (Biología) en Mount Royal University y Amp University of Calgary

La mayoría de los rasgos fenotípicos comúnmente utilizados en la introducción de la genética son cualitativos, lo que significa que el fenotipo existe en solo dos (o posiblemente algunas más) formas alternativas discretas, como flores púrpuras o blancas, u ojos rojos o blancos. Por lo tanto, se dice que estos rasgos cualitativos exhiben variación discreta. Por otro lado, muchos rasgos interesantes e importantes exhiben variación continua estos exhiben una gama continua de fenotipos que generalmente se miden cuantitativamente, como la inteligencia, la masa corporal, la presión arterial en los animales (incluidos los humanos) y el rendimiento, el uso de agua o el contenido de vitaminas en los cultivos. Los rasgos con variación continua son a menudo complejos y no muestran las proporciones simples de segregación mendeliana (por ejemplo, 3: 1) observadas con algunos rasgos cualitativos. Muchos rasgos complejos también están fuertemente influenciados por el medio ambiente. Sin embargo, a menudo se puede demostrar que los rasgos complejos tienen un componente que es heredable y que, por lo tanto, debe involucrar a uno o más genes.

¿Cómo pueden los genes, que se heredan (en el caso de un diploide) como máximo dos variantes cada uno, explicar el amplio rango de variación continua observada para muchos rasgos? La falta de una explicación inmediatamente obvia a esta pregunta fue una de las primeras objeciones a la explicación de Mendel de los mecanismos de la herencia. Sin embargo, al considerarlo más a fondo, queda claro que cuantos más loci contribuyen al rasgo, más clases fenotípicas pueden observarse para ese rasgo (Figura ( PageIndex <1> )).

Si el número de clases fenotípicas es suficientemente grande (como con tres o más loci), las clases individuales pueden volverse indistinguibles entre sí (particularmente cuando se incluyen los efectos ambientales), y el fenotipo aparece como una variación continua (Figura ( PageIndex < 2> )). Por lo tanto, los rasgos cuantitativos a veces se denominan rasgos poligénicos, porque se supone que sus fenotipos están controlados por la actividad combinada de muchos genes. Tenga en cuenta que esto no implica que cada uno de los genes individuales tenga la misma influencia en un rasgo poligénico, y algunos pueden tener un efecto importante, mientras que otros solo son menores. Además, cualquier gen puede influir en más de un rasgo, ya sean rasgos cuantitativos o cualitativos.

Figura ( PageIndex <2> ): Cuantos más loci afecten un rasgo, mayor será el número de clases fenotípicas que se pueden esperar. Para algunos rasgos, el número de loci contribuyentes es tan grande que las clases fenotípicas se mezclan en una variación aparentemente continua. (Original-Deyholos-CC: AN)

Podemos usar marcadores moleculares para identificar al menos algunos de los genes (aquellos con mayor influencia) que afectan un rasgo cuantitativo dado. Esto es esencialmente una extensión de las técnicas de mapeo que ya hemos considerado para rasgos discretos. Un experimento de mapeo de QTL idealmente comenzará con dos líneas de reproducción pura que difieren mucho entre sí con respecto a uno o más rasgos cuantitativos (Figura ( PageIndex <3> )). Los padres y toda su progenie deben criarse en las mismas condiciones ambientales que sea posible, para garantizar que la variación observada se deba a factores ambientales genéticos y no externos. Estas líneas parentales también deben ser polimórficas para un gran número de loci moleculares, lo que significa que deben tener alelos diferentes entre sí en cientos de loci. Las líneas parentales se cruzan, y luego esta F1 individuo, en el que se ha producido la recombinación entre los cromosomas parentales, se autofecunda (o retrocruza). Debido a la recombinación (tanto cruzado como surtido independiente), cada uno de los F2 los individuos contendrán una combinación diferente de marcadores moleculares y también una combinación diferente de alelos para los genes que controlan el rasgo cuantitativo de interés (Tabla ( PageIndex <1> )).

