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Encontrar un método fácil y económico para teñir el dNTP

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Quiero medir la DO para conocer la concentración de dNTP. ¿Alguna idea para teñir dNTP al precio más barato y de la forma más sencilla?


Puede que exista tal tinte, pero no soy consciente de ello. La forma estándar de medir los dNTP y los ácidos nucleicos en general es mediante absorbancia a 260 nm. Este artículo tiene una tabla de coeficientes de extinción molar para dNTP (tabla 10.2). Son

longitud de onda coeficiente de extinción molar dATP 259 nm 15.200 dCTP 280 nm 13.100 dGTP 253 nm 13.700 dTTP 267 nm 9.600

En la práctica, para el trabajo de rutina con ADN, puede usar 260 nm y asumir que una absorbancia de 1 corresponde a [ADN] = 50 µg ml-1. Usando un promedio de los valores en la Tabla, y sin tener en cuenta el hecho de que estos están en realidad en diferentes longitudes de onda, y usando un MW dNTP promedio aproximado de 500, calculo una absorbancia para 50 µg ml-1 solución de los 4 dNTP como 1.3, por lo que es un acuerdo razonable dadas todas las suposiciones que he hecho.

Hay tintes fluorescentes que se pueden usar para medir el ADN, pero estos se basan en la presencia de bases apiladas, por lo que no son útiles para los dNTP libres.

Entonces, malas noticias si no tiene un espectrofotómetro UV. Hay planes disponibles para la construcción de espectrofotómetros simples usando Lego y algunos componentes optoelectrónicos. Estos tienden a usar LED como fuente de luz, pero no sé si los LED UV están disponibles.


Será difícil lograr el nivel de resolución de longitud de onda requerido para diferenciar los dNTP, considerando que está haciendo un experimento de bricolaje. Solo los espectrofotómetros muy precisos pueden lograrlo y son costosos.

Otra técnica que puede probar es la cromatografía en capa fina (TLC). Es barato y puedes hacer un bricolaje fácilmente. Pero necesita estándares para diferenciar NTP, NDP y NMP; los dos últimos pueden surgir debido a la degradación durante el experimento. Las personas generalmente usan un cóctel de antioxidantes y protectores para minimizar la degradación de nucleótidos.

Una estrategia para hacer esto es eliminar el fosfato usando fosfatasa y luego hacer una TLC con nucleósidos (que son bastante estables).

Puede consultar esta revisión en TLC de ácido nucleico.


Introducción práctica a la electroforesis para biología

El laboratorio en el que trabajo está interesado en la mecánica de los procesos biológicos básicos, utilizando la levadura como organismo modelo.

Un buen amigo, físico y ejecutivo de marketing de tecnología por formación y profesión, se unirá a mí en el laboratorio. Estas son mis notas informales para él para ponerlo al día de una manera práctica para nuestro laboratorio, enfocándonos en los métodos clásicos de los clásicos de oro para empezar. Mi esperanza es que él y otros interesados ​​en hacer una transición profesional de este tipo a un laboratorio biológico también encuentren útil esta introducción práctica.


Abstracto

En este trabajo aplicamos una técnica de fotólisis flash al estudio del comportamiento cinético de una sal sintética de flavilio en solución acuosa. Los procesos cinéticos desencadenados por el pulso de luz de un flash de cámara común, son seguidos por medio de un espectrofotómetro ligeramente modificado, controlado por computadora. La luz induce cambios de absorbancia reversibles y se evidencian dos especies transitorias diferentes antes de la recuperación completa del sistema. Se informa el comportamiento cinético y los espectros de las especies transitorias. El experimento propuesto es barato y fácil y permite a los estudiantes de todos los niveles familiarizarse con los conceptos de cinética de desintegración transitoria y espectros resueltos en el tiempo.


Repensar el proceso de teñido con biología sintética

El 20% de la contaminación del agua de la tierra es causada por el procesamiento textil y se requieren 1.800 galones de agua para hacer un solo par de jeans. Esa es una cantidad asombrosa de agua dulce necesaria para hacer una sola pieza de ropa & # 8211, pero la industria está a punto de cambiar.

Colorifix, con sede en el Reino Unido, quiere reducir el desperdicio de agua durante todo el proceso de teñido aprovechando las capacidades biológicas de los microbios.

“Como parte de un proyecto de biosensor de arsénico dirigido por la Universidad de Cambridge, nuestro equipo fue al sur de Asia con nuestro prototipo de biosensor, explicó a la gente cómo funcionaba y luego le pidió a la gente una lista de sustancias químicas que pensaban que valía la pena monitorear”, dice Dr. Orr Yarkoni, cofundador y CEO de Colorifix.

"Cuando regresamos [al Reino Unido] e hicimos nuestra tarea, descubrimos que la mayoría de estos químicos preocupantes provenían de la industria textil, y el teñido era el principal culpable tanto del uso del agua como del uso de químicos", dice Yarkoni, quien luego decidió utilizar biología sintética para producir los tintes y reducir los contaminantes, en lugar de simplemente monitorearlos.

Después de algunos años de investigación con el Dr. James Ajioka y el Dr. David Nugent, Colorifix se separó en 2016. El progreso científico fue rápido y el equipo rápidamente buscó formas de reducir el daño ambiental causado por la industria textil, más allá de los producción de tintes.

