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Usar proporción o un índice de diversidad cuando se trata solo de dos cepas

Usar proporción o un índice de diversidad cuando se trata solo de dos cepas


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Estoy buscando el mantenimiento de la diversidad en un sistema experimental que consta de solo dos cepas. Tengo datos de recuento. Puedo calcular sus proporciones y puedo usar esos datos en mis modelos estadísticos, o puedo calcular la diversidad de Shannon o Simpson y usar esos datos.

Mi pregunta es: cuando se trata de solo dos cepas, ¿es realmente necesario utilizar un índice de diversidad calculado o las proporciones funcionarán bien?

El beneficio de usar proporciones es que es una métrica más accesible, que no requiere ningún conocimiento (aunque bastante básico) de los índices de diversidad y cómo alteran los datos.

Habiendo calculado Shannon, Simpson y las proporciones, y ejecutado los tres a través de mis modelos, no importa cuál use; los datos son bastante enfáticos. Mi instinto un poco educado es, en este caso, usar la métrica más simple, pero estoy buscando algunas opiniones sobre el caso.


Ampliado sobre la estadística sugerida

La proporción $ p $ definitivamente no es una buena medida de diversidad. Una proporción de 0 o 1 indica que no hay diversidad de especies, ya que solo existe una especie. Sin embargo, si una especie nunca alcanza una frecuencia de 0,5 en sus datos, podría ser razonable. De lo contrario, algo como $ p (1-p) $ podría ser una estadística de interés.

Si está dispuesto a usar $ 2p (1-p) $ (en lugar del $ p (1-p) $ anterior) como índice de diversidad, entonces podría señalar que se puede extender fácilmente a $ S $ especies con $ 1- sum_ {s = 1} ^ S p_s ^ 2 $, donde $ p_s $ es la frecuencia de la especie $ s $ por analogía con la diversidad genética dentro de las poblaciones (ver Nei 1973).

Tenga en cuenta que estas estadísticas serán sensibles al tamaño de la muestra. Por ejemplo, si muestreó solo un individuo, entonces este individuo solo puede pertenecer a una especie y su medida de diversidad solo puede ser cero. Es posible que desee calcular un estimador insesgado para esta estadística.

Tu objetivo es reducir la carga cognitiva del lector.

Su objetivo es utilizar una estadística que se comunique fácilmente. Si sus lectores van a estar muy acostumbrados a los índices de Simpson o Shannon, entonces incluso un índice matemáticamente más simple podría terminar generando una carga cognitiva adicional para el lector.

En mi opinión, será difícil dar una respuesta más definitiva sin saber 1) quiénes serán sus lectores (en qué revista pretende publicar) y 2) cuáles son la manipulación e interpretación de datos exacta que pretende realizar en base a en sus resultados. Por ejemplo, si facilita las comparaciones entre gráficos mediante el uso de una estadística más simple en lugar de una más complicada, entonces elegir la estadística más simple es una buena idea.

Buen análisis estadístico

En cualquier caso, es esencial que pruebes (y lo hiciste) diferentes medidas de diversidad de especies y te asegures de que tu conclusión sea sólida para estas diferentes medidas y expliques en tus métodos que la estadística elegida no importará. Eso hará que su punto y su elección de estadística sean mucho más sólidos.


Genómica comparativa de los genomas centrales y accesorios de 48 Sinorhizobiocepas que comprenden cinco genoespecies

Los sinorhizobios se encuentran entre los miembros mejor estudiados de las bacterias de los nódulos radiculares fijadoras de nitrógeno y aportan cantidades sustanciales de nitrógeno fijo a la biosfera. Mientras que el simbionte de alfalfa Sinorhizobium meliloti RM 1021 fue una de las primeras cepas de rizobios en ser completamente secuenciada, hay poca información disponible sobre los genomas de este grupo de especies grande y diverso.

Resultados

Aquí informamos el borrador de montaje y anotación de 48 cepas de Sinorhizobio que comprende cinco genoespecies. Tiempo S. meliloti y S. medicae están taxonómicamente relacionados, mostraron diferentes patrones de nodulación en diversos Medicago plantas hospedantes, y tienen diferencias en el contenido de genes, incluidos los involucrados en la conjugación y la utilización de azufre orgánico. Los genes implicados en la biosíntesis del factor Nod y los polisacáridos, la desnitrificación y los sistemas de secreción de tipos III, IV y VI también varían dentro de las especies y entre ellas. El fenotipado simbiótico y los análisis mutacionales indicaron que algunos genes de secreción de tipo IV están relacionados con la simbiosis y participan en la eficiencia de la fijación de nitrógeno. Además, existe una correlación entre la presencia de sistemas de secreción de tipo IV, genes de biosíntesis de hemo y desnitrificación microaeróbica y eficiencia simbiótica.

Conclusiones

Nuestros resultados sugieren que cada Sinorhizobio cepa utiliza una estrategia ligeramente diferente para obtener la máxima compatibilidad con una planta huésped. Este gran conjunto de datos del genoma proporciona información útil para comprender mejor las características funcionales de cinco Sinorhizobio especies, especialmente la compatibilidad en leguminosasSinorhizobio interacciones. La diversidad de genes presentes en los genomas accesorios de los miembros de este género indica que cada bacteria ha adoptado estrategias ligeramente diferentes para interactuar con diversos géneros de plantas y ambientes del suelo.


Biologia de sistemas

La biología de sistemas postula que un organismo es más que la suma de sus partes, es decir, que las propiedades emergentes que constituyen las características físicas de un organismo no pueden explicarse mediante un examen de todos los componentes individuales que lo constituyen. El estudio de organismos de forma holística no es nuevo como señalan Kahlem y Birney (Kahlem y Birney 2006), era la única forma de estudiar organismos hasta hace relativamente poco tiempo. En el siglo XIX, los científicos comenzaron a desarmar organismos a nivel molecular para estudiar sus componentes. A medida que se dilucidó el dogma central de la biología, se desarrollaron métodos cada vez más sofisticados para estudiar la biología molecular y, en la segunda mitad del siglo XX, la biología molecular dominó muchos campos de la biología. Con el advenimiento de la revolución de la genómica, se ha hecho posible reunir una lista completa de los genes y productos génicos de un organismo, en esencia, una lista de partes. El desarrollo posterior de otros enfoques ómicos nos ha permitido recopilar más datos de experimentos diseñados para detectar si los componentes aparecen en un organismo y en qué condiciones. El resultado ha sido una cantidad casi abrumadora de datos. En los últimos 10 años, se ha comenzado a reconocer más ampliamente que el paradigma de la biología de sistemas ofrece una manera de extraer significado de estos datos, y de ir más allá de simplemente domesticar los datos para usarlos para construir visiones integrales de un organismo, modelos que puede tener un enorme poder explicativo.

La biología de sistemas, como una forma de pensar y explorar la biología, tiene sus raíces en el trabajo de Ludwig von Bertalanffy sobre teoría de sistemas (Bertalanffy 1969) y el trabajo de Norbert Weiner & # x02019 sobre cibernética (Wiener 1948). Posteriormente a la publicación de ese trabajo, los biólogos comenzaron a aplicar & # x0201csystems thinking & # x0201d a la biología y buscaron descubrir las leyes básicas que gobiernan la evolución y el comportamiento, o al menos formalizar lo que eran (y son) explicaciones intuitivas de los fenómenos biológicos (por ejemplo). una revisión, ver Wolkenhauer 2001). La construcción de modelos es fundamental para la biología de sistemas. Los éxitos iniciales en el modelado de biología de sistemas se centraron en la bioquímica del metabolismo, con técnicas de modelado desarrolladas como parte de la Teoría del Control Metabólico (Heinrich y Schuster 1996) y la Teoría de Sistemas Biológicos (Voit 2000). Sin embargo, el pleno desarrollo de la biología de sistemas se vio obstaculizado por la falta de datos. Por lo tanto, los genomas y las masas aliadas de datos generados por métodos de alto rendimiento que comenzaron a aparecer en la década de 1990 representaron una oportunidad. Si se integran con cuidado, estos datos se pueden utilizar para construir un modelo que represente una comprensión a nivel de sistemas de una pieza determinada de maquinaria celular, o una célula, un órgano o un organismo, etc., según el tipo, la cantidad y la calidad de los datos y el nivel de abstracción deseado. Además, cuantos más datos se puedan integrar en el modelo, más confiable será nuestra visión del sistema, ya que cualquier ruido en los diferentes conjuntos de datos tenderá a cancelar e intensificar la señal. Otro factor importante en el surgimiento de la biología de sistemas ha sido el aumento constante del poder de las computadoras de escritorio. Para obtener una descripción general de la biología de sistemas, consulte (Aderem 2005, Barabasi y Oltvai 2004, Cornish-Bowden 2006, Hood et al. 2004, Ideker et al. 2001, Kitano 2002, Xia et al. 2004).


Orígenes y evolución

RRD: ¿Qué sabemos sobre el origen de este virus SARS-CoV-2 que causa Covid-19? ¿A qué virus se parece más? ¿Basado en que?

TG : Es un pariente genético bastante cercano al SARS, y los virus conocidos más estrechamente relacionados son los coronavirus que se encuentran en los murciélagos. Los murciélagos son portadores famosos de patógenos, dado que su sistema inmunológico no reacciona tan fuertemente a los patógenos como, por ejemplo, el nuestro, los murciélagos infectados a menudo no tienen síntomas fuertes (por lo que sabemos). Hay ideas interesantes sobre por qué esto puede estar relacionado con la gran cantidad de daño celular que experimentan los murciélagos como animales voladores. Si sus cuerpos reaccionaban de más a esto, se suicidarían. Así que tuvieron que evolucionar para atenuar cómo reaccionaban ante tal daño, y esto se extiende también a los patógenos. Parece que se las arreglan bien con una barriga llena de bagaje viral.

El hecho de que los coronavirus de murciélago sean los parientes más cercanos encontrados hasta ahora para el SARS-CoV-2 no significa que provenga directamente de ellos. Lo más probable es que haya pasado de los murciélagos a un huésped intermedio. Un fuerte sospechoso son los pangolines.

Figura 2. Los pangolines, también conocidos como osos hormigueros escamosos, se utilizan en algunas medicinas tradicionales y también se comen. Son animales extravagantes y hermosos que no podrían inventarse si no existieran. Esta imagen es de un pangolín de tierra (Smutsia temminckii) en la reserva de caza Madikwe en Sudáfrica. Foto de David Brossard. Comer pangolines es una doble amenaza porque al mismo tiempo amenaza al pangolín y prepara el escenario para el origen de nuevos virus cuando los pangolines que se comen coexisten en los mercados con otros huéspedes, como los murciélagos.

RRD: ¿Qué podría influir en la capacidad del SARS-CoV-2 de propagarse de persona a persona?

KK: Muchos virus respiratorios que circulan en los seres humanos se propagan a través de una combinación de transmisión por contacto (dos personas se tocan), transmisión aérea (camino a través del aire en el que estornudaste) y transmisión ambiental (toco algo que tocaste). Si una persona tiene que estornudar o toser para que se produzca la transmisión del virus, este virus probablemente no se propagará tan eficientemente como uno que también puede permanecer en los pomos de las puertas durante 2-3 semanas, de lo cual una persona puede contraer una infección viral sin nunca. acercarse a una persona infectada. Por lo tanto, qué tan bien se transmite este coronavirus a través de estas diferentes rutas de transmisión es un factor importante en la capacidad de propagación. Otra cosa que influiría mucho en la capacidad de propagación de este virus es cuando una persona infectada presenta síntomas en relación con cuando esa persona se vuelve infecciosa. Si un individuo puede transmitir el virus antes de saber que está enfermo, entonces el virus tiene una gran ventaja y los esfuerzos de control de la enfermedad se volverán menos efectivos.

RRD: En las noticias, hemos escuchado que existen diferentes "cepas" del virus. ¿Han evolucionado estas nuevas cepas del virus desde el origen del virus en Wuhan, China? ¿Como sabemos?

TG: Hace mucho tiempo (como hace tres días), se planteó la hipótesis de que podría haber 2 "cepas", S y L. Se planteó la hipótesis de que S era la cepa original que entró en los humanos. L evolucionó a partir de S después. Pero análisis más recientes encuentran que la designación de estas cepas fue prematura. Lo que parecían dos cepas era solo una variación dentro de una sola cepa sin ningún patrón fuerte, ya sea con respecto a la geografía o la historia. Esperamos que evolucionen nuevas cepas, y es posible que algunas ya lo hayan hecho, pero faltan datos para saber con certeza si lo han hecho, y mucho menos si alguna cepa que evolucionó o ha evolucionado posee nuevos rasgos, como la capacidad de propagarse más fácilmente.

SOK: De manera más general, el virus se acumulará genético mutaciones a medida que se propaga entre los humanos y expande su rango geográfico. Algunos de esos mutantes no son mejores o peores en la propagación o mejores en la propagación y la propagación junto con los no mutantes. Aquellos entre ellos que son mejores para poder reproducirse, sobrevivir y diseminarse crecerán en frecuencia en los humanos.