Figura ( PageIndex <3> ): Estrategia para un experimento típico de mapeo QTL. Se cruzan dos progenitores que difieren en un rasgo cuantitativo (por ejemplo, masa de frutos), y el F1 se autofecunda (como se muestra con el símbolo de una cruz en un círculo). La F2 la progenie mostrará un rango de valores cuantitativos para el rasgo. Entonces, la tarea consiste en identificar los alelos de los marcadores de uno de los padres que están fuertemente correlacionados con el rasgo cuantitativo. Por ejemplo, los marcadores del padre de la fruta grande que siempre están presentes en la F de la fruta grande2 los individuos (pero nunca en los individuos de frutos pequeños) probablemente estén vinculados a loci que controlan la masa de frutos.

Tabla ( PageIndex <1> ) Genotipos y datos cuantitativos para algunos individuos de los cruces que se muestran en la Figura ( PageIndex <8> )

Figura ( PageIndex <4> ): Gráficas de la masa de la fruta y el genotipo para los loci seleccionados de la Tabla ( PageIndex <1> ). Para la mayoría de los loci (por ejemplo, H), el genotipo no muestra una correlación significativa con el peso de la fruta. Sin embargo, para algunos marcadores moleculares, el genotipo estará altamente correlacionado con el peso de la fruta. Tanto D como K influyen en el peso del fruto, pero el efecto del genotipo en el locus D es mayor que en el locus K. (Original-Deyholos-CC: AN)

El rápido aumento de CRISPR revoluciona el cribado de todo el genoma

Una tecnología verdaderamente disruptiva, el cribado CRISPR desplaza aproximadamente a sus predecesores y luego se refina a sí mismo, como lo demuestran sus aplicaciones genómicas funcionales y su capacidad para complementar la transcriptómica unicelular.

Usando una pantalla CRISPR de pérdida de función a escala genómica, científicos de la Universidad de Nueva York, el Centro del Genoma de Nueva York y la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai identificaron genes humanos y redes reguladoras de genes que son requeridos por el SARS-CoV- 2. Los científicos también demostraron que la supresión de estos genes y redes confiere resistencia a la infección viral. Por ejemplo, la pérdida de RAB7A secuestra eficazmente el receptor ACE2 dentro de las células, evitando que sirva como punto de entrada para el virus. [Vince Dittmer / NYGC]

CRISPR ha estado acaparando los titulares debido a su potencial como forma de terapia génica. Pero CRISPR también merece atención debido a sus contribuciones al cribado de todo el genoma. Aunque estas contribuciones generalmente escapan a la atención pública, son nada menos que revolucionarias.

Poco después de que la edición de genes CRISPR se introdujera en el mundo en 2012, los investigadores dirigidos por Feng Zhang, PhD, miembro del instituto principal del Broad Institute of MIT y Harvard, se dispusieron a trabajar en la construcción de una pantalla de pérdida de función a escala genómica que se basaba en la nucleasa CRISPR-Cas9 en lugar de ARN interferente pequeño (ARNip). 1 Luego, el cribado CRISPR rápidamente comenzó a adquirir varios refinamientos. (Para obtener más detalles, consulte la barra lateral a continuación, "Establecimiento de los conceptos básicos del cribado CRISPR").

A estas alturas, el cribado CRISPR se ha convertido en una técnica familiar. Pero continúa volviéndose más poderoso y sofisticado. En este artículo, veremos cómo el cribado CRISPR está permitiendo avances en el desarrollo de fármacos, la genómica humana funcional y la ciencia básica. Además, analizaremos los desarrollos de cielo azul que permitirán que el cribado CRISPR haga aún más.

Caracterización de elementos codificantes y no codificantes

Neville Sanjana, PhD, quien trabajó con el laboratorio de Zhang en las primeras pantallas CRISPR, dice que su grupo en el Centro de Genoma de Nueva York (NYGC) y la Universidad de Nueva York (NYU) ahora está desarrollando tecnologías de edición de genes para aplicaciones de genómica funcional, con el ambicioso objetivo de comprender la función de todos los elementos del genoma humano, tanto codificantes como no codificantes.

El laboratorio Sanjana ha estado desarrollando pantallas que hacen más que solo genes diana. “[Hemos estado] buscando regiones no codificantes como sitios de unión de factores de transcripción [o] ARN no codificantes, o [en] regiones profundas en el espacio intergénico que están asociadas con enfermedades comunes o raras”, dice Sanjana. “[Parte de este trabajo] ha llevado a una traducción clínica asombrosa”.