Drs. Nugent (izquierda) y Ajioka (derecha) en el laboratorio Colorifix en Norwich, Inglaterra. Imagen cortesía de Colorifix.

“Normalmente, [depositar un tinte sobre la tela] se hace con productos químicos o compuestos producidos biológicamente, pero sin un agente biológico. Estamos utilizando las propias células para producir y depositar el pigmento en la fibra, por lo que estamos utilizando la biología para todo el proceso. Hacer eso es lo que nos permite ahorrar agua y energía y eliminar los productos químicos. Utilizamos la biología para transferir esos pigmentos y tintes a la fibra ”, explica Yarkoni.

Hasta ahora, Colorifix ha desarrollado un conjunto de colores, cada uno derivado de pigmentos naturales.

“La mayoría de nuestros pigmentos actuales provienen de insectos, algunos microbiológicos, aves, etc. Así que sí, estamos buscando pigmentos en todas partes en este momento. También hemos hecho algunos pigmentos de organismos submarinos ”, dice Yarkoni, quien se apresura a señalar que el beneficio real de Colorifix es su proceso de teñido único, más que la producción de pigmentos de base biológica.

En una entrevista anterior con Vogue Australia, Yarkoni enfatizó que su proceso de teñido usa 10 veces menos agua y consume un 20 por ciento menos de energía, principalmente porque la compañía usa melaza, un subproducto del azúcar, para alimentar a los microbios productores de pigmentos y reemplaza el fijador. productos químicos con la propia biología. El proceso normal de teñido de textiles a menudo ocurre a temperaturas muy altas, muy por encima de los 100 grados Celsius, lo que consume una gran cantidad de energía. Los microbios de Colorifix pueden teñirse a 37 grados y luego inactivarse por calor a menos de 100 grados, lo que ahorra energía. Pero la empresa no planea quedarse ahí.

Una muestra de textiles coloreados del proceso de teñido de base biológica de Colorifix. Imagen cortesía de Colorifix.

"Con respecto al agua, nos complace decir que ahora hemos probado con éxito tanto la fermentación como el teñido utilizando exclusivamente agua salada, por lo que ahora no necesitamos tocar agua dulce en el proceso", anunció Yarkoni.

Eso es un gran salto para la industria textil y podría ahorrar miles de galones de agua dulce durante todo el proceso de teñido. La mejor parte es que, a pesar de estos ahorros de energía y agua, el proceso de teñido de un textil permanece prácticamente sin cambios.

"Nuestro licor de tinte va esencialmente a su máquina de tinte existente; todos son compatibles & # 8211, por lo que todo lo que necesitan hacer es cambiar el licor de tinte que ingresa a su máquina", dice Yarkoni, refiriéndose a la solución acuosa de químicos que se usa para teñir un prenda. "La única diferencia es que [la instalación de teñido] puede deshacerse de todos sus otros químicos, ya que el organismo está fijando el tinte y manchando la tela sin esos químicos".

Desde la mezclilla hasta los tintes y todo lo demás, las empresas de biología sintética están respondiendo a las llamadas de una industria derrochadora. Empresas como Tinctorium, PILI y Colorifix están encontrando formas alternativas de producir los mismos colores vibrantes que atraen a los consumidores sin la toxicidad, los productos químicos y la contaminación añadidos.

Estamos entrando en un momento crucial en la industria de la moda, donde las alternativas sostenibles de base biológica estarán de moda.

Niko McCarty

Niko es un estudiante de doctorado en bioingeniería en el Instituto de Tecnología de California. Anteriormente completó su Maestría en Sistemas y Biología Sintética en el Imperial College de Londres como Fulbright Scholar.


RESULTADOS

Descripción general y optimización del sistema DocMF

El novedoso sistema DocMF mide las interacciones proteína-ADN examinando el cambio de la señal de fluorescencia a través de imágenes secuenciales en el chip antes y después de la interacción de la proteína con DNB que contienen objetivos de ADN (Fig. 1 y película S1). Los DNB se componen de adaptadores de secuenciación e inserciones de secuencias aleatorias para cubrir la gama completa de sitios de unión a proteínas. Cientos de millones de DNB se cargan primero en los chips BGISEQ500 en una matriz con patrones, y las regiones de inserción se secuencian a una longitud fija utilizando el flujo de trabajo DNBSeq (16). Después de obtener la información de secuencia única para cada DNB, reformamos los DNB monocatenarios (ssDNB) eliminando la hebra marcada con colorante sintetizada en la secuenciación. Posteriormente, una hebra complementaria nativa se resintetiza para formar dsDNA y se marca en los extremos con tintes fluorescentes. Para las proteínas que cortan el ADN, se adquiere una primera imagen para registrar la ubicación y la intensidad de la señal de los DNB individuales, es decir, las lecturas. La proteína de interés se une a sus objetivos de dsDNA y escinde los DNB correspondientes, lo que lleva a la reducción o eliminación de la señal de estos DNB durante una segunda ronda de obtención de imágenes (Fig. 1A). Los motivos específicos pueden identificarse a partir de las secuencias de DNB seleccionados con eliminación o reducción de la señal superior a un umbral (Fig. 1B) y verificarse en ensayos moleculares posteriores. Se utiliza un flujo de trabajo de DocMF ligeramente modificado para caracterizar las preferencias de unión de proteína-ADN. En este protocolo, las imágenes de los DNB se obtienen primero después de incubar el dsDNA marcado en el extremo con proteínas de unión al ADN para la intensidad de la señal inicial. En el siguiente paso, se realiza una reacción de polimerasa adicional llamada MDA para reemplazar la hebra marcada. MDA conduce a la pérdida de señal durante el segundo paso de formación de imágenes como se ilustra en la fig. S1. Sin embargo, si una proteína de interés se une a sus objetivos de ADN e inhibe la MDA, la señal de los DNB que contienen sitios de unión a proteínas permanecería sin cambios o se vería menos afectada que la del carril de control, que no incluye la incubación de proteínas pero conserva los otros pasos. .