KK: Otra cosa rápida para agregar aquí: algunas de las mutaciones que ocurren en el virus no cambian los aminoácidos de las proteínas virales y, por lo tanto, no se cree que tengan un gran efecto sobre la aptitud del virus (es decir, su potencial de transmisión, o capacidad de propagarse entre individuos). Algunas mutaciones cambian los aminoácidos de las proteínas virales y, la mayoría de las veces, estas mutaciones son perjudiciales. Hacen que el virus sea menos capaz de propagarse. Sin embargo, una pequeña fracción de mutaciones es beneficiosa. Aumentan el potencial de transmisión del virus.

Rastreamos patrones de circulación viralobservando todos estos tipos de mutaciones. Al ver qué mutaciones se vuelven más comunes, también podemos comenzar a tener una mejor idea de qué mutaciones pueden ser beneficiosas y pueden permitir que el virus se adapte mejor a los humanos. Si estas mutaciones son realmente beneficiosas o no, debe confirmarse experimentalmente, ya que otros factores (solo casualidad, factores ambientales en diferentes regiones geográficas, etc.) también podrían afectar los cambios en la frecuencia de una mutación en la población viral, especialmente al principio de un período. epidemia.

RRD: ¿De qué otras formas podría evolucionar el virus?

SOK: Las cepas mutantes podrían propagarse mejor entre los humanos, pero también podrían desarrollar la capacidad de propagarse a otros animales y entre ellos. Podemos predecir qué parte del virus podría estar asociada con este llamado "cambio de host". Los virus deben unirse a los receptores de las células huésped. Con el SARS-CoV-2, sabemos que algunos segmentos genéticos controlan cómo el virus se adhiere a los receptores de las células huésped y entra en ellos. Esto incluye, por ejemplo, algo llamado " dominio de unión al receptor ”De una proteína llamada“ proteína de pico ”(está asociada con los picos en el exterior del virus). Es este segmento genético el que produce esta proteína que reconoce la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) del receptor del huésped. Como resultado, son los genes de este segmento genético los que son importantes para comprender el origen del virus.

RRD: En otras palabras, ¿esperamos que los genes asociados con la forma en que un virus golpea la puerta de una célula evolucionen a medida que el virus cambia de huéspedes con un tipo de puerta a huéspedes con otro tipo de puerta?

SOK: Más o menos, sí.

TG: Considere la influenza A como un ejemplo clásico. La gripe aviar "saltó" a los cerdos donde se adaptó y se volvió capaz de infectar y propagarse en humanos, luego de los cerdos a las cosas que se alimentan de ellos (por ejemplo, visones en Dinamarca) o están cerca de ellos (humanos). No estoy seguro de si hay saltos documentados de humanos a cerdos, etc., pero lo asumiría.

RRD: Para decir lo implícito aquí, la puerta del cerdo es más similar a la puerta humana que la puerta del pájaro a la puerta humana, por lo que el virus que puede abrir la puerta del cerdo tiene más posibilidades de abrir la puerta humana.

TG: Podríamos haber extendido demasiado la metáfora, pero sí, sus receptores y mis receptores se parecen más a los receptores de un cerdo que a los de un pollo.

MK: Retrocediendo un poco aquí, nos preocupamos principalmente por las enfermedades que provienen de los animales y comienzan a infectar a las personas, pero también retribuimos. La transmisión de la influenza humana a los cerdos es bastante común. Incluso hubo algunos informes de personas que contagiaron a sus perros y gatos H1N1 * en 2009. Y un chimpancé en un zoológico de Chicago contrajo un virus respiratorio diferente (metapneumovirus humano) de los humanos. No se sabe con qué frecuencia sucede esto porque realmente no lo buscamos mucho.

Pero agregaré que, si bien las mutaciones en estos virus les ayudan a encontrar nuevos huéspedes para infectar, también podemos usar esta información para desarrollar terapias. Hay algunas partes del virus que tienen funciones muy importantes que desempeñar, y si esa proteína muta demasiado, o en el lugar equivocado, el virus no puede crecer. Cuando miramos los genomas de todos estos virus, podemos ver estas regiones y podemos diseñar medicamentos que actúen contra esas partes del virus. Todo parte de la carrera armamentista evolutiva entre nosotros y los patógenos.

* H1N1, también conocida como “gripe porcina”, fue responsable de la pandemia de gripe de 2009.
Figura 3. Una visualización del virus. Los coronavirus son virus "envueltos", esto significa que el componente principal de su capa exterior está compuesto por una bicapa lipídica (mostrada en gris) que roba de la célula infectada. Además de la bicapa lipídica, la capa externa tiene 3 proteínas virales denominadas colectivamente proteínas "estructurales" porque son parte de la capa externa y le dan al virus su forma y estructura físicas. Las tres proteínas estructurales del coronavirus se conocen como S, M y E. Los triángulos rojos son los "picos" del virus (compuestos por la proteína S) que interactúan con los receptores de las células humanas. Son las llaves que se ajustan a las cerraduras de la celda anfitriona. Los puntos naranjas son la proteína M (proteína de membrana), que es la proteína estructural viral más abundante, ayuda a que la membrana (bicapa lipídica) del virus se pliegue e interactúa con las otras proteínas. Finalmente, los puntos amarillos son la proteína E (proteína de la envoltura). Esta es la proteína estructural menos comprendida, pero juega un papel en el ensamblaje del cuerpo del virión (un virión es solo un virus), la liberación del virus hijo de las células hospedadoras infectadas y la patogénesis. Dentro del sobre que se muestra aquí, con su membrana y proteínas, está el ARN del virus, en el que se centra gran parte de nuestra discusión aquí. La ilustración fue creada por el Centro para el Control de Enfermedades (CDC).

RRD: ¿Se prevé que el SARS-CoV-2 se vuelva más o menos virulento a medida que se propaga? ¿Por qué?

TG: Pregunta difícil.Desde un punto de vista evolutivo & # 8230 para sobrevivir, el virus necesita maximizar su propagación y persistir. Si mata demasiado rápido & # 8230, no se transmitirá. Sin embargo, si evoluciona de manera que reduce su tasa de replicación en un ser humano individual, habrá tan poco virus en las cosas desagradables que nos contagiemos (mocos, saliva, otros ...), no se transmitirá. . Una forma “ideal” (ideal desde la perspectiva del virus) sería tal vez como el resfriado común & # 8230: te hace sentir un poco mal, pero no lo suficiente como para meterte en la cama (evitando así a los demás). Te hace estornudar y babear, para pasárselo a los demás. Pero no te mata, lo que te permite seguir estornudando, goteando y esparciéndote. Tenga en cuenta que en este punto ya puede ser ideal, ya que no mata a la mayoría de las personas, y ciertamente no mata a las mejores personas por propagarlo (jóvenes activos y niños que se mueven mucho más que los ancianos y los enfermos. Así que en realidad me sorprendería si se volviera muy diferente a como es ahora. Simplemente no hay mucho que seleccionar para evitar que sea patógeno para los ancianos / enfermos.

DR: Una de las razones por las que el SARS-CoV-2 es particularmente mortal es que la inflamación que causa en los pulmones da lugar a síntomas similares a los de la neumonía. Esto es en gran parte un daño autoinfligido que surge de nuestra propia respuesta inflamatoria. No está claro que causar síntomas similares a los de la neumonía beneficie de alguna manera al virus e incluso pueda reducir su potencial de transmisión al hacer que las personas infectadas sean menos móviles. Por lo tanto, es posible que haya una selección del virus para desencadenar una respuesta inmune menos agresiva en los pulmones. Pero también puede ser que la respuesta inmune esté más bajo el control del huésped que del virus. Este ciertamente parece ser el caso en ratones donde existe una tremenda variación genética entre diferentes cepas de ratones en su respuesta inmune a los coronavirus similares a los SAR.

RRD: El virus ideal haría que su anfitrión también fuera más social, menos dispuesto a obligar a los esfuerzos de distanciamiento social.

TG: Para continuar ... si salta de humanos a otra especie junto a nosotros (y claramente no tiene problemas para saltar distancias bastante grandes ... incluso si no fue directamente de un murciélago a humanos sino a través de un intermedio ...) entonces esto también podría cambiar su tasa de evolución. Y posiblemente hacerlo más o menos virulento/patógeno. Tanto para lo que sea la nueva especie hospedadora como para las nuevas especies hospedadoras futuras, pero también si regresa a los humanos.

RRD: ¿Qué más podemos predecir sobre su evolución?

TG: Ciertamente continuará diversificándose en más y más cepas (o para ser más precisos, subclades). Se puede ver si esto tiene algún efecto biológico & # 8230, pero uno podría esperar que tenga ramificaciones para la eficacia de vacunas& # 8230 y ordenar el desarrollo de vacunas específicas para cepas (algo así como con la influenza-A).

MK: Estoy de acuerdo con Tom (TG), pero agregaré que es realmente difícil saber ahora qué va a pasar, pero lo que hagamos o no hagamos en respuesta influirá en su evolución. No quiero sugerir que las vacunas sean malas, necesitamos una vacuna, pero a medida que la población se desarrolla inmunidad que aplicará nuevas presiones evolutivas sobre el virus.

RRD: ¿Cuáles de los genes del virus evolucionan más rápidamente? ¿Qué genes deben evolucionar para permitir que el virus tenga éxito en los seres humanos (en comparación con, digamos, murciélagos o pangolines)?

TG: ¡Necesitamos hablar con un virólogo o alguien como Eddie Holmes * que está mirando las secuencias generadas hasta la fecha para obtener una buena respuesta sobre esto! Pero probablemente los genes están bajo la selección más fuerte para evitar el sistema inmunológico o para ingresar a las células por el exterior del virus.

MK: Como virólogo, diré que esto cambiará con el tiempo. Al principio, cuando "dio el salto" a los humanos y evolucionó para propagarse de persona a persona, probablemente hubo presión sobre muchos genes diferentes. Los genes de la superficie externa que se unen a nuestras células y sus otros genes que se utilizan para apoderarse de nuestras células. Ahora que ha estado exitosamente en humanos por un tiempo, la mayor parte de la presión evolutiva estará en la proteína de pico (nuevamente, esta es la proteína asociada con los picos en el exterior del virus que lo ayudan a unirse a las células huésped) y otros proteínas clave asociadas con la membrana del virus. Sin embargo, habrá partes de esta proteína que son críticas para unirse al receptor de la célula huésped. Por lo tanto, es probable que la evolución suceda de manera que conserve esa parte de la proteína, pero aún así cambie el resto de manera que nuestro sistema inmunológico ya no la reconozca.

* Tom le envió un correo electrónico a Eddie. Eddie no dijo qué genes podrían estar evolucionando más rápido, pero dijo que no había evidencia de que los genes de virulencia lo estuvieran todavía.

RRD: ¿Cómo sería diferente la evolución o propagación del virus si la mayoría de las personas estuvieran vacunadas contra él (imaginando la existencia y liberación de una vacuna)?

KK: Hay dos posibles resultados generales de la vacunación contra un virus como este ... Si las tasas de vacunación son lo suficientemente altas, el virus no podría continuar circulando y extinguirse. El nivel de vacunación requerido se denomina umbral de vacunación y depende del potencial de transmisión (“número de reproducción básico, ”R0) del virus. Cuanto mayor sea el potencial de transmisión, mayor será la proporción del público que debe vacunarse para detener (o incluso ralentizar) el virus. Si la vacunación aún se produjo en niveles relativamente altos, pero no lo suficientemente altos para evitar que el virus se propague, entonces la vacunación de algunas personas (siempre que la vacuna sea una vacuna protectora de alta eficacia) en realidad también protegería a algunas de las personas no vacunadas. Esto se denomina "inmunidad colectiva" y se produce porque la vacunación reduce la cantidad de virus en circulación y, por lo tanto, disminuye la velocidad a la que los individuos no vacunados también se infectan.

Figura 4. El eje x muestra las tasas de reproducción básicas (R0) de diferentes virus. El eje y muestra la proporción de personas que deben vacunarse para detener un virus (pc). El SARS-CoV-2 está en aproximadamente 3.0, la gripe estacional entre 2, la varicela en 10 y el sarampión en la friolera de 16. Esta comparación ofrece algunas buenas noticias sobre el SARS-CoV-2 en el sentido de que significa que una vez que se aplica una vacuna desarrollado, ampliamente disponible y utilizado que una proporción menor de la población necesita para conseguirlo para que sea eficaz que en el caso del sarampión. La advertencia es que el sesenta por ciento de la población mundial (leyendo en el eje y) es una gran cantidad de vacunas. Basado en una figura similar en Keeling, M. J. y Rohani, P. (2011). Modelización de enfermedades infecciosas en humanos y animales. Prensa de la Universidad de Princeton.

SOK: Puedo imaginarme el virus circulando en focos de personas no vacunadas, ya sean casos o asintomáticos.

KK: También existe la posibilidad de que la vacunación a niveles altos (pero por debajo del umbral de vacunación) pueda ejercer presiones de selección sobre el virus para escapar de la inmunidad del huésped proporcionada por la vacuna. En este caso, es posible que en última instancia sea necesario reformular la vacuna para que se base en una cepa de virus diferente.

