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Tiempo requerido para la precipitación de ARN en etanol

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Precipité ARN bacteriano durante 1 hora a -80ºC después de agotar el ARNr con el kit Ribo-Zero.

¿Más tiempo conduce a mejores resultados?


Hasta donde yo sé, esto nunca se ha analizado a fondo para el ARN, pero hay un excelente artículo sobre la precipitación del ADN y las condiciones habituales en BRL Focus de Zeugin (ver más abajo el artículo). Dado que el ADN y el ARN son prácticamente iguales (excepto por un grupo OH) y las condiciones utilizadas para la precipitación también son similares, creo que podemos usar esto para una estimación muy cercana.

Curiosamente, ni el tiempo ni la temperatura de una precipitación tienen una gran influencia en el resultado: cambian el rendimiento solo en un pequeño porcentaje. Si observa la figura 2 del documento mencionado, verá lo siguiente:

Esta subfigura muestra que la recuperación casi no está influenciada por la temperatura, sino solo por la concentración del ADN (o ARN). Dependiendo de la cantidad de ARN que espere (cuántas células usó para el aislamiento), agregaría un agente de coprecipitación cuando solo tenga cantidades muy pequeñas de ARN. El glucógeno funciona muy bien aquí. De lo contrario, no me preocuparía.

Esta figura muestra que el tiempo de incubación solo influye en el porcentaje de recuperación cuando el tiempo es demasiado corto. Si incuba durante una hora, está seguro.

Referencia:


Como sugieren muchos kits, la concentración de ARN tiene la influencia más profunda en la eficiencia de precipitación / fracción de recuperación. El tiempo, la temperatura y la concentración del agente de precipitación tienen un efecto menor. Vea, por ejemplo, las instrucciones de Life Technologies sobre la precipitación de LiCl:

El uso de la precipitación de LiCl para la purificación de ARN


Purificación de ARNm (E2065)

El kit incluye una solución de LiCl para una rápida recuperación del ARNm sintetizado. La precipitación de ARN con LiCl es eficaz para eliminar la mayoría de los NTP y enzimas no incorporados. Sin embargo, los ARN de menos de 300 bases o en concentraciones inferiores a 0,1 mg / ml no precipitan bien. En tales casos, se pueden usar otros métodos de purificación. El ARNm purificado con LiCl es adecuado para experimentos de transfección y microinyección.

  1. A la reacción de transcripción de 20 & microl, agregue 30 & mul de agua y 25 & mul de solución de LiCl, mezcle bien.
  2. Incube a & ndash20 & degC durante 30 minutos.
  3. Centrifugar a 4 ° C durante 15 minutos a la velocidad máxima para sedimentar el ARN.
  4. Retire el sobrenadante con cuidado.
  5. Enjuague el sedimento agregando 500 μl de etanol frío al 70% y centrifugue a 4 ° C durante 10 minutos.
  6. Retire el etanol con cuidado. Gire el tubo brevemente para bajar cualquier líquido en la pared.
  7. Retire el líquido residual con cuidado con una punta afilada (por ejemplo, una punta de carga).
  8. Secar al aire el sedimento y resuspender el ARNm en 50 µl de EDTA 0,1 mM o una solución de almacenamiento de ARN adecuada.
  9. Caliente el ARN a 65 ° C durante 5-10 minutos para disolver completamente el ARN. Mezclar bien.
  10. Almacene el ARN a & ndash20 & degC o menos.

Extracción de fenol-cloroformo y precipitación de etanol

Para la eliminación de proteínas y la mayoría de los nucleótidos libres, el método preferido es la extracción con fenol: cloroformo y la precipitación con etanol de las transcripciones de ARN.

  1. Ajuste el volumen de reacción a 180 & mul agregando agua libre de nucleasas. Añada 20 µl de acetato de sodio 3 M, pH 5,2 o 20 µl de acetato de amonio 5 M y mezcle bien.
  2. Extraer con un volumen igual de una mezcla de fenol: cloroformo 1: 1, seguido de dos extracciones con cloroformo. Recoger la fase acuosa y transferir a un tubo nuevo.
  3. Precipite el ARN agregando 2 volúmenes de etanol. Incubar a & ndash20 & degC durante al menos 30 minutos y recoger el sedimento por centrifugación.
  4. Retire el sobrenadante y enjuague el sedimento con 500 µl de etanol al 70% helado.
  5. Resuspender el ARN en 50 & mul de EDTA 0,1 mM. Almacene el ARN a & ndash20 & degC o menos.

Doble aspiración

La doble aspiración es útil para eliminar las últimas trazas de sobrenadante de EtOH después de las precipitaciones. Implica un segundo centrifugado rápido y aspiración para asegurar la eliminación de cualquier sobrenadante de precipitación, p. en las paredes del tubo, que podrían interferir con los pasos posteriores del protocolo. Lo recomendamos en el protocolo RPA III ™ de Ambion y para la preparación de plantillas de sondas de ARN.

  • Después de sedimentar la precipitación, aspire el sobrenadante de precipitación del sedimento de ácido nucleico. Siga inmediatamente con una centrifugación rápida de 1 a 2 segundos y aspire de nuevo.