El ejemplo principal de esa traducción clínica fue un cribado CRISPR no codificante que identificó una región del genoma involucrada en la represión de la hemoglobina fetal. La pantalla mostró que cuando se perturba esa región no codificante, la hemoglobina fetal se puede desreprimir. Este hallazgo condujo a una nueva diana terapéutica para la anemia de células falciformes (ECF) y la β-talasemia, dos enfermedades que afectan a la hemoglobina adulta. 2

“El ARN guía exacto de nuestra pantalla CRISPR es lo que realmente se usa para la primera terapia CRISPR en humanos”, señala Sanjana. Esa terapia innovadora utiliza la edición del gen CRISPR-Cas9 para reprimir la BCL11A gen específicamente en las células madre sanguíneas, lo que hace que reactiven el gen de la hemoglobina fetal. Las células modificadas genéticamente se utilizaron con éxito para tratar a dos pacientes: uno con SCD (Victoria Gray) y otro con β-talasemia. (El trabajo fue dirigido por investigadores de CRISPR Therapeutics y Vertex Pharmaceuticals).

Un desafío importante en las terapias de edición de genes es lograr que las ediciones se realicen en los tipos de células correctos. En este caso, la especificidad del tipo de célula es producto de la edición del genoma no codificante, porque esta región no codificante en particular es funcional solo en las células sanguíneas, según Sanjana. 3

Identificación de factores del huésped para la infección por SARS-CoV-2

Más recientemente, Sanjana y sus colegas han abordado el COVID-19 mediante el despliegue de una pantalla CRISPR para eliminar todos los genes del genoma humano en las células pulmonares para encontrar los genes y las vías necesarias para la infección por SARS-CoV-2. Sanjana explica que el objetivo era encontrar múltiples puntos de ataque para bloquear el virus SARS-CoV-2.

El enfoque se inspiró en el desarrollo exitoso de cócteles antirretrovirales para el VIH que previenen las mutaciones de escape viral. Por lo demás, esas mutaciones se producen cuando el virus se enfrenta a un solo fármaco antivírico. Para algunos de los principales genes candidatos involucrados en la entrada viral, la búsqueda de medicamentos existentes que inhiben los productos proteicos de estos genes resultó vacía.

"Pensamos, veamos si podría haber algún otro mecanismo común o vía convergente que podamos apuntar", recuerda Sanjana. Para realizar este trabajo, Sanjana y sus colegas eligieron otra nueva herramienta de cribado CRISPR. La herramienta se llama "indexación mejorada compatible con CRISPR de transcriptomas y epítopos con secuenciación" o ECCITE-seq. Lleva el cribado CRISPR al nivel de una sola célula mientras detecta proteínas y transcripciones en paralelo.

Ese análisis apuntó a la vía de biosíntesis del colesterol y al aumento del colesterol intracelular como un posible bloqueo de la infección viral. Este descubrimiento clave abrió una gran cantidad de medicamentos para enfermedades cardíacas para su posible reutilización. Con la ayuda de otros miembros del equipo, Sanjana se centró en el bloqueador de los canales de calcio amlopidina, un medicamento aprobado por la FDA, y descubrió que tenía un poderoso efecto inhibidor sobre el virus.

Comercialización de cribado CRISPR

Las empresas que se especializan en el cribado CRISPR para el descubrimiento y el desarrollo de fármacos están aprovechando las capacidades de análisis de células individuales. Por ejemplo, el análisis CRISPR de célula única es un servicio clave de Cellecta, que ofrece bibliotecas lentivirales agrupadas con casetes de expresión de ARN guía (gRNA) con código de barras para permitir los análisis conocidos como Perturb-seq y CROP-seq (secuenciación de gotas CRISPR).

Cellecta ha desarrollado una tecnología que combina el cribado genético combinado y el análisis de expresión unicelular. Con esta tecnología, las células individuales se etiquetan con códigos de barras únicos para poder identificar subpoblaciones de células con fenotipos distintos. Debido a que los códigos de barras están diseñados para expresar transcripciones de ARN en las células, es posible evaluar cómo responden las células variantes a las condiciones experimentales. La detección de ARN de código de barras expresado puede llevarse a cabo con varios métodos de perfil de expresión.