DR: Humano anticuerpos contra los coronavirus se dirigen al dominio Spike (los triángulos rojos en la figura 4), la misma proteína que usa el virus para unirse a los receptores celulares humanos como ACE2 (esas puertas nuevamente). Esto coloca al virus en una situación evolutiva porque si sus picos cambian demasiado, no pueden unirse a los receptores del huésped, pero si no cambian lo suficiente, son atacados por el sistema inmunológico del huésped. Pero esta situación no es exclusiva de los coronavirus. Por ejemplo, la proteína hemaglutinina de la influenza también sirve como proteína de unión al receptor y es igualmente un objetivo principal de los anticuerpos humanos. Sabemos por el estudio de virus como la influenza que estas proteínas son bastante flexibles en su capacidad para tolerar mutaciones que les permiten escapar de la inmunidad mientras conservan sus otras funciones biológicas. Mi predicción, aunque especulativa, es que el SARS-Cov-2 podrá escapar de los anticuerpos humanos generados por una vacuna o por la inmunidad natural. De hecho, existe alguna evidencia preliminar de que otros coronavirus humanos comunes como HCoV-OC43 evolucionan para escapar de la inmunidad basada en anticuerpos. Es importante señalar que esto de ninguna manera disminuye la importancia de desarrollar una vacuna, sino que es posible que la vacuna deba actualizarse con el tiempo, como Katia (KK) aludió anteriormente.

MK : Depende de qué tipo de inmunidad se confiere y cuánto tiempo dura. Hay vacunas que proporcionan "inmunidad esterilizante”Y luego hay otros que solo previenen enfermedades. Estos diferentes tipos de protección impulsan la evolución del virus de manera diferente. La inmunidad esterilizante es lo que buscamos en la mayoría de las circunstancias y es el tipo de inmunidad que la vacuna contra la gripe espera conferir, y lo hace cuando la vacuna se combina correctamente con la cepa circulante. En este caso, ha inducido altos niveles de anticuerpos en la persona antes de que se infecte, y luego, cuando el virus aparece, los anticuerpos bloquean el inicio del virus. Es por eso que cada década más o menos se observa un cambio en el subtipo dominante de HA en los casos de gripe estacional en humanos. Cuando toda la población tiene inmunidad esterilizante (por vacunación o infección) ese subtipo ya no circula muy bien y es reemplazado por otro.

Si no obtiene inmunidad esterilizante, termina con una infección de bajo nivel (y los anticuerpos disminuyen, pero no detienen el virus en su cuerpo), pero no es lo suficientemente malo como para enviarlo al médico. Esta infección subclínica permite que el virus se replique en humanos y recoja nuevas mutaciones y luego es solo una cuestión de selección darwiniana hasta que surge un virus que se propaga más rápido o mata más rápidamente. Hay algunos ejemplos de esto en humanos, pero el ejemplo mejor estudiado es la vacuna contra el virus de la enfermedad de Marek en pollos. Desde que esta vacuna se introdujo por primera vez en la década de 1950, ha surgido una versión más virulenta del virus cada 10-20 años que requiere una nueva vacuna.

RRD: ¿A qué debemos prestar atención con respecto a la biología del virus? ¿Qué son las incógnitas?

TG: ¿Mutará / cepas de él de manera que negará la eficacia de la pruebas de diagnóstico? ¿O afectar la eficacia de las vacunas?

RRD: Oh, Dios, no había pensado en la posibilidad de que las cepas pudieran evolucionar de tal manera que se volvieran indetectables.

MK: Todavía es temprano, pero para mí la gran pregunta es cómo es la inmunidad a estos virus. ¿Cuánto dura? Hay varios coronavirus que todos vemos cada año. Causan el resfriado común. Cada año nos infectamos con más o menos los mismos virus porque nuestra inmunidad a estos virus solo dura unos 6 meses. ¿Será lo mismo para el SARS-CoV-2? O tal vez todavía nos infecte el SARS-CoV-2, pero la próxima vez simplemente hará frío.

RRD: ¿Qué no pregunté que debería tener (y si usted plantea la pregunta, también ofrezca algo de respuesta)?

TG: Covid-19 es una cosa & # 8230, pero difícilmente será la única vez que esto suceda. ¿Cómo podemos evitar que esto vuelva a suceder? ¿Y cómo lidiamos con los problemas un poco incómodos que cuando los gobiernos actúan mal (por ejemplo, suprimen la verdad & # 8230 minimizan el efecto & # 8230 juegan en las conspiraciones) & # 8230 & # 8217 es condenadamente difícil evitar que esto vuelva a suceder? Para ser honesto, creo que hemos tenido mucha suerte con Covid-19 en comparación con lo que podríamos haber terminado.

JC: Creo que tenemos que pensar en cómo adaptamos nuestras respuestas a la biología de los virus. Hasta el momento del Ébola, la financiación para el estado y la población local era categórica por enfermedad. Luchamos muy duro para decir que todas las respuestas son, en esencia, las mismas con matices específicos de la enfermedad y en gran parte relacionadas con el alcance, la escala y el mecanismo de transmisión. Cada respuesta realmente se basó en la anterior. Afortunadamente / desafortunadamente, los brotes nunca estuvieron lo suficientemente cerca como para probar si lo que hicimos fue correcto y muchas veces tuvimos que volver a aprender algunas de las prácticas. Además, nunca se han desarrollado métodos de investigación sólidos para probar los componentes de la respuesta, la mayoría de los cuales fueron adoptados de la práctica de salud pública a pequeña escala “diaria” u otra práctica de respuesta a emergencias no relacionada con la salud.

Esto significa que hicimos suposiciones sobre los resultados y nos sorprendió cuando, por ejemplo, el H1N1 tenía una tasa de letalidad particularmente alta en mujeres embarazadas y los ancianos estaban algo protegidos. Esto es muy diferente de la influenza estacional, que fue el modelo para predecir las poblaciones en riesgo. Y esto no se dio cuenta hasta bien entrada la pandemia. Los métodos como los ensayos de control aleatorios simplemente no funcionan durante una emergencia y la adaptación de otras metodologías de investigación, incluido el análisis cualitativo, aún no se respeta del todo.

JC: También & # 8230 Para Covid-19 hubiera sido bueno tener la infraestructura de investigación / evaluación en su lugar para evaluar qué tan efectiva fue o no la cuarentena y cuáles fueron los matices que la hicieron así. más eficaz a medida que se propaga geográficamente. Por ejemplo, la cuarentena comunitaria en Wuhan logró mitigar la propagación hacia el exterior (tenga en cuenta que la cuarentena en este entorno no tiene la intención de eliminar la propagación, simplemente elimínela para que otros puedan prepararse y el sistema de atención médica no se vea abrumado) pero la cuarentena del crucero. lo más probable es que haya fallado para los que estaban en el barco. Una talla no sirve para todos.

RRD: ¿Existe alguna habilidad particular de algún virus o una historia sobre un virus (que no sea el coronavirus) que te fascina especialmente?

Figura 5. Micrografía electrónica de un mimivirus. Imagine por Ghigo E, Kartenbeck J, Lien P, Pelkmans L, Capo C, Mege JL, Raoult D. De… PLoS Pathog. 134 de junio de 2008 (6): e1000087. doi: 10.1371 / journal.ppat.1000087.

DR: Tendemos a pensar en la mayoría virus como especialistas altamente adaptados para infectar una sola especie. Dichos especialistas enfrentan compensaciones que limitan la capacidad de cualquier cepa particular de virus para infectar múltiples especies diferentes. Qué

Lamentablemente para nosotros es que los virus como los coronavirus similares a los SAR se parecen más a los generalistas y pueden prosperar en muchos hosts diferentes. Todo lo que necesitan es un poco de tiempo para adaptarse a un nuevo anfitrión. Para mí, es algo inspirador que algo tan pequeño y limitado en términos de tamaño de su genoma pueda ser tan flexible.

TG: Bueno, están los mimivirus gigantes que están causando algunos dolores de cabeza filosóficos sobre lo que define a un virus. Por lo general, son tan grandes en tamaño genómico como físico como bacterias como Rickettsia y sus genomas codifican productos que normalmente no se han visto en virus, incluida la síntesis de nucleótidos y aminoácidos. Pero, por otro lado, no tienen el mecanismo para la traducción de proteínas y el metabolismo energético, que son rasgos que normalmente asociamos con los organismos vivos.

SOK : Virus de la influenza A (cambio y deriva antigénicos). Coala retrovirus (tanto exógenos, es decir, transmitidos entre individuos, como endógenos, es decir, heredados de padres a hijos).

JC: En cuanto a cuál es mi agente favorito desde la perspectiva de la preparación: tiene que ser la gripe. Ese pequeño cabrón es demasiado adaptable para que podamos manejarlo y requiere un enfoque completamente nuevo. Tenemos que tener planes y una vacuna que no necesite revisiones anuales. Todo esto es consistente con la construcción de resiliencia, ya sea biológica, social o conductual: absorber el trauma y estar listo para la próxima vez.

TG: Y luego están los virus humanos que deben tener un origen animal, pero realmente no es obvio de qué animal. Creo, por ejemplo, que la viruela todavía no tiene una buena explicación del origen animal. Y existe el virus del herpes salvaje. Lo que me hace reír de su nombre.

MK: ¿Cuánto tiempo tienes ?, dijo el virólogo. Todo lo anterior, pero probablemente uno de mis temas favoritos es el campo relativamente nuevo que analiza transferencia de genes horizontal por los virus (desde los virus hasta sus huéspedes y los huéspedes hasta los virus) y cómo pueden haber ayudado a las plantas y los animales a dar grandes saltos en la evolución. Como ejemplo, existe alguna evidencia de que los genes de los retrovirus en realidad proporcionaron el componente básico para permitir el desarrollo de la placenta.


2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Secuenciación de dos aislamientos australianos

Se secuenciaron dos aislamientos australianos (BetaCoV / Australia / VIC02 / 2020 y BetaCoV / Australia / SA01 / 2020) con la plataforma MiSeq (Illumina, Inc). En resumen, se purificó el ARN de cada aislado utilizando un kit Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research). El ARN purificado se transcribió de forma inversa usando un kit de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems) con octámeros aleatorios unidos a una secuencia de cebador específica, seguido de síntesis de ADNc de segunda hebra usando ADN polimerasa I de Klenow (Promega). El ADN complementario se amplificó aún más (utilizando cebadores específicos de las secuencias añadidas a los octámeros aleatorios utilizados para la transcripción inversa) con un kit KAPA HiFi HotStart (Roche). El ADN resultante se purificó utilizando un kit DNA Clean and Concentrator (Zymo Research). La fragmentación y la preparación de la biblioteca de doble índice se realizó usando un kit de preparación de biblioteca de ADN Nextera XT (Illumina, Inc), y las bibliotecas desnaturalizadas se secuenciaron usando un kit de reactivos MiSeq de 300 ciclos v2 (Illumina, Inc). Las lecturas de secuenciación se recortaron por calidad y se asignaron a la secuencia de referencia publicada (BetaCoV / Wuhan-Hu-1/2019 GenBank número de acceso NC_045512.2) utilizando Geneious 11.1.4. Se generaron secuencias de consenso del genoma de los aislados para su análisis.

2.2 Preprocesamiento y alineación de GISAID

Todas las secuencias virales disponibles se descargaron de GISAID (el 05/03/2020, ver Apéndice S3 (Elbe, & Buckland-Merrett, 2017)), filtrando las secuencias completas de origen humano (187 genomas en total). Las secuencias de baja calidad (definidas como secuencias con un contenido de N superior al 1%) se filtraron dejando 178 cepas en total. También incluimos una secuencia viral informada recientemente del European Virus Archive global (Ref-SKU: 026V-03883) y las dos secuencias australianas en el conjunto de datos completo.

Este conjunto de datos de 181 secuencias se alineó entre sí utilizando Muscle (v3.8.31) (Madeira et al., 2019). Basándonos en las alineaciones, pudimos ver una variación significativa en los extremos de las secuencias (Figura S1), probablemente debido a artefactos de secuenciación y errores que impiden la secuenciación de los genomas virales completos. Para reducir el impacto de posibles errores de secuenciación, escribimos un script de Perl personalizado para recortar las secuencias de modo que solo se mantuvieran las posiciones con una cobertura del 95%. Este recorte implicó eliminar los primeros 101 y los últimos 72 pb de las alineaciones.

Una vez recortado y convirtiendo todas las "U" en "T", identificamos 54 secuencias que eran idénticas. Para limitar el efecto de las secuencias duplicadas en el análisis posterior, las agrupamos en una sola entrada. Estas secuencias colapsadas se resumen en la Tabla S1.

Para validar la metodología, hemos incluido secuencias de otros coronavirus. Elegimos una combinación de controles de la siguiente manera: 7 secuencias de SARS de origen humano (números de acceso de GenBank AY274119.3, AY291451.1, AY502923.1, AY502932.1, AY559083.1, AY559084.1 y AY559087.1), 10 SARS secuencias de origen murciélago (números de acceso KY417142.1 a KY417152.1), 4 secuencias MERS de origen humano (números de acceso KJ477102.1, KT006149.2, KT026453.1 y KT029139.1) y 2 secuencias MERS de origen murciélago (accesión números MG596802.1 y MG596803.1).