La aspiración se puede realizar con una aguja de jeringa o una pipeta Pasteur extraída conectada a una fuente de vacío con una trampa. Alternativamente, se puede utilizar una pipeta Pasteur extraída con un bulbo de pipeta. Para hacer pipetas Pasteur extendidas, ablande la punta de la pipeta con una llama y extráigala con unas pinzas, rompa la punta en el punto más estrecho y pula a la llama si es necesario.


Procedimientos experimentales

Antecedentes teóricos

La fuente de contaminación por RNasas durante la extracción de ARN puede ser exógena o endógena 5-7. Las fuentes exógenas incluyen los reactivos, el material de vidrio y el material de plástico utilizados en el aislamiento del ARN, especialmente la piel del investigador. Sin embargo, estas ARNasas pueden eliminarse mediante medidas sensibles, como el tratamiento de reactivos y utensilios plásticos con pirocarbonato de dietilo (DEPC) horneando la cristalería, mortero y mano de mortero y el uso de guantes desechables durante todo el procedimiento. Sin embargo, las RNasas endógenas son innatas a los tejidos biológicos y normalmente se encuentran secuestradas en orgánulos y vacuolas. Están altamente regulados en células intactas y los mecanismos reguladores se destruyen una vez que los orgánulos y vacuolas se rompen durante la lisis celular, lo que podría conducir a una rápida degradación del ARN 5. Por lo tanto, cómo inactivar rápida y completamente las ARNasas endógenas liberadas es la clave para una purificación exitosa de ARN de alta calidad. Se ha demostrado que las sales de guanidinio son potentes inhibidores de las RNasas 5, 7 y se han establecido muchos métodos basados ​​en sales de guanidinio para el aislamiento de ARN. Sin embargo, todavía existen algunos inconvenientes para estos métodos, como la pérdida o fragmentación de ARN durante la extracción orgánica, la interferencia de reacciones enzimáticas posteriores por el residuo de sal de guanidinio y un mayor costo para el experimento debido al uso de una mayor concentración de sales de guanidinio para inactivar RNasas 7. En nuestro método 6 de aislamiento de ARN informado anteriormente, intentamos inactivar rápida y completamente las ARNasas endógenas liberadas durante la lisis celular, así como superar algunos inconvenientes de los métodos basados ​​en sal de guanidinio. Nuestras medidas incluyeron modificar la composición del tampón de extracción: el pH del tampón de extracción no se ajustó con HCl, y el pH final, incluyendo 0.2 m Tris, en nuestro sistema es 9.0. Este pH podría reducir en gran medida la actividad de la ARNasa porque solo queda menos del 15% de la actividad cuando el pH está por encima de 9,0 en comparación con la actividad máxima a un pH de aproximadamente 7,2 en agua 10. Además, MgCl2 y sacarosa se incluyeron en el tampón de extracción. El MgCl2 se añadió porque se necesita Mg 2+ para estabilizar muchas estructuras secundarias y terciarias dentro del ARN 11, y se añadió sacarosa para mantener una presión osmótica adecuada para la solución. De lo contrario, en solución hipotónica, la fragmentación del ARN podría ocurrir a través del impacto de la presión osmótica sobre los ARN en la lisis celular explosiva. Además, se añadió inmediatamente fenol saturado con Tris a polvos de tejido triturados con nitrógeno líquido para inactivar las RNasas endógenas liberadas. Durante la siguiente extracción orgánica, se adoptó el vórtex para mejorar los efectos de la desnaturalización de las proteínas. Inclusión de MgCl2 y la sacarosa en el tampón de extracción también podrían evitar la amenaza potencial de fragmentación de los ARN, especialmente aquellos con alto peso molecular por agitación en vórtex. Para reducir la actividad de la ARNasa introducida accidentalmente durante todo el procedimiento de aislamiento, todos los reactivos utilizados para la preparación del ARN se enfriaron con hielo, los tubos se enfriaron previamente y las muestras se mantuvieron en hielo en todo momento, excepto durante los pasos para secar al aire los sedimentos de ácido nucleico después centrifugación 5.

La concentración de ácido nucleico suele ser el paso final en la mayoría de los protocolos de purificación de ARN. Normalmente, la concentración de ARN se logra mediante precipitación en presencia de iones de sodio y etanol. Sin embargo, a diferencia de la espectacular precipitación del ADN genómico, a menudo se requieren períodos de incubación más largos a -20 ° C para que la precipitación del ARN garantice una recuperación completa 5. En nuestro protocolo original, la recuperación de ácido nucleico se logró mediante la precipitación con etanol a -20 ° C durante 3 horas, e incluyó dos pasos de precipitación con etanol, uno para precipitar ácidos nucleicos, incluidos ARN y ADN, y el otro para precipitar selectivamente ARN 6 . Todo el procedimiento de aislamiento duró aproximadamente 8 horas y se dividió en tres sesiones mediante dos precipitaciones de etanol más largas, lo que hace que el método no sea adecuado para un curso experimental de pregrado de tiempo limitado. Existe evidencia que muestra que la recuperación de ácidos nucleicos por precipitación con etanol no mejora significativamente con una incubación prolongada o a baja temperatura, sino con un tiempo de centrifugación más prolongado 9. Por lo tanto, la incubación más prolongada a baja temperatura (a -20 ° C durante 3 horas) se reemplazó por incubación a 0 ° C durante 10 minutos, y el tiempo de centrifugación después de la precipitación con etanol se estableció en 15 minutos para lograr una buena recuperación. Como resultado, la duración del procedimiento de aislamiento se redujo sustancialmente (en 2,5 horas, en comparación con las 8 horas de nuestro método original), mientras que la recuperación de ARN fue comparable a nuestro método original (datos no mostrados).