Para garantizar que la obtención de imágenes secuenciales sea factible, es fundamental que el paso de extracción no afecte la información espacial ni dañe la estructura de DNB. Los chips BGISEQ500 utilizados en este experimento son matrices con patrones. Por lo tanto, las imágenes secuenciales no afectan el registro de las ubicaciones de DNB en la misma medida en que se ve afectado el método CHAMP que usa chips Miseq (11). Además, probamos una variedad de tampones de eliminación y descubrimos que el tampón de formamida tenía el menor impacto en la integridad del DNB, solo rompiendo los enlaces de hidrógeno entre el dsDNA sin afectar la estabilidad del DNB ni separar los DNB de la superficie. La Figura S2 muestra que las puntuaciones de calidad de secuenciación, incluidas Q30 (92,83 frente a 90,32), Lag (0,15 frente a 0,15) y RunOn (0,15 frente a 0,12), no se vieron afectadas después de la eliminación con tampón de formamida. En comparación, el tampón de separación con NaOH redujo significativamente el Q30 de más del 90% a casi 0.

Después de obtener dos imágenes antes y después de la interacción proteína-ADN, comparamos directamente el cambio de pliegues de intensidad de la señal sin procesar de cada DNB. Si la proteína escinde el ADN, se pueden recuperar los DNB que tienen una reducción de señal significativa (Fig. 1B) y se analizan las secuencias correspondientes para la identificación del motivo (Materiales y métodos). Para medir las interacciones de unión proteína-ADN, obtuvimos la información de la secuencia de unión de estos DNB con un cambio de señal mínimo en comparación con el control.

DocMF puede caracterizar una amplia gama de sitios de restricción de endonucleasas (RS)

Una vez establecido el sistema, probamos seis endonucleasas de restricción (Eco RI, Bpu 10I, Age I, Nme AIII, Mlu I y Bgl I) con diferentes características de RS. Las enzimas de restricción de tipo II escinden el ADN adyacente o dentro de sus sitios de reconocimiento (21), que han sido ampliamente estudiados. Las enzimas seleccionadas contienen sitios de restricción (RS) que varían de 6 a 11 pb y comprenden secuencias palindrómicas normales, secuencias no palindrómicas y bases degeneradas. La biblioteca de DNB contiene un conjunto de fragmentos de ADN aleatorios sintéticos con una longitud de 50 nt. Se leyeron cuarenta de los 50 nucleótidos de estas secuencias aleatorias utilizando el conjunto de secuenciación de alto rendimiento BGISEQ-500RS (SE100). Se tomaron imágenes antes y después de la incubación en chip de estas enzimas durante 2 horas o durante la noche. Se identificaron DNB con umbral FFI & gt 2 (lecturas positivas) para seleccionar motivos (ver Materiales y métodos).

La longitud exacta de los sitios de restricción (RS) (L) se obtuvo mediante un método de "ensamblaje de semillas" (Materiales y métodos). Luego calculamos las tarifas del sitio de todos L-mers entre lecturas positivas (Materiales y Métodos). Usando este método, para cada una de estas seis endonucleasas de restricción, obtuvimos las tasas de sitio de todas L-mers (L es la longitud predicha de un RS) y dibujó un diagrama de caja para el L-mers con las 50 tasas de sitios más grandes (Fig. 2A). Los motivos (de color naranja en la Fig. 2A) correspondientes a los valores atípicos en el diagrama de caja, con la suma de la frecuencia del sitio de estos valores atípicos (de color verde en la Fig. 2A) & gt80%, se consideraron como los sitios de restricción predichos por DocMF (RS) . Por lo tanto, para Eco RI, Bpu 10I, Edad I, Nme AIII y Mlu I, obtuvimos sus sitios de restricción (RS) a partir de los valores atípicos que se muestran en la Fig.2A, porque las sumas de tasas de sitios de estos valores atípicos eran todas mayores al 80%. . Sin embargo, para Bgl I, la suma de la tasa de sitios de los valores atípicos fue solo del 7,65%, que es demasiado pequeña para predecirse como sitios de restricción (RS) utilizando DocMF. Por lo tanto, para Bgl I, usamos los 11-mers (porque 11 es la longitud predicha del RS) con las 372 tasas de sitios más grandes para predecir los sitios de restricción (RS), la suma de la tasa de sitios de estos 372 motivos fue mayor que 80 % (Figura 2B). Una secuencia (19) La representación (Fig. 2C) de estas 372 secuencias reveló que la RS para Bgl I era GCCNNNNNGGC, que estaba de acuerdo con la RS informada. Estos resultados demostraron que nuestro sistema, junto con un método bioinformático optimizado, podría identificar de manera confiable el sitio de reconocimiento de ADN para diferentes tipos de enzimas de restricción.