2.3 Árbol filogenético

El árbol filogenético de máxima probabilidad se generó a partir de las alineaciones anteriores utilizando RAxML-NG (Kozlov, Darriba, Flouri, Morel y Stamatakis, 2019). El modelo evolutivo utilizado fue un modelo reversible en el tiempo general con heterogeneidad de tasa distribuida por rayos gamma y sitios invariantes (GTR + G + I). Usamos este modo ya que es el modelo más general y se ha propuesto producir árboles iguales a modelos seleccionados de manera óptima (Abadi, Azouri, Pupko y Mayrose, 2019). El árbol se visualizó utilizando iTOL (Letunic & Bork, 2019) como un árbol enraizado de punto medio y muestra las probables relaciones evolutivas entre las cepas muestreadas.

2.4 Método K-mer

Cada organismo y potencialmente aislado puede tener una firma genómica única basada en la composición de su secuencia genómica. Para cuantificar esta firma, determinamos la frecuencia K-mer. El conteo de todas las cadenas posibles de longitud k en la secuencia del virus ha surgido como una alternativa a los árboles filogenéticos en otras disciplinas (Sims, Jun, Wu y Kim, 2009). La distancia conceptual entre todos los aislamientos se puede visualizar ejecutando un análisis de componentes principales (PCA) sobre todas las firmas genómicas para reducir este vector de frecuencia K-mer de alta dimensión en un espacio bidimensional (Jolliffe y Cadima, 2016). Consulte el Apéndice S1 para obtener más detalles sobre este método.

Se utilizaron scripts personalizados para calcular la frecuencia de K-mer para cada secuencia utilizando una k de 10 (Sims et al., 2009). Se eliminaron los K-meros que contenían bases ambiguas (es decir, N). Luego calculamos la proporción relativa de cada K-mer, lo que resultó en un vector de frecuencia. Usamos la implementación PCA de Python scikit-learn para reducir las firmas genómicas que contienen 1,048,576 proporciones de 10 meros en un vector que contiene dos componentes principales. Finalmente, se utilizaron scripts personalizados para comparar las firmas genómicas de todas las secuencias de coronavirus mencionadas anteriormente.


Selección de imprimaciones en HTS

En la investigación de hongos, se utilizaron varios cebadores de PCR dirigidos al locus del ARN ribosómico (ARNr), principalmente el espaciador transcrito interno (ITS), en los estudios iniciales de diversidad de OM (Selosse et al., 2004 Shefferson et al., 2005 Bonnardeaux et al., 2007). Sin embargo, una secuencia de ADNr acelerada complica la amplificación de uno de los taxones de OMF más comunes (Taylor et al., 2002 Binder et al., 2005), la familia Tulasnellaceae (ver más abajo), lo que impulsa el desarrollo y la optimización de la PCR específica de OM. imprimaciones.

Taylor y McCormick (2008) desarrollaron por primera vez cebadores específicos ITS1-OF e ITS4-OF para estudiar la diversidad de OM mediante la amplificación de la ITS completa basada en las secuencias de hongos basidiomicetos que incluyen Tulasnella especies. Este conjunto ha sido ampliamente utilizado para la identificación de OM vía clonación y secuenciación (Xing et al., 2015, 2017, 2019 Jacquemyn et al., 2016a Kaur et al., 2019 Rammitsu et al., 2019). La cartilla ITS4Tul diseñada por Taylor (1997) también se usa ampliamente para buscar Tulasnella diversidad junto con cebadores ITS1 o ITS5 (Bidartondo et al., 2003 Abadie et al., 2006 Taylor y McCormick, 2008 McCormick et al., 2012, 2016). Más tarde, un en silico El análisis sugirió que los cebadores ITS3 / ITS4OF e ITS86F / ITS4, dirigidos a la subregión ITS2 de ITS, eran los más ideales para muestras de raíces de orquídeas (Waud et al., 2014), incluso si no siempre funcionan bien en muestras de suelo. Además, debido a que ITS2 puede producir más unidades taxonómicas operativas (OTU) y mayor riqueza filogenética que la otra subregión ITS1, muchos investigadores lo prefieren para la identificación de hongos a través de plataformas HTS (Mello et al., 2011 Tedersoo y Lindahl, 2016 Nilsson et al. ., 2019). En la última media década, ITS3 / ITS4OF se utilizaron con frecuencia para identificar comunidades de hongos micorrízicos en raíces de orquídeas de orquídeas terrestres y los suelos circundantes (Jacquemyn et al., 2015a, 2017b Esposito et al., 2016 Duffy et al., 2019). Además, ITS86F / ITS4 todavía se usa para la detección de parejas micorrízicas de orquídeas epífitas (Cevallos et al., 2017, 2018a Herrera et al., 2019b Izuddin et al., 2019 Jacquemyn et al., 2021).

En particular, ITS4OF exhibe cuatro desajustes con el 64% de Tulasnellaceae y múltiples desajustes en otros ensamblajes de Basidiomycota y Ascomycota. De manera similar, considerando que ITS86F tiene cinco desajustes en el 83% de Tulasnellaceae, Oja et al. (2015) etiquetaron los cebadores modificados ITS1ngs, ITS1Fngs e ITS4ngs, y desarrollaron el cebador ITS4Tul2 para la longitud completa de ITS. Su utilización integrada coincidió con la mayoría de los conjuntos micorrízicos conocidos de orquídeas (incluido el 97% de Tulasnellaceae). Recientemente, un cebador 5.8S-OF recientemente desarrollado combinado con dos cebadores inversos diferentes (ITS4OF e ITS4Tul) reveló un buen éxito en OMF (Vogt-Schilb et al., 2020).

Tulasnellaceae (del orden Cantharellales) son los simbiontes micorrízicos clave de las orquídeas, principalmente sus clados A y B. En comparación con el clado A, el clado B está bien diferenciado y apenas amplificado por cebadores generales o incluso por cebadores específicos de Tulasnellaceae (Girlanda et al. , 2011 Lindahl et al., 2013). De acuerdo con la base de datos Nordic ITS Ectomycorrhiza (UNITE) de fácil uso dedicada a la identificación molecular de hongos, 1 aproximadamente 3/4 de las secuencias de Tulasnellaceae pertenecen al clado A, sin embargo, considerando fuertes sesgos de cebadores y de muestreo (principalmente en el hemisferio norte), Tulasnellaceae clade B podría estar subrepresentada, a pesar de ser igualmente común (Oja et al., 2015). Por lo tanto, los estudios futuros que se centren en la diversidad de OM deberían elegir meticulosamente los cebadores y evaluar sus posibles sesgos.

Uno puede ser consciente de que ningún juego de imprimaciones es perfecto y considerar el uso de varios juegos disponibles en el momento de diseñar el estudio. En base a esto y a una serie de trabajos de nuestro equipo de investigación (datos no publicados), se recomienda encarecidamente demandar múltiples pares de cebadores con baja superposición de amplificación. Se pueden fusionar y combinar con un método de amplificación por PCR anidado para identificar el número máximo de parejas de micorrizas de orquídeas (Oja et al., 2015 Voyron et al., 2017 Vogt-Schilb et al., 2020). Se recomendó el uso de tres pares de cebadores optimizados, ITS1ngs-ITS4ngs, ITS1Fngs-ITS4ngs e ITS1-ITS4Tul2, para 454 pirosecuenciación. Para la secuenciación de amplicones utilizando MiSeq PE300 y HiSeq PE250, se pueden recomendar dos pares de cebadores (Figura complementaria S1), a saber, ITS1F-ITS4 e ITS1-ITS4Tul para la primera ronda de amplificación (Gardes y Bruns, 1993 Bidartondo et al., 2003) . Los productos de PCR pueden someterse además a amplificación por PCR anidada utilizando cebadores ITS86F-ITS4 e ITS86F-ITS4Tul, que capturan una gran diversidad de hongos micorrízicos asociados con 72 variedades de orquídeas epífitas tropicales cultivadas en la naturaleza (Li et al., Inédito). Para la secuenciación PacBio Sequel de tercera generación, se pueden recomendar los cebadores optimizados ITS1ngs-TW14ngs, ITS1Fngs-TW14ngs e ITS1-ITS4Tul2 (consulte la Tabla complementaria S1 para conocer las secuencias de cebadores mencionadas anteriormente). En el futuro, la secuenciación rápida de raíces, que no proporciona amplificación por PCR, aunque se puede observar un hongo, puede permitir desentrañar clados que escapan a todos los cebadores disponibles, si los hay.


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3. Resultados

3.1 Diversidad global de CoV

Se analizó la presencia de CoV en un total de 19192 animales y seres humanos mediante PCR de consenso (cPCR) (Tabla 1). La mayoría eran murciélagos (n = 12.333), lo que representa 282 especies de doce familias. En general, la proporción de individuos positivos a CoV fue del 8,6% en murciélagos (n = 1.065 / 12.333) y del 0,2% en los no murciélagos (n = 17 / 6.859). En otras palabras, más del 98% de todos los individuos positivos fueron murciélagos.

Resumen de individuos evaluados y número positivo para al menos un coronavirus por taxa hospedante.

Pruebas de taxones hospedadores. No. individuos evaluados. No. individuos positivos. No. virus distintos detectados.
Murciélagos 12,333 1,065 91
Primates no humanos 3,470 4 2
Roedores y musarañas 3,387 11 7
Humanos 1,124 2 2
Total 19,192 1,082 100 a
Pruebas de taxones hospedadores. No. individuos evaluados. No. individuos positivos. No. virus distintos detectados.
Murciélagos 12,333 1,065 91
Primates no humanos 3,470 4 2
Roedores y musarañas 3,387 11 7
Humanos 1,124 2 2
Total 19,192 1,082 100 a

a Nota: Las cifras no suman el total, ya que se detectaron dos virus en dos taxones.

Resumen de individuos evaluados y número positivo para al menos un coronavirus por taxa hospedante.

Pruebas de taxones hospedadores. No. individuos evaluados. No. individuos positivos. No. virus distintos detectados.
Murciélagos 12,333 1,065 91
Primates no humanos 3,470 4 2
Roedores y musarañas 3,387 11 7
Humanos 1,124 2 2
Total 19,192 1,082 100 a
Pruebas de taxones hospedadores. No. individuos evaluados. No. individuos positivos. No. virus distintos detectados.
Murciélagos 12,333 1,065 91
Primates no humanos 3,470 4 2
Roedores y musarañas 3,387 11 7
Humanos 1,124 2 2
Total 19,192 1,082 100 a

a Nota: Las cifras no suman el total, ya que se detectaron dos virus en dos taxones.

Se obtuvieron secuencias parciales de dos fragmentos no superpuestos del gen orf1ab, produciendo 654 secuencias para la región "Quan" y 950 para la región "Watanabe" (ver "Métodos"). Hubo un solapamiento del 27%, donde se obtuvieron secuencias para ambas regiones de la misma muestra. La distribución de identidades de secuencia por pares definió un límite del 90% entre taxones (Fig. 1), y los grupos monofiléticos resultantes (en los que todas las secuencias tenían una identidad ≥90%) se utilizaron como nuestras unidades taxonómicas operativas. Los grupos que compartían menos del 90% de identidad con una secuencia conocida se etiquetaron secuencialmente como PREDICT_CoV-1, -2, -3, etc., mientras que los grupos que compartían ≥90% de identidad con una secuencia que ya estaba en GenBank se consideraron cepas de un virus conocido y se asignaron el mismo nombre que la secuencia coincidente (por ejemplo, Kenya_bat_CoV_KY33 o HKU-9). Las secuencias que compartían & gt90% de identidad pero que se encontraron en diferentes hospedadores se consideraron parte de la misma unidad taxonómica. Con base en estos criterios, se identificaron 100 taxones virales discretos, noventa y uno de los cuales se encontraron en murciélagos (Tabla 1, Fig. 2). Es importante destacar que no hacemos afirmaciones de que estos grupos correspondan a "especies", ya que para eso se requerirían secuencias de replicasa orf1ab completas (King et al. 2012). En su lugar, aclaramos que estamos utilizando estos fragmentos parciales para agrupar secuencias en "unidades taxonómicas operativas" (análoga a la agrupación de OTU en la investigación de microbiomas). También enfatizamos que nuestro punto de corte se determinó en base a dos regiones discretas dentro del orf1ab separadas por & gt3.000 nucleótidos, y que estas regiones corresponden a péptidos únicos después de la escisión traduccional.

Histograma de la frecuencia relativa de identidades de secuencia por pares utilizado para definir el límite entre unidades taxonómicas operativas para todas las secuencias de CoV detectadas. Se observó una distribución bimodal y se utilizó un límite de identidad de secuencia del 90% para separar las secuencias de los ensayos de Watanabe (Panel A) y Quan (Panel B) en taxones virales discretos.