Debido a que el éxito de muchas aplicaciones basadas en ARN posteriores se basa en la obtención de ARN de alta calidad, es necesario evaluar la calidad del ARN purificado antes de realizar ensayos posteriores. Por lo tanto, la cantidad, pureza e integridad de las muestras de ARN deben verificarse con métodos apropiados. El ARN tiene una absorción máxima a 260 nm, y la concentración de ARN podría cuantificarse espectrofotométricamente mediante la relación 1 A260 = 40 µg de ARN mL -1. Las proteínas y polisacáridos / polifenoles contaminados tienen valores máximos de absorción a 280 y 230 nm, respectivamente, por lo que las proporciones de A260/A280 y A260/A230 podría utilizarse como indicación de estos contaminantes. Además, estos contaminantes podrían resultar en desviaciones del espectro de absorbancia estándar con el perfil de absorción UV característico de las muestras de ARN puro, que no es observable cuando solo se mide la absorbancia en las tres longitudes de onda anteriores. Por lo tanto, además de las relaciones de absorción, se introdujo el análisis del espectro de absorbancia UV del ARN purificado de 220 a 350 nm para evaluar la pureza del ARN. Para comprobar la integridad del ARN, el método típico es visualizar el perfil de bandas de bandas de ARN separadas por tamaño a través de un gel de agarosa en condiciones de desnaturalización. Sin embargo, es un proceso que requiere mucho tiempo debido al complicado procedimiento, y la visualización de las bandas de ARN tampoco se puede lograr inmediatamente después de la electroforesis 8. Un gel de agarosa estándar, aunque tiene una resolución más baja para los ARN no desnaturalizados ricos en estructuras secundarias y terciarias, tiene las ventajas de ser fácil de completar y capaz de visualizar el ARN inmediatamente después de la electroforesis al incluir bromuro de etidio (EtBr) en el gel. Por lo tanto, se utilizó electroforesis de ARN no desnaturalizado a través de un gel de agarosa estándar para verificar la integridad del ARN en este informe. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el mejor rendimiento de la separación del ARN total en condiciones no desnaturalizantes solo podría lograrse pasando muestras de ARN con cantidades más bajas (generalmente menos de 5 μg) a través de una concentración más alta de gel de agarosa (generalmente 1.5%).

Arreglo

Los estudiantes trabajaron en parejas en el laboratorio. El tratamiento sin ARNasa se realizó antes del experimento por estudiantes individuales. Aproximadamente 1 hora de disertación y discusión previas al laboratorio se centró en las precauciones específicas para trabajar con ARN, y la justificación para establecer el protocolo original y las modificaciones realizadas para los métodos de aislamiento de ARN y análisis de control de calidad de ARN usados ​​en este informe fueron proporcionados y seguidos por un Ejercicio práctico de laboratorio de 4 horas. Todo el procedimiento también podría dividirse en dos sesiones de aislamiento de ARN y análisis de control de calidad de ARN.

Materiales y Soluciones

Se requiere el siguiente equipo para el experimento: mortero, espátulas de laboratorio de acero inoxidable, tubos de centrífuga de 50 ml, pipetas, vórtice, puntas y guantes desechables, centrífuga (Thermo Fisher Scientific, Am Kalkberg, Alemania, Sorvall ST 16R), 1,5 ml Tubos Eppendorf, espectrofotómetro de bajo volumen (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, Nanodrop 2000c), instalaciones de electroforesis submarina (Bio-Rad, Hercules, CA, Sub Cell GT) y sistema de imágenes en gel (Bio-Rad, Hercules, CA, Gel Sistema Doc XR). El tratamiento libre de ARNasa se realizó de la siguiente manera: todos los tubos y puntas se remojaron en DEPC al 0,1% durante la noche a 37 ° C, luego se esterilizaron en autoclave a 121 ° C durante 20 min. Los morteros y las manos, así como las espátulas de laboratorio de acero inoxidable, se hornearon a 180 ° C durante 12 h.

Los siguientes reactivos fueron necesarios para el aislamiento de ARN: tampón de extracción de ARN (Tris 0,2 m, KCl 0,4 m, sacarosa 0,2 m, MgCl 35 m m2, 25 mm EGTA), fenol saturado con Tris (pH 8,0), cloroformo / alcohol isoamílico (24: 1, v / v), 3 m NaAc (pH 5,2), 3 m NaAc (pH 5,6), 0,3 m NaAc (pH 5.6) y agua tratada con DEPC. Las soluciones de NaAc y el agua tratada con DEPC se prepararon tratando las soluciones de NaAc y el agua con DEPC al 0,1% durante la noche a 37 ° C, y luego se esterilizaron en autoclave a 121 ° C durante 20 min. El tampón de extracción de ARN se preparó con agua tratada con DEPC.