En estos análisis, se aplican perturbaciones genéticas (knockouts o knockdowns de genes) y los fenotipos resultantes se estudian a nivel del transcriptoma para inferir la función genética. El código de barras de los gRNA permite que las perturbaciones agrupadas se deconvuelvan y se asocien con fenotipos específicos.

“Un uso típico es un experimento en una población celular heterogénea”, dice Donato Tedesco, PhD, director de investigación y desarrollo de Cellecta. "Si desea identificar un subconjunto de células dentro de la población general que tienen diferentes respuestas a un knockout, la única forma de hacerlo es el análisis de una sola célula".

Él relata que los clientes de Cellecta a menudo usan pantallas CRISPR en busca de knockouts que antagonicen o sinergizan con un fármaco experimental, en experimentos que tienen como objetivo dilucidar el mecanismo de acción del fármaco.

Otra empresa que ofrece servicios de detección de CRISPR es Synthego, que trabaja con empresas farmacéuticas y de biotecnología. Para Robert Deans, PhD, director científico de Synthego, seguir la tendencia del análisis unicelular en el cribado CRISPR se reduce a la automatización y la robótica, y mucho de eso.

Synthego ha estado aplicando el aprendizaje automático y la automatización para manejar la salida masiva de datos de este tipo de experimentos. Ese poderoso análisis retroalimenta la proyección. La empresa puede aumentar la eficiencia modificando aspectos del diseño de guías y optimizando el complejo de proteínas ribonucleares.

“El nombre del juego, tanto en la identificación de objetivos como en la edición de GMP, es precisión”, dice Deans. "Estás reduciendo la complejidad de la pantalla. Con mayor precisión y exactitud, su interrogatorio posterior se simplifica ".

Él informa que el año pasado, la compañía utilizó un potente procesamiento de datos y una plataforma de síntesis de fase sólida eficiente para ayudar a una colaboración de investigación liderada por la Universidad de California en San Francisco, a acelerar el estudio de posibles objetivos de tratamiento para los coronavirus. Synthego sintetizó más de 1000 gRNA en solo dos días y utilizó estos gRNA para diseñar células que incorporaron más de 300 knockouts para detectar interacciones de proteínas huésped-coronavirus. Solo se necesitaba una persona para escribir en la automatización y el flujo de trabajo.

La colaboración asistida por Synthego se amplió en un estudio anterior, en el que se mapearon 332 interacciones proteína-proteína humana del SARS-CoV-2 de alta confianza para identificar oportunidades de reutilización de fármacos. 4 En el estudio anterior, se mencionaron varios medicamentos, incluida la plitidepsina, un medicamento contra el cáncer que comercializa PharmaMar.

Para ampliar el estudio anterior, la colaboración en la que participó Synthego buscó determinar qué interacciones proteína-proteína humana del coronavirus (no solo las que involucran al SARS-CoV-2, sino otros coronavirus) podrían ser buenos objetivos para los medicamentos destinados a bloquear la replicación viral. 5 El esfuerzo implicó una combinación de ensayos de infectividad de virus in vitro y modelos in silico.

En un comunicado de prensa sobre el estudio pan-coronaviral, Synthego incluyó una cita atribuida a Nevan J. Krogan, PhD, investigador de UCSF y uno de los líderes del estudio: “La precisión y reproducibilidad de CRISPR fueron clave para ayudarnos a estudiar cómo el SARS- CoV-2 afecta las vías celulares y, en última instancia, causa enfermedades, lo que mejora nuestra validación de dianas terapéuticas prometedoras que pueden ofrecer una amplia protección contra la infección por coronavirus ".

Tanto los estudios del interactoma del SARS-CoV-2 como del pan-coronaviral informaron un estudio posterior que se centró en la plitidepsina. Este estudio, que incluyó a Krogan entre sus autores correspondientes, indicó que el fármaco es eficaz contra el SARS-CoV-2 porque se dirige a la proteína del huésped eEF1A. 6 La plitidepsina es ahora objeto de un estudio de fase III que está programado para inscribir a pacientes que requieran hospitalización para el tratamiento de una infección moderada por COVID-19.