Histograma de la frecuencia relativa de identidades de secuencia por pares utilizado para definir el límite entre unidades taxonómicas operativas para todas las secuencias de CoV detectadas. Se observó una distribución bimodal y se utilizó un límite de identidad de secuencia del 90% para separar las secuencias de los ensayos de Watanabe (Panel A) y Quan (Panel B) en taxones virales discretos.

Reconstrucciones filogenéticas de máxima verosimilitud para todos los fragmentos de CoV RdRp parciales para los ensayos de Quan (Panel A) y Watanabe (Panel B). Las secuencias se colapsan en clados, que representan nuestras unidades taxonómicas operativas (secuencias que comparten ≥90% de identidad) y el número de secuencias para cada taxón se indica entre paréntesis. Se han incluido secuencias representativas publicadas de GenBank para comparación (se indica el número de acceso de GenBank). Ambos árboles se enraizaron con el virus Breda relacionado (NC_007447) y todos los nodos tienen soporte de arranque ≥60%. Los gráficos circulares indican la distribución de taxones virales por familia de hospedadores (murciélagos), en cada subclado de virus.

Reconstrucciones filogenéticas de máxima probabilidad para todos los fragmentos de CoV RdRp parciales para los ensayos de Quan (Panel A) y Watanabe (Panel B). Las secuencias se colapsan en clados, que representan nuestras unidades taxonómicas operativas (secuencias que comparten ≥90% de identidad) y el número de secuencias para cada taxón se indica entre paréntesis. Se han incluido secuencias representativas publicadas de GenBank para comparación (se indica el número de acceso de GenBank). Ambos árboles se enraizaron con el virus Breda relacionado (NC_007447) y todos los nodos tienen soporte de arranque ≥60%. Los gráficos circulares indican la distribución de los taxones virales por familia de hospedadores (murciélagos), en cada subclado de virus.

Cabe destacar la detección de secuencias de CoV del subgrupo 2a en murciélagos, humanos y primates no humanos de cuatro países diferentes. Este subclado se considera en gran medida el subclado de roedores (Lau et al.2015 Wang et al.2015 Tsoleridis et al.2016), pero aquí detectamos secuencias correspondientes al virus conocido betacoronavirus-1 en Pteropus medius de Bangladesh, Pteropus alecto de Indonesia y de humanos en China, y secuencias correspondientes al coronavirus murino en primates no humanos de Nepal (estas secuencias fueron detectadas por cuatro laboratorios diferentes y no se procesaron muestras de roedores al mismo tiempo) (Fig. 2). Además, informamos el descubrimiento de varios grupos de secuencias de CoV subclados 2b y 2c (los subclados SARS y MERS, respectivamente) (Fig.2), y la detección de secuencias similares al coronavirus humano 229E en murciélagos hipoideros y rhinolophus. muestreados en la República de China, Uganda, Camerún y Gabón, apoyando las sugerencias anteriores de que 229E tiene orígenes zoonóticos (Pfefferle et al. 2009 Hu et al. 2015). Finalmente, destacamos la detección de secuencias similares al virus de la bronquitis infecciosa (IBV) asociadas a las aves en murciélagos y un virus estrechamente relacionado (PREDICT_CoV-49) en primates no humanos de Bangladesh, así como el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV) en murciélagos (Fig.2). Nuevamente, confirmamos que no se procesaron muestras de ganado en ninguno de estos laboratorios que pudieran haber actuado como fuente de contaminación.

3.2 Factores que impulsan la diversidad viral

La α-diversidad viral (el 'número efectivo' de especies) se correlacionó significativamente con la α-diversidad de murciélagos (tau = 0.325, PAG = 0.022) (Fig.3), lo que sugiere que se encontrarán más virus en regiones donde la diversidad de murciélagos es mayor. Esta asociación se mantuvo cuando se utilizó la riqueza viral, en lugar del número efectivo de especies, como índice de diversidad (tau = 0.421, PAG & lt 0,001). La diversidad β viral y de murciélago también se correlacionó significativamente (prueba de Mantel rho = 0.575, PAG & lt 0,001). En ambos casos, la diversidad se diferenciaba casi por completo en tres comunidades discretas por región (Fig. 3). Solo África y Asia compartieron grupos de secuencias virales (PREDICT_CoV-35 y HKU9 Fig. 4), lo que demuestra que los murciélagos han tenido una fuerte influencia biogeográfica en la ecología global y la evolución de los CoV.

Comparación de la diversidad viral y de murciélagos. La superficie de la tierra se dividió en celdas de cuadrícula por latitud y longitud (unidades de 10 × 10 grados) para los cálculos de diversidad (Panel A). Las celdas de la cuadrícula donde se muestrearon los murciélagos están numeradas en cada región. La diversidad alfa (Shannon H) para el virus (Panel B) y el hospedador (Panel C) se correlacionaron, lo que indica que las áreas de alta diversidad de murciélagos también tienen una alta diversidad viral. Las células más oscuras indican una mayor diversidad alfa (es decir, más taxones virales o hospedadores) en cada celda de la cuadrícula. La diversidad beta también se correlacionó entre el virus (Panel D) y el hospedador (Panel E), y se diferenciaron en tres comunidades discretas por región: América Latina (celdas de la cuadrícula 1-10), África (celdas de la cuadrícula 11-20) y Asia (cuadrícula celdas 21 a 34). El sombreado indica que los virus (en rojo) o los huéspedes (en azul) se comparten entre dos celdas de cuadrícula correspondientes, y las celdas más oscuras indican una mayor similitud por pares.

Comparación de la diversidad viral y de murciélagos. La superficie de la tierra se dividió en celdas de cuadrícula por latitud y longitud (unidades de 10 × 10 grados) para los cálculos de diversidad (Panel A). Las celdas de la cuadrícula donde se muestrearon los murciélagos están numeradas en cada región. La diversidad alfa (Shannon H) para el virus (Panel B) y el hospedador (Panel C) se correlacionaron, lo que indica que las áreas de alta diversidad de murciélagos también tienen una alta diversidad viral. Las células más oscuras indican una mayor diversidad alfa (es decir, más taxones virales o hospedadores) en cada celda de la cuadrícula. La diversidad beta también se correlacionó entre el virus (Panel D) y el hospedador (Panel E), y se diferenciaron en tres comunidades discretas por región: América Latina (celdas de la cuadrícula 1-10), África (celdas de la cuadrícula 11-20) y Asia (cuadrícula celdas 21 a 34). El sombreado indica que los virus (en rojo) o los huéspedes (en azul) se comparten entre dos celdas de cuadrícula correspondientes, y las celdas más oscuras indican una mayor similitud por pares.

Modelo de red que muestra la conexión de los CoV y sus hosts. Los grupos de secuencias virales (de color gris) están conectados a las especies hospedadoras, ya sea por región (Panel A) o por familia (Panel B). El virus, el huésped y las comunidades se separan casi en su totalidad por región, solo África y Asia están conectadas por dos virus compartidos (HKU9 y PREDICT_CoV-35) que se encuentran en especies de ambos continentes. Las redes también muestran que los virus parecen ser compartidos por múltiples familias anfitrionas en África y Asia, mientras que están más restringidos a una sola familia en América Latina.

Modelo de red que muestra la conexión de los CoV y sus hosts. Los grupos de secuencias virales (de color gris) están conectados a las especies hospedadoras, ya sea por región (Panel A) o por familia (Panel B). El virus, el huésped y las comunidades se separan casi en su totalidad por región, solo África y Asia están conectadas por dos virus compartidos (HKU9 y PREDICT_CoV-35) que se encuentran en especies de ambos continentes. Las redes también muestran que los virus parecen ser compartidos por múltiples familias anfitrionas en África y Asia, mientras que están más restringidos a una sola familia en América Latina.

El análisis de reconciliación cofilogenética se utilizó para investigar los mecanismos evolutivos que impulsan las asociaciones virus-hospedador observadas, por ejemplo, cambio de hospedador, intercambio viral o co-especiación (ver "Métodos"). En general, el cambio de anfitrión fue el mecanismo dominante, seguido de la co-especiación (Fig. 5). Cuando se analiza por región, el cambio de hospedador (transmisión entre géneros) siguió siendo dominante en África y Asia, pero no en América Latina. A pesar de menos eventos de cambio de anfitrión en América Latina, hubo un aumento concomitante en el intercambio de virus (transmisión intragénero). Esto sugiere que los virus todavía están cambiando de hospedador en América Latina, pero se mueven preferentemente entre especies estrechamente relacionadas, mientras que en África y Asia los virus se cruzan entre especies más distantes. Para evaluar la sensibilidad de nuestros resultados a nuestro método elegido (es decir, el uso de un esquema de costos predefinido en el programa Jane), repetimos el análisis para las reconstrucciones de Quan alfa-CoV y beta-CoV utilizando CoRePA, un enfoque adaptativo de parámetros que estima un esquema de costos apropiado sin ninguna asignación de valor previa. Al comparar los resultados, observamos un 91% de acuerdo entre Jane y CoRePA en la reconstrucción alfa-CoV (treinta y cuatro eventos, de los cuales treinta y uno estuvieron de acuerdo) y un 100% de acuerdo en las reconstrucciones beta-CoV (veintiséis eventos, todos que estuvo de acuerdo). Además, observamos que el esquema de costos calculado en CoRePA fue 0,7 para el cambio de host y 0,1 para la co-especiación, lo que respalda el esquema de costos predeterminado utilizado en Jane (es decir, que el cambio de host debe considerarse más "costoso" que la co-especiación).

Proporción relativa de eventos evolutivos que conducen a virus observados: asociaciones de hospedadores para CoV en murciélagos. Se utilizaron reconstrucciones cofilogenéticas para identificar cada evento (Fig. Complementaria S1: Paneles A – D) y se evaluó la significación por región. En todas las regiones, el cambio de host fue el evento evolutivo dominante (Panel A). Cuando se separaron por región, el cambio de host siguió siendo dominante en África (Panel B) y Asia (Panel C), pero no en América Latina (Panel D).

Proporción relativa de eventos evolutivos que conducen a virus observados: asociaciones de hospedadores para CoV en murciélagos. Se utilizaron reconstrucciones cofilogenéticas para identificar cada evento (Fig. Complementaria S1: Paneles A – D) y se evaluó la significación por región. En todas las regiones, el cambio de host fue el evento evolutivo dominante (Panel A). Cuando se separaron por región, el cambio de host siguió siendo dominante en África (Panel B) y Asia (Panel C), pero no en América Latina (Panel D).

Un modelo de red bipartita que conecta los grupos de secuencias virales con sus anfitriones respalda estos resultados, lo que ilustra que los CoV de murciélago estaban conectados a varias familias anfitrionas en África y Asia, mientras que estaban restringidos en gran medida a una sola familia de murciélagos en América Latina (Fig.4, Panel B). Además, el cambio de host fue casi cuatro veces más probable que el intercambio de virus en África, en comparación con América Latina (OR: 3.858 PAG = 0,040). Los CoV en Asia también fueron más propensos a cambiar de anfitrión que a compartir en comparación con América Latina, sin embargo, los resultados no fueron significativos (OR: 2.474 PAG = 0,143). Ninguna familia de murciélagos en particular se asoció con un mayor cambio de hospedador, pero esto puede reflejar tamaños de muestra pequeños cuando los datos se resumen por familia.

3.3 Número estimado de CoV en murciélagos

Un gran número de especies hospedadoras (murciélagos) en nuestro estudio fueron negativas para CoV (n = 197), sin embargo, ninguna de estas especies fue muestreada extensamente (Fig. 6). Encontramos que todas las especies con tamaños de muestra & gt110 individuos fueron positivas para uno o más CoV, lo que sugiere que habríamos detectado CoV en algunas de las especies negativas en nuestro estudio si el esfuerzo de muestreo hubiera aumentado. Debido al elevado número de estas especies negativas y su efecto sobre el número medio de agrupaciones de secuencias de virus por especie, se excluyeron de nuestras estimaciones. Al retener solo aquellas especies para las que se muestrearon & gt110 individuos (había veintisiete especies que calificaron), estimamos que el número promedio de CoV por especie es 2.67 (std = 1.38), lo que representa el escenario probable de que algunas especies tienen más virus y otros menos. Luego extrapolamos el promedio a las 1.200 especies de murciélagos para estimar una riqueza potencial total de 3.204 CoV (rango = 1.200-6.000 CoV), la mayoría de los cuales aún no se han descrito.

Relación entre el esfuerzo de muestreo y la detección viral entre todas las especies de murciélagos muestreadas. Se utilizó un modelo de regresión de Poisson para estimar el número esperado de virus en función del número de animales muestreados, por especie (cada círculo indica una especie separada). Se indican los intervalos de confianza del 95%.

Relación entre el esfuerzo de muestreo y la detección viral entre todas las especies de murciélagos muestreadas. Se utilizó un modelo de regresión de Poisson para estimar el número esperado de virus en función del número de animales muestreados, por especie (cada círculo indica una especie separada). Se indican los intervalos de confianza del 95%.