(A) Diagramas de caja para los motivos con los 50 primeros registros10(tarifas del sitio). Se muestran las secuencias de ADN de los valores atípicos (naranja) y la suma de las tasas de sitios de los valores atípicos (verde). (B) Tasas de sitio acumuladas para Bgl I. (C) Una representación del logotipo de secuencia de los 372 motivos de Bgl I.

DocMF puede identificar con precisión el 5′-NGG-3 ′ PAM de SpCas9

Los efectores CRISPR-Cas son endonucleasas guiadas por ARN que utilizan un PAM como señal de unión al ADN. El PAM es una secuencia de ADN corta, normalmente de menos de 7 pb, que se encuentra cerca del ADN objetivo (denominado protoespaciador) del sistema CRISPR-Cas (22, 23). Un enfoque de identificación de PAM ampliamente utilizado transforma plásmidos que llevan secuencias PAM aleatorias en E. coli en presencia o ausencia del locus CRISPR-Cas. La frecuencia de una secuencia PAM funcional es significativamente menor cuando la proteína Cas está presente (24Por lo tanto, este ensayo de agotamiento de PAM (24) requiere dos conjuntos de bibliotecas para la identificación de PAM 5 ′ o 3 ′ y los correspondientes controles negativos. El tamaño de la biblioteca también debe ser grande para cubrir la mayoría, si no todas, las secuencias PAM. Además, el ensayo de agotamiento del plásmido (24) es lento y de bajo rendimiento. Por el contrario, el sistema DocMF puede analizar simultáneamente las secuencias 5 'y 3' para PAM en un solo experimento, generando una cobertura que es múltiples órdenes de magnitud mayor que el método tradicional. Una de las dos regiones PAM que no es reconocida por la proteína se usa como control negativo interno.

En un estudio de prueba de concepto, evaluamos la precisión de DocMF evaluando los requisitos de PAM de SpCas9, el sistema CRISPR-Cas más utilizado, de S. pyogenes. SpCas9 escinde el dsDNA después de unirse al ARN correspondiente, y se informa que esta escisión a partir de ensayos de reducción de PAM depende de una secuencia de 5′-NGG-3 ′ PAM (25). La biblioteca PAM DNB utilizada en DocMF se muestra en la Fig. 3A. La región oligo sintética contenía una secuencia protoespaciadora SpCas9 conocida de 23 nt (de color naranja en la Fig. 3A) flanqueada por regiones PAM 5 'y 3' con 15 nucleótidos aleatorios cada una (de color verde en la Fig. 3A). La información de secuencia de ambas regiones PAM se obtuvo mediante una secuenciación de un solo extremo de 50 nt.

(A) Ilustración de preparación de la biblioteca PAM DNB. La región oligo sintética contiene una secuencia protoespaciadora SpCas9 conocida de 25 nt (naranja) flanqueada por regiones PAM 5 'y 3' con 15 nucleótidos aleatorios cada una (verde). Se incorporan cientos de copias de cada protoespaciador flanqueado por PAM aleatorio por DNB, y solo se demuestra una copia. (B) La frecuencia de lectura relativa tanto en el extremo 5 ′ como en el extremo 3 ′ para SpCas9. los X El eje son todas las combinaciones de secuencias de 7 nt ordenadas por la diferencia entre dos extremos en orden descendente. (C) Secuencia PAM para SpCas9.

El cambio de pliegue de señal se comparó antes y después de la incubación en chip de SpCas9 durante 4 horas. De 494,866,059 lecturas (DNB), obtuvimos 366,913 DNB que exhibieron un cambio de veces mayor que 3 y potencialmente podrían ser escindidos por SpCas9. Las secuencias de 7 nt en las regiones PAM 5 'y 3' se recuperaron de estos DNB para su análisis adicional. Se calculó la frecuencia de las 16 384 (4 7) combinaciones de PAM tanto para 5 'como para 3' PAM y se representó gráficamente frente a la secuencia individual en la Fig. 3B. Se informó que la endonucleasa SpCas9 solo se une al extremo 3 'de la secuencia diana. Por lo tanto, se utilizaron secuencias de 7 nt aleatorizadas en 5 'como control negativo interno. Aplicamos la regla de las tres sigma (26) a las secuencias 5 'para definir el límite de las señales PAM positivas. En otras palabras, en el límite de 0,11, aproximadamente el 99,7% de los datos de la región 5 'PAM cayeron en ruido de fondo. Este corte estadístico dio como resultado 944 secuencias de PAM 3 'que fueron preferiblemente cortadas por SpCas9. Un logotipo de secuencia (19) La representación de las secuencias reveló que SpCas9 prefería un motivo 5′-NGG-3 ′, aunque aproximadamente el 5,8% (55 de 944) de 5′-NAG-3 ′ y el 1,6% (15 de 944) de 5′-NGA- 3 ′ también podría reconocerse (Fig. 3C), lo que está en línea con hallazgos previos (2729).