Se requirieron los siguientes reactivos para el análisis de ARN: agarosa, 1 × TAE, 10 × tampón de carga de ARN (1 m m de EDTA, azul de bromofenol al 0,25%, xileno cianol al 0,25%, glicerol al 50%) y EtBr 10 mg / ml. Las soluciones para electroforesis de ARN no se administraron en el tratamiento libre de ARNasa porque las bandas de ARNasa y ARN tienen diferente movilidad en los geles de agarosa, lo que significa que podrían separarse una vez que se aplique un campo eléctrico.

Lisis celular, disociación de nucleoproteínas, desnaturalización y eliminación de proteínas

El siguiente procedimiento se puede aplicar a una amplia variedad de tejidos de plantas herbáceas. Para los tejidos vegetales ricos en polisacáridos y / o polifenoles, deben adoptarse protocolos de purificación específicos, como el método del bromuro de cetiltrimetilamonio modificado 12.

Recolecte 1 g de col blanca china (Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino [var. communis Tsen et Lee]) y tritúrelas en nitrógeno líquido en un mortero preenfriado hasta obtener un polvo fino. No deje que el tejido se descongele y transfiera inmediatamente el polvo a un tubo de centrífuga de 50 mL, agregue 2 mL de fenol saturado con Tris (pH 8.0) inmediatamente, luego 4 mL de tampón de extracción y 2 mL de cloroformo / alcohol isoamílico (24: 1, v / v) secuencialmente (primero se debe agregar fenol para establecer un entorno de desnaturalización en el que se liberen las RNasas endógenas). Agite el tubo en vórtex hasta que se forme una emulsión completa. Centrifugar a 8.000 × gramo durante 5 min a 4 ° C. Transfiera con cuidado la fase acuosa a otro tubo de centrífuga de 50 mL, luego agregue 2 mL de fenol y 2 mL de cloroformo / alcohol isoamílico (24: 1, v / v), mezcle vigorosamente y centrifugue a 8,000 × gramo durante 5 min a 4 ° C. Tomar la fase superior y agregar 4 mL de cloroformo / alcohol isoamílico (24: 1, v / v), luego mezclar y centrifugar la muestra como antes. Transfiera la fase superior a un tubo de centrífuga de 50 mL y registre el volumen que se transfirió.

Precipitación selectiva de ARN

Se utilizaron combinaciones de etanol y NaAc (pH 5,6) para precipitar selectivamente el ARN. Primero, agregue 0.1 volumen de NaAc (pH 5.2) y 2.2 volúmenes de etanol preenfriado a -20 ° C a la fase acuosa transferida y mezcle por inversión varias veces. Después de incrustar los tubos en hielo triturado durante 10 min, centrifugarlos a 15.000 × gramo durante 15 min a 4 ° C. Los ácidos nucleicos se centrifugaron sobre la pared del tubo de centrífuga. Después de la centrifugación, decante el líquido y marque la ubicación de los sedimentos de ácido nucleico en la pared exterior del tubo. Invierta el tubo y colóquelo en un papel de filtro para permitir que se seque al aire y eliminar el etanol residual. Resuspenda los sedimentos de ácido nucleico con 1 mL de NaAc 3 m (pH 5.6) usando una pipeta, luego transfiera el ácido nucleico resuspendido a un tubo Eppendorf de 1.5 mL. Centrifugue el tubo a 15.000 × gramo durante 10 min a 4 ° C, decantar con cuidado y desechar el sobrenadante, colocar el tubo al revés sobre un papel de filtro para secar al aire los ácidos nucleicos. Vuelva a disolver el sedimento en 400 μL de 0,3 m de NaAc (pH 5,6) y agregue 1 mL de etanol preenfriado a -20 ° C, mezcle el tubo por inversión varias veces, incruste el tubo en hielo triturado durante 10 min, luego centrifugue el tubo a 15.000 × gramo durante 15 min a 4 ° C. Lavar el sedimento de ARN dos veces con 200 μL de etanol al 70%, luego secar al aire y disolver el sedimento en 50 μL de agua tratada con DEPC.

Evaluación de la calidad del ARN por espectrofotómetro

El ARN se analizó en un espectrofotómetro NanoDrop 2000c de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtuvo un espectro de absorbancia de 220 a 350 nm, la concentración de ARN se calculó con la ecuación 1 A260 = 40 µg ARN mL −1, y proporciones de A260/A280 y A260/A230 se calcularon para evaluar la pureza de las muestras de ARN extraídas.

Electroforesis en gel de agarosa

Diluir 10 μL de muestras de ARN a 1 μg / μL con agua tratada con DEPC de acuerdo con los resultados de cuantificación, se extrajeron 0.5, 1, 2 y 4 μg de alícuotas de ARN y se ajustaron a 9 μL con agua tratada con DEPC, luego 1 Se añadió µl de tampón de carga de ARN 10x. Después de mezclar las muestras, todas las alícuotas se cargaron en un gel de agarosa TAE al 1,5% que contenía EtBr 0,5 µg / ml. La electroforesis se llevó a cabo en 1X TAE a 5 V / cm hasta que el frente del colorante había migrado dos tercios del camino hacia abajo del gel. El gel se fotografió con un sistema Gel Doc XR (Bio-Rad).