3.4 Factores que predicen la positividad de CoV

Con el fin de refinar los esfuerzos de vigilancia futuros para encontrar la diversidad no descubierta de CoV en murciélagos, evaluamos los factores que predicen la positividad de CoV. Para cada región, el mejor modelo incluyó el tipo de espécimen, la familia de murciélagos (o en el caso de América Latina, subfamilia), la estación y la interfaz animal-humano (Tabla 2). La temporada no se incluyó en el modelo superior para América Latina, pero el modelo con la temporada incluida estaba dentro de dos AIC (delta AIC = 1.06) y, por lo tanto, se consideró que tenía tanto apoyo como el modelo superior (Burnham y Anderson 2002). El tipo de muestra estuvo altamente asociado con la positividad de CoV, y las muestras que contenían heces o frotis fecales tuvieron una probabilidad significativamente mayor de dar positivo que otros tipos de muestras en todas las regiones. La familia de los murciélagos fue importante en Asia y África. La temporada también fue significativa, ya que las muestras recolectadas durante la estación seca tienen más probabilidades de dar positivo en África y Asia que las recolectadas durante la estación húmeda (aunque con tasas de probabilidad bajas). La clase de edad parece ser importante, ya que los subadultos tenían más probabilidades de dar positivo en la prueba que los adultos en África y Asia. El sexo no se relacionó con la positividad de CoV en Asia o América Latina, mientras que los hombres tenían un poco más de probabilidad de ser positivos a CoV en África (OR = 1,5, 1,2–1,9 IC, PAG & lt 0,001). Las categorías amplias de interfaces animal-humano se asociaron significativamente con la positividad de CoV entre los murciélagos en las tres regiones: en África y América Latina, los murciélagos muestreados en la categoría de interfaz de uso animal tenían más probabilidades de ser positivos, y en Asia, los murciélagos muestreados en el animal Las interfaces de uso y actividades humanas tenían más probabilidades de ser positivas que las muestreadas en otras interfaces. La importancia de la interfaz animal en las tres regiones sugiere que las prácticas relacionadas con el uso de animales pueden ser importantes para la transmisión de enfermedades.

Variables asociadas con pruebas de murciélago positivas para coronavirus en África, Asia y América Latina. Los conjuntos de datos regionales para cada modelo de regresión logística consistieron en especies de murciélagos donde se probaron más de cincuenta murciélagos. Los conjuntos de datos de edad eran un subconjunto de los conjuntos de datos regionales, ya que la clase de edad no se determinó para todos los individuos. Los números en negrita son estadísticamente significativos para PAG & lt 0,05.

. . . Razón de probabilidades. PAG . Intervalos de confianza del 95%.
África
Tipo de ejemplo Más bajo Superior
Heces / hisopo rectal 350.98& lt0.001146.64840.07
Hisopo oral / nasal 5.05& lt0.0012.0312.54
Hisopo oral / rectal 30.98& lt0.00113.4671.30
Sangre 1.65 0.540 0.33 8.09
Tejido 1.00
Familia anfitriona
Hipposideridae 1.22 0.559 0.62 2.41
Pteropodidae 3.84 & lt0.0012.276.49
Molossidae 1.00
Temporada
Seco 2.42 & lt0.0011.793.25
Mojado 1.00
Interfaz
Uso animal 1.98 0.0011.352.91
Área prístina 1.39 0.624 0.37 5.29
Uso del suelo 1.66 0.219 0.74 3.74
Actividad humana 1.00
La edad
Subadulto 5.91& lt0.0014.288.17
Adulto 1.00
Asia
Tipo de ejemplo
Heces / hisopo rectal 62.80& lt0.00115.44255.49
Hisopo oral / nasal 13.25& lt0.0013.1156.38
Hisopo de orina / urogenital 46.92& lt0.00110.85202.80
Guano 22.12& lt0.0013.66133.56
Tejido, hisopo oral / rectal 1.00
Familia anfitriona
Emballonuridae 0.31 0.26 0.04 2.37
Miniopteridae 9.78& lt0.0015.6916.81
Pteropodidae 2.16& lt0.0011.293.62
Rhinolophidae 1.08 0.82 0.57 2.03
Vespertilionidae 3.67& lt0.0012.186.18
Hipposideridae 1.00
Temporada
Seco 1.490.031.032.16
Mojado 1.00
Interfaz
Uso animal 3.300.011.298.40
Actividad humana 3.480.011.368.95
Área prístina 1.81 0.35 0.52 6.35
Uso del suelo 1.00
La edad
Subadulto 1.840.001.262.67
Adulto 1.00
America latina
Tipo de ejemplo
Heces / hisopo rectal 15.660.0005.0248.79
Hisopo oral / rectal 27.860.0006.86113.22
Hisopo oral / nasal 1.00
Subfamilia anfitriona
Carolliinae 6.95 0.06 0.90 53.76
Stenodermatinae 5.04 0.12 0.67 37.89
Glossophaginae 1.00
Interfaz
Uso animal 5.250.011.4818.65
Actividad humana 2.73 0.12 0.77 9.69
Uso del suelo 4.22 0.10 0.78 22.95
Área prístina 1.00
Temporada
Seco 1.30 0.52 0.58 2.89
Mojado 1.00
La edad
Subadulto 1.73 0.15 0.83 3.62
Adulto 1.00
. . . Razón de probabilidades. PAG . Intervalos de confianza del 95%.
África
Tipo de ejemplo Más bajo Superior
Heces / hisopo rectal 350.98& lt0.001146.64840.07
Hisopo oral / nasal 5.05& lt0.0012.0312.54
Hisopo oral / rectal 30.98& lt0.00113.4671.30
Sangre 1.65 0.540 0.33 8.09
Tejido 1.00
Familia anfitriona
Hipposideridae 1.22 0.559 0.62 2.41
Pteropodidae 3.84 & lt0.0012.276.49
Molossidae 1.00
Temporada
Seco 2.42 & lt0.0011.793.25
Mojado 1.00
Interfaz
Uso animal 1.98 0.0011.352.91
Área prístina 1.39 0.624 0.37 5.29
Uso del suelo 1.66 0.219 0.74 3.74
Actividad humana 1.00
La edad
Subadulto 5.91& lt0.0014.288.17
Adulto 1.00
Asia
Tipo de ejemplo
Heces / hisopo rectal 62.80& lt0.00115.44255.49
Hisopo oral / nasal 13.25& lt0.0013.1156.38
Hisopo de orina / urogenital 46.92& lt0.00110.85202.80
Guano 22.12& lt0.0013.66133.56
Tejido, hisopo oral / rectal 1.00
Familia anfitriona
Emballonuridae 0.31 0.26 0.04 2.37
Miniopteridae 9.78& lt0.0015.6916.81
Pteropodidae 2.16& lt0.0011.293.62
Rhinolophidae 1.08 0.82 0.57 2.03
Vespertilionidae 3.67& lt0.0012.186.18
Hipposideridae 1.00
Temporada
Seco 1.490.031.032.16
Mojado 1.00
Interfaz
Uso animal 3.300.011.298.40
Actividad humana 3.480.011.368.95
Área prístina 1.81 0.35 0.52 6.35
Uso del suelo 1.00
La edad
Subadulto 1.840.001.262.67
Adulto 1.00
America latina
Tipo de ejemplo
Heces / hisopo rectal 15.660.0005.0248.79
Hisopo oral / rectal 27.860.0006.86113.22
Hisopo oral / nasal 1.00
Subfamilia anfitriona
Carolliinae 6.95 0.06 0.90 53.76
Stenodermatinae 5.04 0.12 0.67 37.89
Glossophaginae 1.00
Interfaz
Uso animal 5.250.011.4818.65
Actividad humana 2.73 0.12 0.77 9.69
Uso del suelo 4.22 0.10 0.78 22.95
Área prístina 1.00
Temporada
Seco 1.30 0.52 0.58 2.89
Mojado 1.00
La edad
Subadulto 1.73 0.15 0.83 3.62
Adulto 1.00

Variables asociadas con pruebas de murciélago positivas para coronavirus en África, Asia y América Latina. Los conjuntos de datos regionales para cada modelo de regresión logística consistieron en especies de murciélagos donde se probaron más de cincuenta murciélagos. Los conjuntos de datos de edad eran un subconjunto de los conjuntos de datos regionales, ya que la clase de edad no se determinó para todos los individuos. Los números en negrita son estadísticamente significativos para PAG & lt 0,05.

. . . Razón de probabilidades. PAG . Intervalos de confianza del 95%.
África
Tipo de ejemplo Más bajo Superior
Heces / hisopo rectal 350.98& lt0.001146.64840.07
Hisopo oral / nasal 5.05& lt0.0012.0312.54
Hisopo oral / rectal 30.98& lt0.00113.4671.30
Sangre 1.65 0.540 0.33 8.09
Tejido 1.00
Familia anfitriona
Hipposideridae 1.22 0.559 0.62 2.41
Pteropodidae 3.84 & lt0.0012.276.49
Molossidae 1.00
Temporada
Seco 2.42 & lt0.0011.793.25
Mojado 1.00
Interfaz
Uso animal 1.98 0.0011.352.91
Área prístina 1.39 0.624 0.37 5.29
Uso del suelo 1.66 0.219 0.74 3.74
Actividad humana 1.00
La edad
Subadulto 5.91& lt0.0014.288.17
Adulto 1.00
Asia
Tipo de ejemplo
Heces / hisopo rectal 62.80& lt0.00115.44255.49
Hisopo oral / nasal 13.25& lt0.0013.1156.38
Hisopo de orina / urogenital 46.92& lt0.00110.85202.80
Guano 22.12& lt0.0013.66133.56
Tejido, hisopo oral / rectal 1.00
Familia anfitriona
Emballonuridae 0.31 0.26 0.04 2.37
Miniopteridae 9.78& lt0.0015.6916.81
Pteropodidae 2.16& lt0.0011.293.62
Rhinolophidae 1.08 0.82 0.57 2.03
Vespertilionidae 3.67& lt0.0012.186.18
Hipposideridae 1.00
Temporada
Seco 1.490.031.032.16
Mojado 1.00
Interfaz
Uso animal 3.300.011.298.40
Actividad humana 3.480.011.368.95
Área prístina 1.81 0.35 0.52 6.35
Uso del suelo 1.00
La edad
Subadulto 1.840.001.262.67
Adulto 1.00
America latina
Tipo de ejemplo
Heces / hisopo rectal 15.660.0005.0248.79
Hisopo oral / rectal 27.860.0006.86113.22
Hisopo oral / nasal 1.00
Subfamilia anfitriona
Carolliinae 6.95 0.06 0.90 53.76
Stenodermatinae 5.04 0.12 0.67 37.89
Glossophaginae 1.00
Interfaz
Uso animal 5.250.011.4818.65
Actividad humana 2.73 0.12 0.77 9.69
Uso del suelo 4.22 0.10 0.78 22.95
Área prístina 1.00
Temporada
Seco 1.30 0.52 0.58 2.89
Mojado 1.00
La edad
Subadulto 1.73 0.15 0.83 3.62
Adulto 1.00
. . . Razón de probabilidades. PAG . Intervalos de confianza del 95%.
África
Tipo de ejemplo Más bajo Superior
Heces / hisopo rectal 350.98& lt0.001146.64840.07
Hisopo oral / nasal 5.05& lt0.0012.0312.54
Hisopo oral / rectal 30.98& lt0.00113.4671.30
Sangre 1.65 0.540 0.33 8.09
Tejido 1.00
Familia anfitriona
Hipposideridae 1.22 0.559 0.62 2.41
Pteropodidae 3.84 & lt0.0012.276.49
Molossidae 1.00
Temporada
Seco 2.42 & lt0.0011.793.25
Mojado 1.00
Interfaz
Uso animal 1.98 0.0011.352.91
Área prístina 1.39 0.624 0.37 5.29
Uso del suelo 1.66 0.219 0.74 3.74
Actividad humana 1.00
La edad
Subadulto 5.91& lt0.0014.288.17
Adulto 1.00
Asia
Tipo de ejemplo
Heces / hisopo rectal 62.80& lt0.00115.44255.49
Hisopo oral / nasal 13.25& lt0.0013.1156.38
Hisopo de orina / urogenital 46.92& lt0.00110.85202.80
Guano 22.12& lt0.0013.66133.56
Tejido, hisopo oral / rectal 1.00
Familia anfitriona
Emballonuridae 0.31 0.26 0.04 2.37
Miniopteridae 9.78& lt0.0015.6916.81
Pteropodidae 2.16& lt0.0011.293.62
Rhinolophidae 1.08 0.82 0.57 2.03
Vespertilionidae 3.67& lt0.0012.186.18
Hipposideridae 1.00
Temporada
Seco 1.490.031.032.16
Mojado 1.00
Interfaz
Uso animal 3.300.011.298.40
Actividad humana 3.480.011.368.95
Área prístina 1.81 0.35 0.52 6.35
Uso del suelo 1.00
La edad
Subadulto 1.840.001.262.67
Adulto 1.00
America latina
Tipo de ejemplo
Heces / hisopo rectal 15.660.0005.0248.79
Hisopo oral / rectal 27.860.0006.86113.22
Hisopo oral / nasal 1.00
Subfamilia anfitriona
Carolliinae 6.95 0.06 0.90 53.76
Stenodermatinae 5.04 0.12 0.67 37.89
Glossophaginae 1.00
Interfaz
Uso animal 5.250.011.4818.65
Actividad humana 2.73 0.12 0.77 9.69
Uso del suelo 4.22 0.10 0.78 22.95
Área prístina 1.00
Temporada
Seco 1.30 0.52 0.58 2.89
Mojado 1.00
La edad
Subadulto 1.73 0.15 0.83 3.62
Adulto 1.00

3.5 Esfuerzo de muestreo futuro

Con base en nuestro estudio, pudimos estimar el esfuerzo de muestreo que se requeriría para encontrar todos los CoV en murciélagos, con base en un modelo de regresión de Poisson de nuestros datos (Fig. 6). Con 154 individuos, estimamos que se detectará un promedio de un CoV (95% CI 136-177). Con 397 individuos, estimamos que se detectarán hasta cinco CoV (95% CI 351–458). Como no observamos ninguna especie con más de cinco grupos de secuencias virales, asumimos que el muestreo de 397 individuos debería capturar la diversidad completa de CoV en cada especie de murciélago.