DocMF permite la detección in vitro sensible de PAM en diferentes sistemas CRISPR-Cas

Para demostrar aún más la utilidad de DocMF en la búsqueda de secuencias PAM, ampliamos nuestro estudio a dos sistemas CRISPR-Cas previamente no caracterizados, VeCas9 de Veillonella género y BvCas12 de Butyricimonas virosa (24). VeCas9 tiene una proteína efectora Cas9 de 1064 aminoácidos y la proteína BvCas12 tiene una longitud de 1245 aminoácidos. Ambas proteínas se expresaron y purificaron como se describe en Materiales y métodos complementarios. El crRNA y tracrRNA de VeCas9 se identificaron mediante secuenciación de RNA pequeño, mientras que el crRNA de BvCas12 se predijo in silico basándose en los ortólogos Cas12a / Cpf1 previamente informados (fig. S3). Para interrogar la diversidad de sus secuencias PAM, realizamos DocMF en VeCas9 y BvCas12 utilizando la misma biblioteca DNB PAM (Fig. 3A) utilizada en el estudio SpCas9. Para los experimentos de VeCas9, incluimos tres diseños de gRNA individuales, crRNA: tracrRNA, sgRNA-1 con estructura SpCas9 y un sgRNA-2 truncado (fig. S3).

Antes de usar DocMF, un ensayo de reducción de PAM (24) se realizó por primera vez en VeCas9 para la comparación de metodología (Materiales y métodos complementarios). Como se muestra en la fig. S4 (A y B), con 4,62 Gb de datos de secuenciación, observamos 508 secuencias con un umbral de 3 para Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1 (AacC2c1), un control positivo en el ensayo de depleción, e identificó correctamente el PAM informado, 5′-TTN-3 ′ (24). Sin embargo, con aún más datos de secuenciación (7,33 Gb) para VeCas9, se encontraron 0 y 74 secuencias distintas con umbrales de 3 y 0,8, respectivamente (fig. S4, C y D). Los resultados para VeCas9 fueron bastante similares a nuestros conjuntos de control negativo (datos no mostrados) y, por lo tanto, no pudimos detectar las secuencias PAM correctas para VeCas9 utilizando el método de agotamiento tradicional. El fallo podría atribuirse a una expresión o función débil de la proteína VeCas9 en E. coli células. Además, la baja sensibilidad (

20 × cobertura para cada secuencia PAM de 7 nt) del E. coli El ensayo de agotamiento solo podría agravar los problemas.

Utilizando DocMF, se seleccionaron DNB con cambio de pliegue de señal por encima del umbral para un análisis adicional. En el gráfico de frecuencia de lectura (Fig.4, A y B), la región 5 ′ PAM de VeCas9 (con sgRNA-1) y la región 3 ′ PAM de BvCas12 no mostraron patrón de unión a proteínas, y sus 3 SD correspondientes (0,09 para VeCas9 y 0.075 para BvCas12) se utilizaron para establecer líneas de corte. Como resultado, se determinó que 4947 y 5580 secuencias de PAM únicas estaban escindidas por VeCas9 y BvCas12, respectivamente. Ambos sistemas CRISPR-Cas transmitieron grandes familias de PAM como se ilustra en las secuencias de consenso y el logotipo de secuencia, dos esquemas de informes de PAM comunes (Fig.4, C a E y G) (22, 23). Las secuencias consenso de VeCas9 se revelaron como 5′-NNARRNN-3 ′, o NYARRMY para un conjunto aún más dominante de secuencias PAM por gráfico de frecuencia (Fig. 4C), mientras que el logotipo de secuencia informó secuencias 5′-NNNRR-3 ′ PAM ( Figura 4E). VeCas9 con los otros gRNA mostró un patrón similar (fig. S5). Más del 99% de los PAM con el sgRNA-2 corto se encontraron con al menos uno de los otros dos RNA, lo que indica la alta reproducibilidad de este método DocMF. También se observó una ligera diferencia en PAM de BvCas12 entre los métodos de notificación de PAM. La secuencia de consenso y el logotipo de la secuencia informaron 5′-TYTN-3 ′ (Fig. 4D) o YYN (Fig. 4G), respectivamente. Sin embargo, estos dos sistemas de informes ignoraron la correlación entre las siete posiciones y podrían introducir algunos PAM activos incorrectos si se combinan aleatoriamente cada posición.

(A) La frecuencia de lectura relativa tanto en el extremo 5 ′ como en el extremo 3 ′ para VeCas9. (B) La frecuencia de lectura relativa tanto en el extremo 5 ′ como en el extremo 3 ′ para BvCas12. Secuencia de consenso PAM por gráfico de frecuencia con todas las secuencias de 7 nt detectadas para VeCas9 (C) y BvCas12 (D). Secuencia PAM por logotipo de secuencia para VeCas9 generado por todas las secuencias de 7 nt detectadas (mi) y por las 1000 secuencias principales de 7 nt del análisis FET (F). Secuencia PAM por logotipo de secuencia para BvCas12 generado por todas las secuencias de 7 nt detectadas (GRAMO) y por las 1000 secuencias principales de 7 nt del análisis FET (H). (I) Validación in vitro de secuencias PAM de VeCas9. Se seleccionaron nueve secuencias de 7 nt, cada una por encima o por debajo del límite. Los números de clasificación FET se muestran en rojo. NC, control negativo. (J) Validación in vitro de secuencias PAM de BvCas12. Se seleccionaron cinco secuencias de 7 nt por encima del límite y dos secuencias de 7 nt por debajo del límite.