Mejora del análisis de pantallas de perturbación multimodal

Investigadores de NYU y NYGC han desarrollado un nuevo enfoque computacional para analizar datos de cribado CRISPR. El enfoque, que se denomina mixscape, puede mejorar la relación señal / ruido en estudios que combinan el uso de una pantalla CRISPR combinada para perturbar genes y el uso de tecnologías de secuenciación multimodal unicelulares para acumular ARNm y perfiles de proteínas de superficie. Esencialmente, mixscape identifica y elimina fuentes de variación confusas.

Según un estudio reciente, los investigadores desarrollaron mixscape para ayudarlos a comprender cómo las células cancerosas alteran la regulación de genes clave, como el gen que codifica la molécula de control inmunológico PD-L1, para evitar la detección y evadir el sistema inmunológico del cuerpo. 7 Antes de mixscape, los investigadores tenían dificultades para interpretar los datos de una pantalla ECCITE-seq multimodal, principalmente porque un subconjunto de células "escapaba" de la perturbación de los gRNA de la pantalla, creando mucho ruido en los datos.

El autor principal del estudio, Efthymia Papalexi, dice que la idea de mixscape se tomó prestada del campo del reconocimiento de imágenes. Mixscape modela cada perturbación como una mezcla de diferentes respuestas celulares. Al hacerlo, puede identificar y eliminar las células que han escapado de la perturbación CRISPR, lo que permite a los investigadores centrarse en las verdaderas señales biológicas.

“With this approach, we can knock out a gene, discover the molecular pathways it controls, and then associate these pathways to cellular behaviors,” Papalexi explains. For example, when applying this method in cancer cell lines, the researchers discovered that two genes frequently mutated in lung cancers—the gene for the kelch-like protein KEAP1, and the gene for the transcriptional activator NRF2—regulate the expression levels of PD-L1. This finding suggests that the genes are important in tumor development and progression.

Looking into the future of CRISPR screening

The horizon beyond these foundational CRISPR-Cas9 screening components and conditions is already being explored. The Broad Institute’s John Doench, PhD, is blazing a trail in the area of alternate Cas enzymes. The standard CRISPR-Cas9 system originates from Streptococcus pyogenes. But CRISPR systems are abundant in nature, and there are plenty of other Cas nucleases that can be exploited, says Doench, who is focusing on a protein called Cas12a from Acidaminococcus.

“It has a particularly useful property: if you want to express multiple gRNAs, you can do so from just one small transcript,” Doench points out. “Because of that, the Cas12a enzyme is particularly useful for studying combinations.”

Combinations are key to exploring synthetic lethality, where a combination of genes contribute to cell death, rather than one alone. In cancer drug discovery, synthetic lethality can link two or more genes that, individually, might not be effective targets, but when combined are lethal to cancer cells. BRCA1 y PARP are the most famous synthetic lethal pair. Doench asserts that with Cas12a, it’s now possible to screen for synthetic lethal pairs to potentially identify new cancer targets.

In addition, blue-sky variations on CRISPR screening are emerging to build upon or even replace current technologies. Those include techniques like CRISPR activation, where an enzymatically inactive Cas9 is tailored to activate gene expression, and base editor screening, where individual mutations or variants are targeted instead of genes. With that kind of fine-grained targeting, researchers could pin down the effect of a single amino acid change on a drug’s activity.

Tanaz Abid, a research associate at the Broad Institute of MIT and Harvard, readies cells for a large-scale lentiviral production run to generate a library of guide RNAs. Her work helps to maintain and enhance the Broad’s Genetic Perturbation Platform, which supports functional investigations of the mammalian genome that can reveal how genetic alterations lead to changes in phenotype.

Base editor screens could finally crack the so-called V-to-F (variants to function) challenge for the human genome, enabling a map of every possible variant of every human gene with a function. A database containing all variants with their functions could unlock the vast potential for personalized medicine.

Realizing all of these possibilities with CRISPR screening will require upgrades in other technologies. “We still need lots of good systems, and lots of good assays to read out,” Doench states. “[CRISPR screening] is one of the tools in the toolbox, but it’s by no means the only one.”