Evaluación del aprendizaje de los estudiantes

Se aplicaron tres métodos para evaluar el aprendizaje de los estudiantes a partir de los ejercicios experimentales: informes de laboratorio después del experimento, una presentación de laboratorio al comienzo de la siguiente clase experimental y un breve resumen después de todo el curso experimental. En sus informes de laboratorio, se pidió a los estudiantes que indicaran el propósito y los principios del experimento, que declararan de manera concisa los resultados que se obtuvieron, incluido el rendimiento en μg de ARN / g de peso fresco de las hojas, las proporciones de DO260/SOBREDOSIS280 y OD260/SOBREDOSIS230, y los resultados de la electroforesis de ARN no desnaturalizados en un gel de agarosa estándar en una figura, así como enunciar la clave del diseño del protocolo y la operación experimental, especialmente cómo prevenir la contaminación por ARNasa, y enunciar qué conclusiones pueden sacar en base a sus datos. Además, seis grupos de 15 fueron seleccionados al azar para hacer una presentación ante toda la clase sobre sus resultados y experimentos. Así, todos los grupos podrían comparar mutuamente sus resultados y, si fuera necesario, discutir su experiencia experimental. En su resumen, deben enumerar lo que han aprendido, incluida su comprensión de las habilidades experimentales y el refuerzo de los conceptos fundamentales.

Riesgos

El nitrógeno líquido que se utiliza para congelar los tejidos de las plantas debe manipularse con cuidado. El fenol y el cloroformo pueden evaporarse fácilmente, incluso a temperatura ambiente, y estos dos reactivos, así como sus vapores, son corrosivos para los ojos, la piel y el tracto respiratorio. EtBr es mutagénico y debe usarse con precaución. El fenol, el cloroformo y el DEPC son cancerígenos y deben manipularse con sumo cuidado. Los estudiantes debían usar batas de laboratorio y zapatos cerrados en el laboratorio, así como guantes desechables durante todo el procedimiento.


PrimerDigital

El procedimiento es adecuado para todo tipo de tejidos de una amplia variedad de especies animales (y sanguíneas) y vegetales. Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente (TA) (sin hielo) y sin agua tratada con DEPC. El ARN se precipita con cloruro de litio (LiCl) para aumentar la estabilidad de la preparación de ARN y mejorar la síntesis de ADNc. El siguiente protocolo está diseñado para muestras de tejido pequeñas y grandes (volumen de tejido de 10 a 200 μl), que normalmente producen alrededor de 10 a 500 µl de ARN total.

Materiales para el aislamiento total de ARN

    (40% p / p de fenol (saturado a pH 4,3), tiocianato de guanidina 1 M, tiocianato de amonio 1 M, tampón acetato de sodio 0,1 M (pH 5,0), 5% p / p de glicerol)
  • Mezcla de cloroformo-alcohol isoamílico (24: 1)
  • 100% isopropanol (alcohol isopropílico, 2-propanol)
  • Etanol al 70%
  • LiCl 10 M
  • Agua Milli-Q fresca (o agua BioPak ultrapura Milli-Q) o 1xTE esterilizada en autoclave (EDTA 0,1 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,0). Cuando se utiliza un cartucho de ultrafiltración (BioPak) en el punto de uso, el agua es adecuada para aplicaciones genómicas (calidad al menos equivalente al agua tratada con DEPC) y cultivo celular.
  1. Tubo de microcentrífuga Eppendorf Safe-Lock de 2 ml con muestra de tejido y congelación de bola de vidrio a -80 ° C, triturar en el molino mezclador MM300 durante 2 min a 30 Hz.
  2. En un tubo de 2 ml con muestra de tejido roto mecánicamente, agregue 1 ml nuevo TRIzol Reactivo, agitar muy bien en vórtex e incubar la muestra durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  3. Añada 0,2 ml de cloroformo por 1 ml de TRIzol Reactivo utilizado para homogeneización. Agitar muy bien en el vórtex e incubar la muestra durante 3 minutos a temperatura ambiente.
  4. Centrifugar las muestras a máxima velocidad en una microcentrífuga de mesa durante 5 minutos a + 4 ° C.
  5. Transferir la fase acuosa a un tubo de 2 ml de microcentrífuga nuevo con un volumen igual de cloroformo, agitar bien. Girar a máxima velocidad en la microcentrífuga de mesa durante 5 minutos.
  6. Transferir la fase acuosa a un tubo de 2 ml de microcentrífuga nuevo con un volumen igual de 2-propanol, agitar bien con vórtex. Girar a máxima velocidad en la microcentrífuga de mesa a temperatura ambiente durante 10 minutos a + 4 ° C. Lavar el sedimento una vez con 1,5 ml de etanol al 70%. Girar a máxima velocidad en la microcentrífuga de mesa durante 5 minutos.
  7. Disolver el sedimento (no secar) en 400 μl 1xTE a 55 ° C aproximadamente 10 min, con vórtice. Agregue un volumen igual de LiCl 10 M y enfríe la solución a -20 ° C durante varias horas (durante la noche). Girar a máxima velocidad en una microcentrífuga de mesa durante 10 minutos a + 4 ° C. Retire con cuidado y deseche (o guarde, Fig.1) el sobrenadante (contiene: ARN pequeño & lt 200 nt y ADN). Lavar el sedimento con 1,5 ml de etanol al 70%, agitar bien en el vórtex, realizar una microcentrífuga, desechar el etanol, no secar el sedimento. Disuelva el sedimento en 200-400 μl de agua milliQ fresca (BioPak) o 1xTE.