Para interrogar la actividad relativa de cada PAM, se aplicaron dos métodos, FET y la rueda PAM. Se introdujo FET para clasificar las secuencias PAM. FET es una prueba ampliamente utilizada para determinar si la diferencia entre dos grupos es significativa. Por lo tanto, un PAM en particular con un menor PAG El valor de acuerdo con FET indicó que su frecuencia de lectura relativa, o eficiencia de corte, era más significativa en comparación con una con una mayor PAG valor. Después de clasificar las PAM en orden, examinamos las secuencias de PAM consenso para las 1000 secuencias superiores (Fig. 4, F y H). Se observó una secuencia de consenso de PAM ligeramente distinta, 5′-NNARR-3 ′ para VeCas9 y 5′-TTTN-3 para BvCas12, bajo estos estrictos criterios de selección, que se correlacionaron mejor con los resultados del gráfico de frecuencia (Fig.4, C y D ). Para validar aún más la predicción de FET, se realizó un ensayo de nucleasa in vitro con secuencias de PAM seleccionadas al azar. Los productos de PCR que contienen PAM individuales y un protoespaciador común se incubaron con proteínas Cas9 o Cas12 / Cpf1 a 37 ° C durante 1 hora. Las reacciones con 50 ng de entrada se realizaron en geles de TAE y la cantidad de entrada restante se usó para calcular la eficiencia de escisión. Como se demuestra en la Fig. 4 (G y H), los PAM con números de clasificación FET más altos (en rojo) tenían menos entrada restante, lo que indica una mejor eficiencia de corte. La PAM menos clasificada dio un corte mínimo, cuyo producto casi no era visible en geles de agarosa cuya sensibilidad es varios órdenes de magnitudes más baja que la NGS. La consistencia sugirió que podríamos usar nuestra predicción FET para seleccionar los PAM más activos para la edición de genes in vivo.

También se utilizó una rueda PAM para comprender de manera integral las secuencias PAM y su dependencia de bases. La rueda PAM, derivada de gráficos interactivos de Krona, captura la secuencia PAM individual y su actividad relativa, incluidas las que tienen un bajo enriquecimiento (20). También se puede expandir en cualquier sector de la rueda para ver mejor un subconjunto de secuencias y estudiar la función de esos PAM. La Figura 5 (A y B) muestra las respectivas ruedas PAM para VeCas9 y BvCas12. Para VeCas9, existe una fuerte dependencia de la base entre la posición 3 y 4. Si la posición 3 tenía una base R (A o G), la posición 4 tendía a tener R (& gt80% fig. S6) y un nivel pequeño pero notable de C ( & gt0%). Si la posición 3 es Y (T o C), la posición 4 favoreció solo a R (

99%). T es la base menos favorecida en la posición 4 o 5, lo que concuerda con los resultados de corte in vitro de la Fig. 5C (carriles 9 y 10). El gel también demostró que NYARRMY (el PAM consenso basado en el carril 1 de secuencia de consenso más dominante en la Fig. 4C), NNARRNN (carriles 2 a 4) y ACAAGCC (secuencia clasificada 58 como control positivo carril 11) se cortaron de manera más eficiente que NNCRRNN (carril 5), NNTRRNN (carril 6) o NNGRRNN (carril 7), lo que explica por qué A comprendía el 47% en la posición 3, mientras que las otras tres bases estaban cada una entre el 16 y el 19% (Fig. 5A y Fig. S6 ). Para la rueda PAM BvCas12 que se muestra en la Fig. 5B, encontramos que la posición -4 era aleatoria cuando ambas posiciones -2 y -3 eran Y (T / C). Entonces, PAM YYN generó más productos de corte que YRN en la Fig. 5D (carriles 1 y 2). Sin embargo, la posición −4 tendía a ser T si una de las posiciones −2 o −3 no era Y. Como resultado, observamos un poco más de corte con T que con V en la posición −4, cuando las posiciones −2 y −3 son RY o YR (Fig. 5D carriles 7 a 10). R en la posición -2 también dicta que la posición -3 será Y (100% fig. S6). Como se muestra en la Fig. 5D, el sistema BvCas12 demostró un corte claro en 5′-TTTN-3 ′ o TYTN (Fig. 5D). Nuestros datos sugirieron que tanto VeCas9 como BvCas12 tenían un conjunto de secuencias PAM relajadas que fueron capturadas de manera integral por DocMF.

(A) Rueda PAM para VeCas9. El cuadro amarillo superior da una indicación sobre cada posición de la secuencia PAM y la flecha ilustra la orientación de cada base. El área de un sector del anillo para una base en una posición particular representa su frecuencia en esta posición. (B) Rueda PAM para BvCas12. (C) Validación in vitro de los resultados de la rueda VeCas9 PAM. NYARRMY es la secuencia de consenso basada en la frecuencia posicional, mientras que ACAAGCC es la secuencia clasificada 58º FET incluida como control positivo. (D) Validación in vitro de los resultados de la rueda PAM BvCas12. NNNTTTN o NNNTYTN es la secuencia de consenso basada en la frecuencia posicional, mientras que AATTTTG es la secuencia clasificada 70º FET incluida como control positivo. NC (control negativo): PAM positivas incubadas con la proteína correspondiente pero sin sgRNA.