Referencias
1. Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Ciencias 2014 343(6166): 84–87. DOI: 10.1126/science.1247005.
2. Canver MC, Smith EC, Sher F, et al. BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis.Naturaleza 2015 527(7577): 192–197. DOI: 10.1038/nature15521.
3. Frangoul H, Altshuler D, Cappellini MD, et al. CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and β-Thalassemia.N. Engl. J. Med. 2021 384(3): 252–260. DOI: 10.1056/NEJMoa2031054.
4. Gordon DE, Jang GM, Bouhaddou M, et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing.Naturaleza 2020 583: 459–468. DOI: 10.1038/s41586-020-2286-9.
5. Gordon DE, Hiatt J, Bouhaddou M, et al. Comparative host-coronavirus protein interaction networks reveal pan-viral disease mechanisms.Ciencias 2020 370(6521): eabe9403. DOI: 10.1126/science.abe9403.
6. White KM, Rosales R, Yildiz S, et al. Plitidepsin has potent preclinical efficacy against SARS-CoV-2 by targeting the host protein eEF1A.Ciencias 2021 371: 926–931. DOI: 10.1126/science.abf4058.
7. Papalexi E, Mimitou EP, Butler AW, et al. Characterizing the molecular regulation of inhibitory immune checkpoints with multimodal single-cell screens.Nat. Gineta. 2021 53(3): 322–331. DOI: 10.1038/s41588-021-00778-2.

Establishing the Basics of CRISPR Screening

Originally, CRISPR screening gained popularity as a way of avoiding some of the difficulties associated with small interfering RNA screening, such as off-target effects and incomplete protein depletion. In CRISPR screening, highly specific, permanent genetic modifications can be made that are effective at precluding the function of targeted genes.

The CRISPR-Cas9 nuclease characteristically engineers a double-strand break, which occurs at a specific target locus dictated by a single-guide RNA (sgRNA). The deployment of sgRNAs leads to frameshift mutations and, ultimately, loss-of-function mutations at targeted genes.

In many CRISPR screening experiments, lentiviral vectors are used to deliver plasmids encoding Cas9 and sgRNA, with different plasmids encoding different sgRNAs from a library of sgRNAs. Some libraries consist of sgRNAs that correspond to defined sets of targeted genes other libraries are more comprehensive.

Besides a choice of libraries, CRISPR screening presents a choice of formats: pooled or arrayed. In the pooled format, cells are transduced in bulk, and the entire sgRNA library is deployed. In the arrayed format, cells deposited in the wells of a multiwell plate are transduced individually, and individual sgRNAs are deployed.

The pooled format may be preferred when large libraries are deployed. However, care must be taken to ensure a low multiplicity of infection, or a low ratio of lentiviruses to cells, to minimize coinfection by multiple lentiviruses. Then, after transduced cells are selected, whether by viability-based positive or negative selection, next-generation sequencing is used to assess sgRNA representation, that is, whether DNA sequences encoding for different sgRNAs are depleted or enriched.

With a negative selection screen, that is, a traditional knockout screen, the point is to identify genes that are essential for survival or proliferation under certain conditions or selection pressures. If survival genes sustain a lethal mutation because they were targeted by an sgRNA, that sgRNA will not be represented in sequencing results, simply because cells with lethal mutations in sgRNA-targeted survival genes will have been unable to survive and reproduce. Typically, the degree to which an sgRNA has been “depleted” will be detected by comparing the sgRNA’s representation in a cell population spared the selection pressure, and that in a cell population subjected to the selection pressure.

With a positive selection screen, the point is to identify genes whose mutation or silencing gives cells a survival advantage over a selection pressure. For example, an sgRNA-targeted gene may be found to confer resistance to a cancer drug. In this case, the sgRNA will be represented, or “enriched,” among the cancer cells that survive drug treatment.


Agradecimientos

We thank Dr. Peter Gregersen for generously sharing with us GWAS data from the NARAC study, providing us with meta-analysis results and comments on our findings and manuscript. AVA, CFA, and AS were supported in part by the grant 1UL1RR029893 from the National Center for Research Resources, National Institutes of Health. CFA was also supported in part by the grant R56 LM007948-04A1 from the National Library of Medicine, National Institute of Health. LP was supported by The Swedish Research Council and by The Swedish State agency VINNOVA.