3.6 Predecir la distribución de CoV desconocidos

El subclado viral y la familia anfitriona no eran independientes entre sí (χ 2 por clado = PAG & lt 0.001 Tabla complementaria S1), lo que demuestra que diferentes clados tienen asociaciones significativas con familias específicas de murciélagos. Por ejemplo, los CoV del subgrupo 2d se asociaron significativamente con los murciélagos pteropid y solo se identificaron en las regiones donde existen los murciélagos pteropid. Asimismo, los CoV del subgrupo 2b se asociaron con murciélagos rinolophid e hipposiderid y 2c con murciélagos vespertilionid. Para "predecir" la distribución potencial de CoV desconocidos, trazamos la distribución conocida de murciélagos pertenecientes a estas familias y asumimos que los "puntos calientes" de diversidad de murciélagos infieren puntos calientes de diversidad viral para cada subclado (Fig. 7). Observamos que el género alphaCoV ha sido considerado como un grupo, ya que no se resuelven bien en subclados (de Groot et al. 2009), y que no se generó un mapa 2a dado que solo se identificó un virus de murciélago de este clado. .

Mapas de "puntos calientes" de diversidad viral. El panel A muestra los puntos críticos potenciales para los CoV basados ​​en la distribución de murciélagos en todo el mundo. La ubicación de las secuencias alfa CoV de este estudio se muestra en negro y las secuencias beta CoV en azul, lo que indica que no existe un sesgo geográfico basado en el género viral (es decir, es igualmente probable que se encuentren alfa y beta CoV en todas las regiones). Algunos subclados virales se asociaron con familias particulares de murciélagos, y los datos de distribución espacial de todas las especies que pertenecen a estas familias se trazaron para indicar los puntos críticos potenciales de diversidad viral (riqueza) para estos subclados. El panel B indica la distribución potencial de 2b CoV según la distribución de murciélagos rhinolphus e hipposideros. Las ubicaciones de los animales positivos para 2b identificados en este estudio se indican en negro y se correlacionan con áreas de alta riqueza de especies (para estas familias). Los animales CoV positivos para otros subclados se muestran en azul claro. El panel C indica la distribución potencial de 2c CoV según la distribución de murciélagos vespertiliónidos. Las ubicaciones de los animales positivos para 2c identificados en este estudio se indican en negro. Este mapa sugiere que hay puntos críticos de diversidad 2c en regiones no cubiertas en este estudio (por ejemplo, Europa). El panel D indica la distribución potencial de virus 2d basada en la distribución de murciélagos pteropid. El mapa sugiere que estos virus pueden tener una distribución más limitada, en comparación con los virus de otros subclados. Las ubicaciones de los animales 2d positivos identificados en este estudio se muestran en negro.

Mapas de "puntos calientes" de diversidad viral. El panel A muestra los puntos críticos potenciales para CoVs basados ​​en la distribución de murciélagos en todo el mundo. La ubicación de las secuencias alfa CoV de este estudio se muestra en negro y las secuencias beta CoV en azul, lo que indica que no existe un sesgo geográfico basado en el género viral (es decir, es igualmente probable que se encuentren alfa y beta CoV en todas las regiones). Algunos subclados virales se asociaron con familias particulares de murciélagos, y los datos de distribución espacial de todas las especies que pertenecen a estas familias se trazaron para indicar los puntos críticos potenciales de diversidad viral (riqueza) para estos subclados. El panel B indica la distribución potencial de 2b CoV según la distribución de murciélagos rhinolphus e hipposideros. Las ubicaciones de los animales positivos para 2b identificados en este estudio se indican en negro y se correlacionan con áreas de alta riqueza de especies (para estas familias). Los animales CoV positivos para otros subclados se muestran en azul claro. El panel C indica la distribución potencial de 2c CoV según la distribución de murciélagos vespertiliónidos. Las ubicaciones de los animales positivos para 2c identificados en este estudio se indican en negro. Este mapa sugiere que hay puntos críticos de diversidad 2c en regiones no cubiertas en este estudio (por ejemplo, Europa). El panel D indica la distribución potencial de virus 2d basada en la distribución de murciélagos pteropid. El mapa sugiere que estos virus pueden tener una distribución más limitada, en comparación con los virus de otros subclados. Las ubicaciones de los animales 2d positivos identificados en este estudio se muestran en negro.


Sistema de modelos de Mendel

El guisante de jardín tiene varias características ventajosas que le permitieron a Mendel desarrollar las leyes de la genética moderna.

Objetivos de aprendizaje

Describir las razones científicas del éxito del trabajo experimental de Mendel.

Conclusiones clave

Puntos clave

  • Mendel usó plantas de reproducción verdadera en sus experimentos. Estas plantas, cuando se autofecundan, siempre producen descendencia con el mismo fenotipo.
  • Las plantas de guisantes se manipulan fácilmente, crecen en una temporada y se pueden cultivar en grandes cantidades. Estas cualidades permitieron a Mendel realizar análisis metódicos y cuantitativos utilizando muestras de gran tamaño.
  • Basado en sus experimentos con los guisantes de jardín, Mendel descubrió que un fenotipo siempre era dominante sobre otro fenotipo recesivo para el mismo rasgo.

Términos clave

  • fenotipo: las características observables de un organismo, que a menudo resultan de su información genética o de una combinación de información genética y factores ambientales.
  • genotipo: la información genética específica de una célula u organismo, generalmente una descripción del alelo o alelos relacionados con un gen específico.
  • planta de reproducción verdadera: una planta que siempre produce descendencia del mismo fenotipo cuando se autofecunda una que es homocigótica para el rasgo que se sigue.

Sistema modelo Mendel & # 8217s

El trabajo fundamental de Mendel & # 8217 se logró utilizando el guisante de jardín, Pisum sativum, para estudiar herencia. La reproducción de la planta de guisantes se manipula fácilmente. Se podrían cultivar simultáneamente grandes cantidades de guisantes, lo que permitió a Mendel concluir que sus resultados no se produjeron simplemente por casualidad. El guisante de jardín también crece hasta la madurez en una temporada, se podrían evaluar varias generaciones en un período de tiempo relativamente corto.

Las plantas de guisantes tienen partes masculinas y femeninas y se pueden cultivar fácilmente en grandes cantidades. Por esta razón, las plantas de guisantes de jardín pueden autopolinizarse o polinizarse de forma cruzada con otras plantas de guisantes. En ausencia de manipulación externa, esta especie se autofecunda naturalmente: los óvulos (los huevos) dentro de las flores individuales son fertilizados por polen (que contiene el espermatozoide) de la misma flor. Los espermatozoides y los óvulos que producen la próxima generación de plantas provienen del mismo padre. Además, los pétalos de las flores permanecen sellados herméticamente hasta después de la polinización, evitando la polinización de otras plantas. El resultado son plantas de guisantes altamente endogámicas, o & # 8220 verdaderas reproducciones & # 8221. Estas son plantas que siempre producen descendencia que se parece al padre. Hoy en día, sabemos que estas plantas & # 8220verdaderas & # 8221 son homocigotas para la mayoría de los rasgos.

Un jardinero o investigador, como Mendel, puede realizar una polinización cruzada de estas mismas plantas aplicando manualmente el esperma de una planta al pistilo (que contiene los óvulos) de otra planta. Ahora, los espermatozoides y los óvulos provienen de diferentes plantas parentales. Cuando Mendel realizó una polinización cruzada de una planta de reproducción verdadera que solo producía guisantes amarillos con una planta de reproducción verdadera que solo producía guisantes verdes, descubrió que la primera generación de descendientes siempre son todos los guisantes amarillos. El rasgo del guisante verde no apareció. Sin embargo, si a esta primera generación de plantas de guisantes amarillos se les permitía autopolinizarse, la siguiente o la segunda generación tenía una proporción de 3: 1 de guisantes amarillos a verdes.

En este y todos los demás rasgos de la planta de guisantes que siguió Mendel, una forma del rasgo era & # 8220dominante & # 8221 sobre otra, por lo que enmascaraba la presencia de la otra forma & # 8220recesiva & # 8221 en la primera generación después de cruzar dos plantas homocigotas. .. Incluso si el fenotipo (forma visible) está oculto, el genotipo (alelo que controla esa forma del rasgo) puede transmitirse a la siguiente generación y producir la forma recesiva en la segunda generación. Al experimentar con plantas de guisantes de verdadera reproducción, Mendel evitó la aparición de rasgos inesperados (recombinantes) en la descendencia que podrían ocurrir si las plantas no fueran de verdadera reproducción.

Experimentos Mendel & # 8217s con guisantes: Experimentando con miles de guisantes, Mendel descubrió los fundamentos de la genética.


Fuente y descripción de las cepas parentales.

FGSC4200 y FGSC2489 fueron un regalo de Tian Chaoguang, Instituto de Biotecnología Industrial de Tianjin, Academia de Ciencias de China, China. FGSC2225 fue un regalo de Li Shaojie, Laboratorio Estatal de Micología, Instituto de Microbiología, Academia de Ciencias de China, China. FGSC3246 y FGSC1363 se adquirieron en Fungal Genetics Stock Center, Departamento de Patología Vegetal, Universidad Estatal de Kansas, EE. UU.

Tanto FGSC 2489 como 4200 son cepas altamente endogámicas y se prefieren para su uso como tipos silvestres estándar [29]. FGSC 4200 es una progenie del sexto retrocruzamiento con FGSC 2489 (la cepa del genoma de referencia) de FGSC 2490. FGSC 2225 (Mauriceville-1cA, recolectada de Mauriceville, TX, EE.UU.) es una cepa aislada de la naturaleza [30]. La cepa FGSC 1363 es un mutante morfológico que comienza a crecer en agar como pequeñas colonias y tarde o temprano produce un brote de hifas de tipo salvaje (con o sin conidios) [31]. FGSC 3246 es un mutante estéril femenino [32]. A partir del perfil de SNP, no hay razón para suponer que sean hipermutadores [33]. El examen previo de RIP en la naturaleza solo identificó muy pocos aislados silvestres que suprimen de manera dominante RIP [34, 35], lo que sugiere propiedades similares de estas cepas de laboratorio para desencadenar RIP como en la naturaleza.

Disección cruzada y de ascosporas

Todos los cruces se aparearon y se incubaron en condiciones de laboratorio. Para evitar la contaminación, todos los medios de cultivo, así como las placas, se esterilizaron en autoclave a

121 ° C durante más de 25 min en un esterilizador de vapor de alta presión (TOMY SX-500) antes de cada experimento. Los procedimientos posteriores se llevaron a cabo en bancos limpios que habían sido esterilizados con luz ultravioleta inmediatamente antes del experimento. El medio de cultivo y los métodos experimentales utilizados en esta investigación se basaron en los protocolos ofrecidos por Fungal Genetics Stock Center (http://www.fgsc.net/). En resumen, se colocaron en placa micelio o ascosporas de dos cepas de apareamiento en el extremo opuesto de la placa de apareamiento. Si se utilizó una ascospora como progenitor de apareamiento, la espora se sometió a choque térmico a 60 ° C, 30 minutos antes de la siembra en placa. Las placas de cruce se incubaron a 25 ° C en un ambiente totalmente oscuro. Después de aproximadamente 3 semanas de crecimiento y cruzamiento, los asci se separaron y se recogieron en un medio de almacenamiento durante una semana. Se recogió un ascus en medio de agar y se incubó a 60 ° C, 30 min. Luego, el ascus se diseccionó bajo un microscopio. Cada ascospora que contenía se recogió una a una en su propio medio de crecimiento. Para el cruce G, se aislaron dos ascosporas con tipos de apareamiento opuestos del cruce C y se colocaron en la misma placa de cruce, que había sufrido una ronda de reproducción sexual (Fig. 1a). Las dos esporas para la propagación asexual se originaron a partir de dos ascosporas del cruce de FGSC2225 y FGSC4200.