DocMF puede identificar con precisión los sitios de unión a proteínas

Las interacciones proteína-ADN se han caracterizado en muchas plataformas de alto rendimiento que incluyen microarrays, HT-SELEX y CHAMP (4, 11). Modificamos el flujo de trabajo de DocMF mencionado anteriormente para detectar motivos de unión proteína-ADN. Los pasos permanecieron sin cambios hasta que la hebra complementaria natural se resintetizó para formar dsDNA de 50 pb y se marcó en los extremos con tintes fluorescentes. Después de unir la proteína de interés a sus objetivos de dsDNA y eliminar cualquier exceso, adquirimos las primeras imágenes para registrar la intensidad de la señal. Después de esta primera imagen, se realizó una incubación en chip con tampón de reacción MDA, dNTP y una polimerasa con fuerte desplazamiento de la hebra a 30 ° C durante 30 min para sintetizar una segunda hebra complementaria utilizando el ssDNB como plantilla (fig. S1). En consecuencia, la hebra fluorescente original se reemplazaría y desplazaría de los DNB, lo que provocaría una caída de la señal cuando no hubiera unión de proteínas para prevenir la MDA. Para probar esta idea, utilizamos una proteína bien estudiada, dCas9, y eliminamos su actividad endonucleasa a través de mutaciones puntuales en sus dominios de endonucleasa HNH y RucV (17). Las mutaciones puntuales D10A y H840A cambiaron dos residuos importantes para la actividad endonucleasa, lo que finalmente da como resultado su desactivación. Aunque dCas9 carece de actividad endonucleasa, sigue siendo capaz de unirse a su ARNg y a la cadena de ADN a la que se dirige porque la unión está mediada a través de sus dominios REC1, BH y PI (30). Además, se ha demostrado previamente que dCas9 no se une a su secuencia objetivo cuando no hay PAM (NGG) presente (31). A diferencia de los estudios anteriores, las lecturas con cambio de pliegue de fluorescencia por debajo del umbral se consideraron positivas, lo que indica los DNB que dCas9 podría reconocer y unirse. Además, incluimos un carril de control negativo sin incubación dCas9 en el mismo proceso, ya que BGISEQ-500 tiene dos carriles en un solo chip. Aproximadamente el 95% de un total de 253M lecturas del carril de control negativo perdió la mitad de la intensidad de la señal (datos no mostrados). Elegimos un cambio de señal en 0,5 como umbral (imagen 2 / imagen 1) y recuperamos 14.371.289 de 335.497.075 y 15.647.574 de 337.529.837 lecturas de los carriles experimentales y de control, respectivamente. Introdujimos un concepto de fuerza de unión relativa confiable para evaluar la fuerza de unión para cada secuencia de 7 nt. De manera similar, los datos en el extremo 5 'que se ajustan a una distribución normal se consideraron como ruido de fondo, y se adoptó la regla de los tres sigma para definir el límite en 0,135. Después de deducir los ruidos, observamos que la secuencia de NGG era esencial para la unión de dCas9 (Fig. 6), de acuerdo con hallazgos anteriores. Esto sugiere que con el DocMF modificado, los flujos de trabajo se pueden aprovechar como una herramienta general para identificar motivos de unión al ADN.

(A) La fuerza de unión relativa tanto en el extremo 5 ′ como en el extremo 3 ′ para dCas9. los X El eje son todas las combinaciones de secuencias de 7 nt y se clasifica automáticamente por letra con Excel. (B) El logotipo de secuencia para dCas9 se generó mediante todas las secuencias de 7 nt detectadas basándose en aquellas con la fuerza de unión relativa más alta.


Tinción con azul de metilo en levadura

El procedimiento de tinción con azul de metileno se utiliza para medir la viabilidad de la levadura basándose en la suposición de que el azul de metileno entrará en las células y será degradado por las células de levadura vivas que producen las enzimas que descomponen el azul de metileno, dejando las células incoloras. Las células no viables no producen esta enzima (o enzimas) y, como tal, el azul de metileno que ingresa a las células no se degrada, lo que hace que las células permanezcan coloreadas (la forma oxidada se concentra intracelularmente).

A continuación, se cuentan las células coloreadas e incoloras usando un hemocitómetro y se determina el número de células viables y no viables en un área determinada, el resultado se usaría luego para estimar el número de células en la muestra original.

Este es un método fácil, rápido y económico para determinar la cantidad de levadura viable presente en una muestra, aunque no es el mejor método por varias razones. A major reason is that methylene blue rapidly becomes toxic to the yeast and as such preparations should be examined within 10 minutes of preparation.

The older the cells become, the less likely that they are to take up the methylene blue dye from solution since as the yeast age, they deposit lipid and/or sugar in their cell membrane (in the form of free sterols[predominantly ergosterol and zymosterol with minor portions of lanosterol and fecosterol] and phospholipids[phosphotidylcholine and phosphotidylethanolamine with minor portions of phosphotidylinositol, phosphotidylserine and phosphotidyl-glycerol]) as a survival mechanism to protect their internal mechanisms from the buildup of waste in the external environment.

This means that cells which are not viable would not take up the dye and due to their age and not their ability to break down the methylene blue (as a result of their viability) would remain colourless and be determined to be viable (a false positive). The test itself is also not very accurate since yeast might not be evenly distributed in the original sample and depending on the sample taken for determination , may yield higher or lower viability counts than are really present in the original sample.