Métodos

The resources of peanut AhRLKs

All RLK full-length amino acid sequences in Arabidopsis were downloaded from UniProt (https://www.uniprot.org/) and these sequences were used as queries to perform a BLASTP search against A. duranensis RLKs by NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). These resulting sequences were then used as new queries to conduct a BLASTP search again in PEANUT GENOME RESOURSE (http://peanutgr.fafu.edu.cn/), to avoid missing potential members. The redundant entries were removed manually. Then the resulting unique sequences were analysed with both SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) [65] and NCBI’s Conserved Domains Database (CDD http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) to ensure the presence of the RLK domains in newly identified members. Only proteins containing at least one kinase domain were considered putative AhRLKs, and 1311 AhRLKs were finally obtained. The amino acid residue base, and molecular weight were predicted with ExPaSy ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/). The genome sequence, protein sequences and genome annotation of the peanut were performed according to PEANUT GENOME RESOURSE (http://peanutgr.fafu.edu.cn/).

Multiple sequence alignments and phylogenetic tree construction of AhRLKs

The full-length amino acid sequences of LRR-AhRLKs, LecRLKs and 90 Al-responsive AhRLKs defined in the previous section were aligned using ClustalX in MEGA 7 with default parameters [66]. The phylogenetic tree based on the multiple sequence alignments of peanut LRR-RLKs (Fig. 1), LecRLKs (Fig. 2) and 90 AhRLKs in response to Al stress (Fig. 6) was generated by MEGA 7. A Poisson correction model was used to account for multiple substitutions, while alignment gaps were removed with partial deletion. The statistical strength was estimated by bootstrap resampling using 1000 replicates. Based on the multiple sequence alignment and the previously reported classification of Arabidopsis thaliana, the peanut RLKs were assigned to different subfamilies and subgroups [24, 67].

Chromosomal locations and duplication analysis for peanut RLKs

The physical location of AhRLKs on the chromosomes was obtained from the PEANUT GENOME RESOURSE database (http://peanutgr.fafu.edu.cn/). All members of AhRLKs were mapped onto peanut chromosomes based on their physical positions, and chromosomal location images were produced with the online software Map Gene 2 Chromosome v2 (MG2C:http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/). The chromosome location information of the peanut was extracted from GFF files that contain the information of peanut genome annotation. BLASTP was performed to search for potential homologous gene pairs (E-value < 1e −5 ) across genomes. Information on homologous pairs was used as input to identify syntenic chains by MCScanX [68]. In addition, MCScanX was also used to identify tandem and segmental duplications in the AhRLK gene family. RLKs clustered together within 100 kb were regarded as tandem duplicated genes based on the criteria of other plants. The diagram was generated by TBtools [69]. The nonsynonymous (Ka) and synonymous (Ks) substitution ratios were calculated by Simple Ka/Ks Caculator in TBtools. The divergence time was calculated with the formula T = Ks/2r, and the r of dicotyledonous plants was 1.5*10^-8 synonymous substitutions per site per year [70]. We used the Geneconv program with default parameters to search evidence for tandem duplication cluster gene conversion (http://www.math.wustl.edu/

sawyer/geneconv/) [71]. Since GENECONV required at least three sequences for detecting gene conversion events, tandem duplication clusters that contained at least 3 genes were detected. For this program, the clustalW (CDS) alignment was used as the input. Geneconv can detect candidate fragments of directed gene conversion between gene pairs (allowing mismatch). Gene conversion events were considered as statistically significant when PAG & lt 0,05.


Ver el vídeo: Clase 14 Anotación de genomas y práctica (Septiembre 2022).


Comentarios:

  1. Alec

    Absolutamente de acuerdo contigo. En este algo es una excelente idea, mantenemos.

  2. Leof

    Bravo, idea notable

  3. Pemton

    Creo que estás equivocado. Discutamos esto.

  4. Tayte

    Esto es absurdo.

  5. Padric

    Creo que están equivocados. soy capaz de demostrarlo. Escríbeme por MP, te habla.

  6. Ittamar

    Es una pena, que ahora no puedo expresar, está muy ocupado. Volveré, necesariamente expresaré la opinión.



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