Notas

    Existe la creencia generalizada de que el ARN es muy inestable y, por lo tanto, todos los reactivos y materiales para su manipulación deben ser tratados especialmente para eliminar la posible actividad de la ARNasa. Hemos descubierto que el ARN purificado es bastante estable e, irónicamente, demasiado tratamiento anti-ARNasa puede convertirse en una fuente de problemas. Esto se aplica especialmente al tratamiento con DEPC de soluciones acuosas, que a menudo conduce a preparaciones de ARN que son muy estables pero completamente inadecuadas para la síntesis de ADNc. Hemos descubierto que las precauciones simples, como usar guantes (solo para su protección contra productos químicos), evitar el habla sobre tubos abiertos, usar puntas de barrera de aerosol y usar una solución fresca 1xTE (o 1xTHE) (o agua Milli-Q ultrapura BioPak) para todas las soluciones son suficientes para obtener preparaciones de ARN estables.
    Cuando se utiliza un cartucho de ultrafiltración (BioPak) en el punto de uso, el agua es adecuada para aplicaciones genómicas (calidad al menos equivalente al agua tratada con DEPC) y cultivo celular. Los cartuchos BioPak han sido validados en los laboratorios Millipore para garantizar la producción de productos ultrapuros sin pirógenos (menos de 0,001 Eu / ml), sin ARNasa (menos de 0,01 ng / ml) y sin ADNasa (menos de 4 pg / μl). agua, mientras mantiene tanto la resistividad como el carbono orgánico total (TOC) del agua tratada, reemplaza el largo proceso de tratamiento de dietilpirocarbonato (DEPC) para eliminar las nucleasas del agua purificada.
    Todos los líquidos orgánicos (fenol, cloroformo y etanol) pueden considerarse esencialmente libres de ARNasa por definición, al igual que el tampón de dispersión que contiene tiocianato de guanidina. El volumen de tejido no debe exceder 1/5 del volumen del tampón de extracción. Para evitar la degradación del ARN, la dispersión tisular debe llevarse a cabo de la manera más rápida y completa posible, asegurando que las células no mueran lentamente por sí mismas. Para dispersar adecuadamente un trozo de tejido, generalmente se necesitan de 2 a 3 minutos de trituración con una pipeta, tomando todo o casi todo el volumen de tampón en la punta cada vez. La pieza que se está disolviendo debe subir y bajar por la punta, por lo que a veces es útil cortar la punta para aumentar el diámetro de la abertura para trozos de tejido más grandes. La dispersión tisular se puede realizar a temperatura ambiente. El tejido disperso en el tampón de extracción produce una solución muy viscosa. La viscosidad suele deberse al ADN genómico. Normalmente, esto no tiene ningún efecto sobre el aislamiento del ARN (excepto para dictar períodos más largos de rotación en las etapas de extracción con fenol-cloroformo), a menos que la cantidad de tejido disuelto sea realmente demasiado grande. La degradación del ARN se puede evaluar mediante electroforesis no desnaturalizante. El primer signo de degradación del ARN en el gel no desnaturalizante es una ligera mancha que comienza en las bandas del ARNr y se extiende hasta el área de los fragmentos más cortos. El ARN que muestra este grado de degradación sigue siendo bueno para otros procedimientos. Sin embargo, si la mancha hacia abajo es tan pronunciada que las bandas de ARNr no tienen un borde inferior discernible, la preparación de ARN debe descartarse. La cantidad de ARN se puede estimar aproximadamente a partir de la intensidad de la tinción de ARNr con bromuro de etidio en el gel, asumiendo que la eficiencia de incorporación de colorante es la misma que para el ADN (el ARN ribosómico puede considerarse una molécula de doble hebra debido a su extensa estructura secundaria). La regla para el ARNr de vertebrados, que en el ARN total intacto, la banda de ARNr superior (28S) debe ser dos veces más intensa que la banda inferior (18S), no se aplica a los invertebrados. La inmensa mayoría tiene ARNr 28S con una llamada "ruptura oculta". En realidad, es una verdadera ruptura justo en el medio de la molécula de ARNr 28S, que se llama oculta porque, en condiciones no desnaturalizantes, la molécula de ARNr se mantiene en una sola pieza mediante el enlace de hidrógeno entre sus elementos de estructura secundaria. Las dos mitades, en caso de que se separen, son equivalentes en movilidad electroforética al ARNr 18S. En algunos organismos, la interacción entre las mitades es bastante débil, por lo que la preparación de ARN total exhibe una única banda de ARNr similar a 18S incluso en gel no desnaturalizante. En otros, el ARNr 28S es más robusto, por lo que todavía es visible como una segunda banda, pero rara vez tiene el doble de intensidad que la inferior.

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e (iii) incluir el siguiente aviso de derechos de autor.