This viability count and cell count is absolutely essential since the yeasts are the producers of the ethanol through the breakdown of sugars (catabolism of sugars by glycolysis to pyruvate, which is then converted to CO2 and ethanol) present in the wort/must (the pitching rate is a measure of the number of viable yeast present in a particular stock being used for fermentation). These processes can only be performed by viable yeast cells and consequently the greater the umbers of viable yeasts in the sample, the higher the rate of ethanol production. The expected yield of ethanol (alcohol) can also be calculated based on the number of viable yeast present in a particular stock being used for fermentation (along with the sugar present in the wort). This is very important in industrial alcohol production to determine the required alcohol content of the final product and the viability of the yeast pitched must be greater then 85% or it is not used.


Pioneering technique paves way for fast and cheap fabrication of rapid medical diagnostic tools

Example 100-micron wide 3D-printed microchannel scaffolds, shown next to a 20p coin - the cost to print 1000 of these channels. Credit: University of Bristol

New technology developed by the University of Bristol has the potential to accelerate uptake and development of on-chip diagnostic techniques in parts of the world where rapid diagnoses are desperately needed to improve public health, mortality and morbidity.

Microfluidic devices underpin lab-on-a-chip (LOC) technologies which are developed to provide the rapid diagnoses at that are needed at point of care (POC) for the swift and effective treatment of many diseases.

Researchers at Bristol have developed a fast, reliable and cost-effective alternative for producing the soft-lithographic moulds used for fabricating microfluidic devices, published in the journal PLOS ONE. This discovery means fabrication of microfluidic devices (with channel dimensions

width of a human hair) is now both accessible and affordable using simple, low-cost 3-D-printing techniques and the open-source resources developed by the team.

"Previously, techniques for producing the soft-lithographic scaffolds/moulds (microfluidic channel patterns) were time-consuming and extremely expensive, while other low-cost alternatives were prone to unfavourable properties. This development could put LOC prototyping into the hands of researchers and clinicians who know the challenges best, in particular those in resource-limited settings, where rapid diagnostics may often have the greatest impact," said lead author of the study, Dr. Robert Hughes.

Dye-mixing inside a microfluidic chip made using 3D-printed interconnecting channel scaffolds. Credit: University of Bristol

"This technique is so simple, quick & cheap that devices can be fabricated using only everyday domestic or educational appliances and at a negligible cost (

0.05% of cost of materials for a single microfluidic device). This means researchers and clinicians could use our technique and resources to help fabricate rapid medical diagnostic tools, quickly and cheaply, with minimal additional expertise or resources required," said co-author, Mr Harry Felton.

"The simplicity and minimal cost of this technique, as well as the playful click-and-connect approach developed, also makes it suitable for hobbyists and educational use, to teach about microfluidics and the applications of lab-on-a-chip technology," said co-author Ms Andrea Diaz Gaxiola.

"It is our hope that this will democratise microfluidics and lab-on-a-chip technology, help to advance the development of point-of-care diagnostics, and inspire the next generation of researchers and clinicians in the field," said Dr. Hughes.

Simplified flow-diagram of the low-cost technique for fabricating microfluidic devices. Resulting channels can be applied directly to a glass surface with no additional treatment. Credit: University of Bristol

The next step for the team is to identify potential collaborators in both research and education to help demonstrate the impact this technology could have in both settings by developing and supporting outreach activities and applications for on-chip diagnostic testing.


Science works in strange ways. The experiment, which requires a few basic metal materials and a small digital clock, also calls for an uncooked spud and America's least expensive coin -- the penny. After setting up an electrical circuit with the objects, the potato's natural acidity interacts with the penny's copper to complete one half of this natural "battery's" circuit.

Science fair students, like real scientists, should work to gain consent from people before including them in an experiment.


Afiliaciones

Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Scott Sherrill-Mix, Young Hwang, Aoife M. Roche, Abigail Glascock, Susan R. Weiss, Yize Li, Louis J. Taylor & Frederic D. Bushman

Department of Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Scott Sherrill-Mix, Jevon Graham-Wooten & Ronald G. Collman

Department of Genetics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Leila Haddad, Peter Deraska, Caitlin Monahan, Andrew Kromer & Arupa Ganguly

Department of Emergency Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Department of Biochemistry and Biophysics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA


Be safe and follow some simple rules

  • Never use the same pots and utensils for dyeing that you use for cooking.
  • Wear rubber gloves and use a face mask when measuring mordants and dyes.
  • Work in a well ventilated area.
  • Dispose of used mordants and dye baths safely.

Well there you have it. A simple and practical guide to the use of mordants and fixitives in your natural dyeing products!

Whilst all this talk may seem a little off-putting at first, hopefully you now see how simple and fun the whole affair really is!

But… if you’re still feeling a bit shell shocked, do consider my Natural Dyeing Bootcamp. I cover 4 stunning natural dyeing projects in detail that don’t require mordants or fixatives at all!

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Comentarios:

  1. Eanruig

    Como especialista, puedo prestar ayuda. Juntos podemos llegar a la respuesta correcta.

  2. Brone

    Este maravilloso pensamiento será útil.

  3. Webley

    Pienso, ¿qué es buena idea?

  4. Talkis

    sobornó la sinceridad de la publicación



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