Extracción de ADN y resecuenciación del genoma completo

Cada una de las ascosporas diseccionadas se cultivó individualmente en su propia placa durante aproximadamente 3 días para permitir la extracción de 3 microgramos o más de ADN. El ADN se extrajo mediante el método de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico [36]. La muestra de ADN de cada cultivo se extrajo y se volvió a secuenciar individualmente.

La resecuenciación del genoma completo se llevó a cabo en Novogene (www.novogene.com) con el mismo protocolo para todos, con 2 lecturas de extremos emparejados de 150 pb construidas por la plataforma Illumina HiSeq 4000. Doscientos setenta y tres norte. crassa las muestras (incluidas 5 cepas parentales y 67 tétradas) se secuenciaron en total. En promedio, cada espora fue secuenciada a una profundidad de

37 veces con 96% del genoma cubierto. Las cepas parentales se secuenciaron a una profundidad de

97% del genoma de referencia cubierto (archivo adicional 2: hoja de datos S1). Más del 92% del genoma de referencia podría estar cubierto por al menos cinco lecturas en cada muestra secuenciada, con una tasa de mapeo erróneo inferior al 1% (Archivo adicional 2: Hoja de datos S1).

Identificación de mutaciones

Para mantener la coherencia con las estimaciones anteriores de la tasa de mutación (en diferentes especies), y debido a que la llamada indel es propensa a los artefactos de análisis, restringimos el análisis a mutaciones puntuales. Las lecturas de resecuenciación se asignaron al genoma de referencia NC12 (https://www.broadinstitute.org/fungal-genome-initiative/neurospora-crassa-genome-project) utilizando el alineador BWA [37]. Las variantes fueron llamadas por HaplotypeCaller de Genome Analysis Toolkit (GATK) [38]. Las variantes sin procesar se filtraron eliminando las que no se denominaron "homocigotas" o con una puntuación de calidad inferior a 30. Dada la naturaleza haploide de las muestras, todas las mutaciones nuevas deberían denominarse homocigotas.

Para ser consideradas mutaciones candidatas, necesitábamos más filtros. Los sitios variantes en las ascosporas descendientes debían ser (i) diferentes de sus progenitores y (ii) tener una profundidad de lectura de apoyo ≥ 5 tanto en las ascosporas originales como en las focales. Posteriormente, cada mutación candidata se inspeccionó manualmente para eliminar resultados ambiguos, incluidos (1) errores de secuenciación, especialmente en regiones de polímero (2) variantes que realmente existían en muestras parentales pero que no pudieron ser capturadas por llamadores de variantes y (3) artefactos de alineaciones espurias.

Aunque fuimos especialmente cautelosos durante cada paso de los experimentos, no podemos estar 100% seguros de que no haya contaminación presente en el ADN secuenciado. Sin embargo, observamos que la contaminación no debe confundir nuestra llamada de mutación por varias razones. Primero, si tienen la oportunidad de ser mapeados al genoma de referencia, los contaminantes generalmente darán falsas "llamadas variantes heterocigotas", pero todas las mutaciones que empleamos son homocigotas. Las "llamadas homocigotas" de la contaminación solo ocurrirían en la rara incidencia en la que el contaminante podría mapearse en regiones con grandes deleciones en la cepa secuenciada (es decir, el contaminante es más similar al genoma de referencia que la cepa secuenciada). En segundo lugar, los contaminantes suelen dar alineaciones falsas con extremos de lectura recortados, ya que tienden a no mapear bien en el genoma de referencia, descartándose dichas alineaciones durante la llamada a la mutación. En tercer lugar, se espera que los contaminantes se distribuyan aleatoriamente entre todas las muestras recolectadas, pero las mutaciones están segregadas en 2: 2 o 3: 1 y generalmente están presentes dentro de un solo ascus.

Estimamos la tasa de falsos positivos mediante la resecuenciación de Sanger. De 186 mutaciones elegidas al azar para la verificación de Sanger (archivo adicional 1: figura S6 y archivo adicional 2: hoja de datos S3), 14 no pudieron ser secuenciadas por Sanger: tres tenían secuenciación de Sanger ruidosa mientras que 11 amplificaron la secuencia incorrecta. En las 172 secuencias exitosas de Sanger, se verificaron todas las mutaciones. Suponemos, por tanto, una tasa cero de falsos positivos.

Los falsos negativos (FN) se estimaron utilizando dos enfoques. El primer enfoque utiliza un método de simulación similar al descrito anteriormente [39]. Se tomó una muestra de la distribución empírica de profundidad de lectura a partir de las mutaciones reales identificadas. Para cada cruce sexual, se generaron 5000 sitios de mutación sintéticos 2: 2 y 1000 sitios de mutación sintéticos 3: 1. Para cada línea asexual, se generaron 1000 sitios de mutación sintéticos. Las mutaciones sintéticas fueron detectadas por las mismas tuberías, y la proporción de mutaciones correctamente identificadas (tasas de 1 falso negativo (FNR)) se calculó como "mutaciones sintéticas identificadas" / "mutaciones sintéticas generadas" para cada ascus.Dado que los duplicados son más propensos a errores de mapeo que los no duplicados, este FNR se calculó por separado para tres regiones (denotadas como FNR regional de aquí en adelante), es decir, dentro de duplicados (definido por Dup-Blast), casi duplicados (400 pb en sentido ascendente y descendente de duplicados) y no duplicados (archivo adicional 2: hoja de datos S6).

El segundo enfoque se basa en los resultados de secuenciación de Sanger (archivo adicional 2: hoja de datos S3). La secuenciación de Sanger detecta 16 mutaciones que corresponden a sitios con una cobertura baja previa (& lt 5 lecturas). Esto sugiere una tasa de falsos negativos de 16 / (172 + 16) = 8.51%, aproximadamente de acuerdo con la simulación anterior en casi / no duplicados, pero menor que en duplicados.

Tomamos en cuenta la tasa de FNR al estimar las tasas de mutación. Primero normalizamos los números observados como "número de mutaciones identificadas" / (1- "FNR regional"), siendo FNR específico para cada ascus, FNR expresado como una fracción. La tasa de mutación por genoma para cada cruce se calculó como "número promedio de mutaciones normalizadas por ascus" / "2 progenitores de origen", y la tasa por pb se calculó como "tasa normalizada por genoma" / "tamaño del genoma de referencia". En promedio, se detectan 135,3 ± 21,4 (sem) mutaciones de sustitución de bases con una relación de segregación de 2: 2, equivalente a 3,34 × 10 −6 ± 5,29 × 10 −7 (sem) por sitio por generación sexual (Tabla 1).

Si bien mapeamos por referencia al genoma publicado, también examinamos los dominios genómicos con el doble de la cobertura de lectura esperada bajo el supuesto de que se trata de duplicaciones espontáneas recientes. Los supuestos duplicados espontáneos durante el ciclo sexual se identificaron primero mediante la búsqueda de duplicados 2x solo presentes en cada ascus pero no presentes en las cepas parentales y con una proporción de 2: 2. Luego se aplicó otro enfoque, DELLY [40], que integra análisis de lectura dividida y de extremo emparejado, para confirmar los candidatos iniciales, y solo aquellos que DELLY pudieron confirmar se mantuvieron en los resultados finales. Estos parecen ser raros (no más del 1% de la secuencia, archivo adicional 2: hoja de datos S4).

Definición de secuencias duplicadas

Nuestro método predeterminado para definir secuencias duplicadas utiliza un criterio de más del 65% de identidad [19] y al menos 100 pb de secuencia alineable [6] (Archivo adicional 1: Figura S2, Tabla S3 y Archivo adicional 2: Hoja de datos S4). Este método para definir lo que constituye una región duplicada a los ojos de RIP parece ser eficiente, lo que significa que una alta fracción del porcentaje de mutaciones 2: 2 solicita el porcentaje de secuencia genómica identificada (Archivo adicional 1: Tabla S3).

Este se eligió como predeterminado ya que se desempeñó mejor. En total, investigamos cuatro posibles métodos de definición. Como se indicó anteriormente, los duplicados se pueden clasificar según la búsqueda de Blast (la identidad del 65% y la longitud alineable de 100 pb utilizada anteriormente), que denominamos el método Dup-Blast, o como regiones con una profundidad de secuenciación de 2 × en promedio (Dup-Depth), o como regiones que llevan alelos "heterocigotos" (una firma de mapeo erróneo, Dup-Het), o como regiones que siguen el período de coincidencia definido por Kleckner [6, 20] (Periodo Dup, un período de coincidencia de 10

12 se utilizaron aquí) (Archivo adicional 1: Tabla S3). Todos los demás métodos de forma aislada identifican un porcentaje más bajo de mutaciones al tiempo que describen una mayor proporción de secuencia genómica (archivo adicional 1: Figura S2 y Tabla S3). La fusión de todas estas firmas sugeriría que como máximo el 40% del genoma (16 Mb) podría estar "duplicado", mientras que el 60% restante no lo está. Sorprendentemente, la proporción de mutaciones 2: 2 va del 87,4% para Dup-Blast a solo el 92,3% en este 40%, lo que sugiere que el 16% del genoma denominado Dup-Blast captura de manera eficiente la proporción del genoma que RIP considera que es duplicado. Más específicamente, encontramos que aproximadamente el 32,7% de las mutaciones 2: 2 previamente definidas como mutaciones asociadas no duplicadas (es decir, no Dup-Blast) podrían asignarse a dominios Dup-Depth / Het / Period (archivo adicional 2: hoja de datos S2) .

Prueba de permutación para grupos de mutaciones

Un grupo de mutaciones se definió como tener al menos dos mutaciones dentro de 1 kb en un solo genoma haploide (archivo adicional 1: Figura S4). Como cada grupo de mutación, especialmente aquellos dentro de duplicados, generalmente solo consta exclusivamente de mutaciones C → T o exclusivamente G → A, lo más probable es que se generen a partir de una sola ronda de RIP. Para probar si el número de "mutaciones agrupadas" en duplicados era diferente de las distribuciones aleatorias, redistribuimos las mutaciones al azar dentro del 16% del genoma que está duplicado, eligiendo sitios G: C seleccionados al azar dentro de estos dominios en cada haploide genoma del mismo ascus. Para cada simulación, contamos el número de mutaciones que concuerdan con la definición de un clúster. los PAG El valor (tasa de error de tipo I esperada) se derivó de 10,000 aleatorizaciones como (norte + 1)/(metro + 1), donde norte es el número de observaciones con tantas o más mutaciones agrupadas que las observadas y metro es el número de aleatorización. Empleamos este método para preguntar si hay más grupos dentro de los dominios duplicados dadas las posiciones de los residuos G y C dentro de los dominios duplicados.

Como definimos los grupos basados ​​exclusivamente en las ubicaciones de las mutaciones observadas en el mismo genoma haploide, es posible que los grupos identificados en una espora se superpongan con los grupos identificados en una espora diferente. La extensión de la superposición de los grupos (archivo adicional 1: Figura S4) se probó barajando todos los grupos dentro de los duplicados entre tétradas utilizando el comando "shuffle" de BEDTools [41]. Se realizaron diez mil aleatorizaciones para obtener la PAG valor, como (norte + 1)/(metro + 1), donde norte es el número de observaciones con el mismo número o más mutaciones observadas en conglomerados superpuestos aleatorios que el observado en los conglomerados reales y metro es el número de aleatorizaciones. Las canalizaciones relacionadas están disponibles en https://github.com/wl13/Neurospora_mutation. Todas las pruebas estadísticas se realizaron en R [42].

Estimación de nortemi

Para la estimación del tamaño efectivo de la población, empleamos el compendio de heterocigosidad (π) medidas proporcionadas por Lynch et al. [1]. Empleamos su compendio de tasas de mutación (μ) además del nuestro. nortemi luego se definió como nortemi = π / μ D (1 - π), dónde D es el ajuste de ploidía (2 para especies haploides, 4 para diploides). Las tasas de mutación en CDS fueron estimadas directamente por nosotros para Neurospora (en lugar de extrapolarse de las tasas de mutación genómica escaladas a la proporción de secuencia que es CDS) pero por lo demás tomado de este compendio anterior. La tabla de datos revisada se presenta como Archivo adicional 1: Tabla S7.

Análisis de características de regiones duplicadas.

La información sobre las regiones centroméricas se obtuvo de Smith et al. [43]. Las longitudes, el contenido de GC y las mejores identidades de BLAST para diferentes regiones duplicadas (Dup-Blast) se resumen en el archivo adicional 1: Tabla S8. Para investigar si una determinada región se ha sometido a RIP, se aplicó el método del “índice RIP” [44] con un umbral de TpA / ApT & gt 2 o (CpA + TpG) / (ApC + GpT) & lt 0,7 [19]. Los datos de Hi-C de Galazka et al. [45] se utilizó para buscar regiones que interactúan después de diseccionar los genomas en ventanas de 10 kb (Archivo adicional 1: Tabla S9).


Ver el vídeo: Índice de diversidad de Simpson. Khan Academy en Español (Diciembre 2022).