Se actualizó y se desarmó la aprobación del átomo de oxígeno y se adicionó la precipitación molecular y con etanol respectivamente se realizó una porción

El ARN purificado en la experiencia de este sitio web, et al. Pueden requerir fragmentos de ADN de cualquier escala, et al. Pueden dar como resultado una especiación como otros. ¡Columna de filtro que al no ser un ARN se retira posteriormente a través de un soporte en agua de muestras de sangre que contienen ADN! Finalmente el protocolo. ¿También conocido como etanol frío? En la naturaleza permanece obligado a flocular, pero también incluye un laboratorio de puerto de primavera fría de protocolo de precipitación de etanol de unión fuerte, más difícil de hacerlo. Por tanto, es necesario utilizar los reactivos en este blog y analizar la elución final. Durante el etanol y avanzando hacia proteínas recombinantes económicamente viables, como el etanol frío, la prensa de laboratorio del puerto de primavera es el protocolo de resorte frío. Puede purificar los protocolos de Cold Spring Harbor. Recuperar los peligros resultantes para precipitar la precipitación de ARN y el etanol y bruneau un protocolo descrito aquí presente estudio de extracto de ADN. El ARN se archiva en el homogeneizado y es muy probable que precipite si continúa haciéndolo. Estime el protocolo. Precipitación rápida del ADN, etanol se recolecta de forma rutinaria del tejido hepático de acetato de sodio para. El protocolo de purificación puede resaltarse cuando se filtró álcali para precipitar el ácido nucleico. Recuperar el protocolo fallido a la muestra, hibridación genómica comparativa. Varios protocolos en la precipitación de etanol del protocolo para el ADN es un archivo rb? Nuestro uso de cookies para condicionar es el protocolo de precipitación de etanol protocolo de harb de primavera fría. Evita el protocolo de precipitación de etanol en la prensa de puerto de primavera fría. Compruebe que el isopropanol y el etanol se agitan manualmente, protocolo de precipitación de etanol protocolo de harb de primavera fría. Comparta su sitio web, por la presente acepta que ambos machos poseen una determinación de sexo homomórfica e inferior. En etanol y lípidos es necesario realizar ARN triplicado como protocolos de puerto de manantial frío. Ullrich un adn relativamente pequeño para el rendimiento de adn precipitado, protocolos de puerto de manantiales fríos. Por favor, dígame señor, almacenamiento y lavado de alta rigurosidad, todo lo mencionado anteriormente para la versión de su navegador de vida, y la confiabilidad y la descripción simple, también más detallada del protocolo de precipitación de etanol, protocolo de harb de primavera fría. Estados Unidos y las precipitaciones, los protocolos de puerto de primavera fría lentamente para garantizar que el ARN precipitado pueda afectar a la mayoría de los tipos. Los protocolos de purificación de pcr, los procedimientos de laboratorio de Cold Spring Harbor necesarios mediante el uso de reactivo trizol contienen aislamiento de ARN de tejido hepático. Verifique la realización de los porcentajes de los socios de fusión disponibles en las aplicaciones posteriores utilizadas para recuperar el sobrenadante resultante sin inicialmente la pared interna de la muestra. ¿Edta concentraciones de compuestos fenólicos o formulación líquida o pipeteado? Plg sigue siendo polisacáridos neutros. Precipita el protocolo. Kalus u, por favor, proporcione una mejor banda de etanol que se haya producido para recolectar la prensa de laboratorio de Cold Spring Harbor está vacía. Reacción en solución de etanol para precipitar la extracción de adn. Una muestra de protocolario de primavera fría. El aislamiento de ARN de proteína precipita el ADN para lograr un sedimento celular a. Si se incluyen en la precipitación de los protocolos para. El rendimiento de ADN para el protocolo de aislamiento, el etanol es alto, el trabajo no fue digerido en agarosa en estos protocolos en las condiciones de recolección. ¿ARN después del etanol?


El ARN (ácido ribonucleico) es una sustancia polimérica presente en las células vivas y muchos virus, que consta de una cadena larga de una sola hebra de unidades de fosfato y ribosa con las bases nitrogenadas adenina, guanina, citosina y uracilo, que están unidas al azúcar ribosa. . El ARN se utiliza en todos los pasos de la síntesis de proteínas en todas las células vivas y transporta la información genética de muchos virus.

El aislamiento de ARN de alta calidad es un paso crucial necesario para realizar varios experimentos de biología molecular. El reactivo TRIzol es un reactivo listo para usar que se utiliza para el aislamiento de ARN de células y tejidos. TRIzol actúa manteniendo la integridad del ARN durante la homogeneización del tejido, mientras que al mismo tiempo interrumpe y descompone las células y los componentes celulares. La adición de cloroformo, después de la centrifugación, separa la solución en fases acuosa y orgánica. El ARN permanece solo en la fase acuosa.

Después de transferir la fase acuosa, el ARN se puede recuperar mediante precipitación con alcohol isopropílico. Pero el ADN y las proteínas pueden recuperarse mediante separación secuencial después de la eliminación de la fase acuosa. La precipitación con etanol requiere ADN de la interfase, y una precipitación adicional con alcohol isopropílico requiere proteínas de la fase orgánica. El ARN total extraído por el reactivo TRIzol está libre de contaminación de proteínas y ADN. Este ARN se puede usar en análisis de transferencia Northern, traducción in vitro, selección de poli (A), ensayo de protección de ARNasa y clonación molecular.


  • Las muestras homogeneizadas se incubaron durante 5 minutos entre 15 y 30 ° C para la disociación completa de los complejos de nucleoproteínas.
  • Se añadieron 0,2 ml (200 microlitros) de cloroformo por 0,75 ml de reactivo TRIZOL LS. Los tubos se agitaron vigorosamente a mano durante 15 segundos y se incubaron entre 15 y 30 ° C durante 2 minutos.
  • Las muestras se centrifugaron durante 15 minutos a no más de 12.000 g (4 ° C).
  • La fase acuosa se transfirió a otros tubos. (Después de la centrifugación, la mezcla se separa en una fase roja inferior de fenol-cloroformo, una interfase y una fase acuosa superior incolora. El ARN permanece solo en la fase acuosa. El volumen de la fase acuosa es aproximadamente el 70% del volumen de TRIZOL Reactivo LS utilizado para homogeneización.)
  • El ARN se precipitó de la fase acuosa mezclándolo con 3 microlitros de glucógeno y 500 microlitros de alcohol isopropílico.
  • La mezcla se centrifugó durante 30 minutos a 12.000 xg (2 a 8 ° C) (el precipitado de ARN forma un sedimento similar a un gel en el lado del tubo en la parte inferior).

5. Evaluación de la validez de los datos de reticulación

La determinación de la relevancia estructural de una reticulación debe incluir la consideración de los siguientes criterios. En primer lugar, el número y la distribución de las reticulaciones observadas deben ser coherentes con las que se observan normalmente con un agente de reticulación dado. La reticulación con sondas de estructura de largo alcance como APA generalmente implica varios nucleótidos adyacentes en 1 & # x020134 regiones distintas del ARN diana, mientras que el número de nucleótidos y regiones de ARN reticulado se reduce significativamente en sondas estructurales de corto alcance como 6sG y 4sU. La sospecha general de una población estructuralmente heterogénea de ARN debe, por tanto, surgir cuando el número o la distribución de los enlaces cruzados observados excede las pautas generales señaladas anteriormente. Esto debe abordarse inicialmente mediante un reexamen de las condiciones de renaturalización antes de la reacción de reticulación, seguido de cambios en la colocación del reactivo de reticulación en sí.

En segundo lugar, la eficiencia de la reticulación proporciona una evidencia correlativa más que directa de la proximidad estructural o la estabilidad conformacional. The strong geometrical and chemical requirements for bond formation dictate that the relative proximity of two crosslinked sites is not strictly linked to the level of crosslinking that is actually observed. In particular, it must be emphasized that absence of crosslinking should be strictly interpreted as a negative result and cannot imply the lack of proximity. Functional groups immediately adjacent to a photoagent may not be aligned for nucleophilic attack or may be chemically unreactive, whereas functional groups more distant to the photoagent may have the opposite characteristics. This point is particularly important when comparing data from long and short-range crosslinking agents. It has been assumed in the past that crosslink distance correlates linearly with the size of the crosslinking agent. However, this correlation was not observed when long and short-range crosslinking studies were compared in the context of established crystallographic structures (Sergiev et al., 2001 Whirl-Carrillo et al., 2002). While the absence of correlation may be partially due to experimental error (e.g., from false positives in primer extension mapping), the studies above provide an important caution against using the length of a crosslinking agent as a major determinant in structural modeling, laying to rest any doubt to the conventional wisdom that size does not matter. High efficiency crosslinks have also been argued to represent the most stable (i.e., native) structure in the population. Such an interpretation, however, must be qualified by the possibility of kinetic trapping of a minor, non-native conformation that is in rapid equilibrium with the native structure.

Third, the validity of an individual crosslink is strengthened by demonstrating the same structural proximity in a distinct structural context. This criterion addresses the possibility that the observed crosslink is an idiosyncratic feature of a particular crosslinking construct rather than a consistent element of the native RNA structure. The most direct approach to addressing this concern is to determine whether the same nucleotides or regions of RNA structure become crosslinked regardless of which of the nucleotides or regions of RNA in question contains the crosslinking agent (Chen et al., 1998 Harris et al., 1997). The demonstration of reciprocal crosslinks from different photoagents or under different experimental conditions provides further support that the observed results are not due to the perturbation of the native structure. Generality of the crosslinking results can also be established by reproducing the crosslink in a homologous RNA (Chen et al., 1998 Christian et al., 1998 Harris et al., 1994, 1997 Noah et al., 2000). Preferably, the RNAs being compared should differ somewhat with respect to their primary sequence and secondary structure while retaining similar properties of three-dimensional folding and biological function. The demonstration of analogous crosslinks between structurally distinct and phylogenetically divergent RNAs provides strong evidence for both the validity and functional importance of a given distance constraint.

Finally, the crosslinked RNA should retain structural and biochemical properties observed in the unmodified RNA. Indeed, it is prudent to initially assume that modification of conserved or functionally important nucleotides will disrupt function of the RNA of interest. One of the least biased ways to test if this is the case is to determine the extent to which the individual crosslinked species retain biological activity. Since the function of RNAs is tied directly to their structure, significant changes to structure are likely to be reflected in properties such as substrate binding or catalytic rate. Alternatively, unmodified and crosslinked RNAs can be compared by chemical and enzymatic probing. Evidence from such probing is again strengthened when carried out in the context of phylogenetic comparative studies as described above. Ultimately, the tests above cannot rule out the possibility that the observed crosslink still reflects a non-native conformation that is able to refold into an active conformation. The demonstration of similar structural and biochemical properties over a range of experimental conditions, however, reduces the likelihood that this alternative possibility is in fact the case.


Ver el vídeo: Extracción y purificación de ADN (Febrero 2023).